貯存期板栗致病青霉菌的分離鑒定

馮麗娜 溫曉蕾 楊文杰 王俊鳳 張娜娜 齊慧霞

摘要：為明確引起板栗種仁腐爛的青霉菌屬種類及其發(fā)病癥狀。以貯存期板栗種仁腐爛為研究對象，利用組織分離法從貯存期板栗發(fā)病種仁的病健交界處分離純化病原菌，驗(yàn)證其致病性，完成科赫氏法則，并通過形態(tài)特征和分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方法對病原菌進(jìn)行分類鑒定。利用組織分離法獲得10株青霉屬真菌，分離率為25%。分類鑒定顯示：6株為光孢青霉菌（Penicillium glabrum），1株為菌核青霉菌（P. sclerotiorum），2株為草酸青霉菌（P. oxalicum），1株為簡青霉菌（P. simplicissimum）。其中，光孢青霉的數(shù)量最多，占分離青霉菌總數(shù)的60%。致病性鑒定表明，4種青霉菌均可以引起板栗種仁腐爛。青霉菌真菌是引起貯存期板栗種仁腐爛的原因之一，這為貯藏期板栗種仁腐爛的防腐奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：板栗;青霉菌;科赫氏法則;分子生物學(xué)技術(shù);分離鑒定

中圖分類號：S436.64? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2021）18-0164-05

收稿日期：2021-02-07

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號：2020YFD1000702）;河北省板栗產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心（河北省教育廳平臺項(xiàng)目2020年經(jīng)費(fèi)資助）。

作者簡介：馮麗娜（1982—），女，河北撫寧人，碩士，講師，研究方向?yàn)橹参锊±韺W(xué)，E-mail：fenglina82@163.com;溫曉蕾（1982—），女，河北豐潤人，博士研究生，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)橹参锊『Ψ乐?，E-mail：xiaoleiwen@sina.com。

通信作者：齊慧霞，碩士，教授，主要從事植物病害流行與防治研究。E-mail：qihuix@163.com。

中國是板栗之鄉(xiāng)，板栗的年產(chǎn)量居世界首位。河北省唐山市遷西縣、遵化市、興隆縣、青龍縣等冀東地區(qū)的板栗資源豐富，產(chǎn)品質(zhì)量優(yōu)良享譽(yù)海內(nèi)外。然而，近幾年板栗內(nèi)腐?。▌e稱板栗實(shí)腐病）在我國板栗主產(chǎn)區(qū)日益嚴(yán)重。由于通常情況下板栗內(nèi)腐病的栗果外觀（板栗殼）無明顯異常，而在種仁上產(chǎn)生壞死性斑點(diǎn)，甚至腐爛霉變。因此，板栗內(nèi)腐病有很強(qiáng)的隱蔽性，給板栗批發(fā)商和加工企業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失[1]。研究表明，膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、聚生小穴殼菌（Dothiorella gregaria）等寄生性真菌是引起板栗內(nèi)腐病的重要病原菌[2-4]。此外，青霉屬等腐生性真菌也可引起貯藏期板栗種仁腐爛，但由青霉屬真菌引起的板栗內(nèi)腐病的癥狀和種類還不明確[5-6]。本研究以貯存期板栗種仁腐爛為研究對象，利用組織分離法從貯存期板栗發(fā)病種仁的病健交界處分離純化病原菌，采用科赫氏法則驗(yàn)證其致病性，并通過形態(tài)特征和分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方法對病原菌進(jìn)行分離鑒定。從而明確致病性青霉的種類以及病害癥狀，旨在為貯存期該類病害的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及培養(yǎng)基配制

于2018、2019年在河北省唐山市遷西縣板栗主產(chǎn)區(qū)采集板栗果實(shí)，存放于河北科技師范學(xué)院園藝科技學(xué)院冷庫備用。本試驗(yàn)在河北科技師范學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)室完成。試驗(yàn)所用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）、水-瓊脂（WA）培養(yǎng)基和查氏瓊脂培養(yǎng)基按照參考文獻(xiàn)[7-8]的方法進(jìn)行配制。

1.2 病原菌的分離與形態(tài)鑒定

在無菌條件下，選擇具有典型病害癥狀的種仁，在病健交界處取3 mm×3 mm小方塊放于PDA培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)。菌落長出后，挑取疑似青霉菌的菌絲進(jìn)行純化培養(yǎng)、保存[9-10]。分別轉(zhuǎn)接至PDA、WA培養(yǎng)基和查氏瓊脂培養(yǎng)基上，觀察其菌落形態(tài)。

1.3 致病性檢測

按照科赫氏法則進(jìn)行致病性研究：用打孔器取直徑為0.5 cm的分離菌菌餅，將菌餅菌絲面接種于帶傷口的健康遷西早豐板栗種仁上，每種分離菌接種30個(gè)種仁，無菌水作為對照，在28 ℃條件下保濕培養(yǎng)10 d，觀察其致病性。

1.4 病原菌的分離鑒定

按照參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行病原菌形態(tài)特征觀察;利用ITS1/ITS4病原菌ITS序列擴(kuò)增，具體方法參考文獻(xiàn)[7];將擴(kuò)增得到的ITS序列送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測得的ITS序列提交GenBank，并進(jìn)行BLASTn比對[12]。下載同源性高于99%的已知菌株的ITS序列，通過Mega X利用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[13]。通過病原菌形態(tài)特征和分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方法對病原菌進(jìn)行分離鑒定[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 青霉屬真菌的分離情況及形態(tài)特征

利用組織分離法共分離40株致病真菌，根據(jù)菌落和顯微形態(tài)初步確定10株為青霉屬真菌，分離率為25%。根據(jù)形態(tài)特征可分為BLGF25、BLGF28、BLGF21和BLGF4這4種青霉屬真菌。

分離菌株BLGF25在PDA培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)7 d（圖1-1），菌落直徑3.50 cm，質(zhì)地緊密，呈同心輪紋狀排列，菌落中心呈橄欖土褐色，邊緣為白色，菌落背面為黃綠色。在碳源培養(yǎng)基中的形態(tài)學(xué)特征（圖2-1）表現(xiàn)為，菌落在查氏瓊脂培養(yǎng)基上 25 ℃ 條件下恒溫培養(yǎng)8 d，菌落的直徑為4.76 cm，菌落呈放射褶皺狀且呈現(xiàn)同心輪紋狀，菌絲顏色為灰白色、絮狀，菌落背面為淡綠色，生長均勻，不易產(chǎn)生分生孢子。在WA培養(yǎng)基上25 ℃條件下培養(yǎng)6 d觀察其顯微形態(tài)（圖3-1），其菌絲存在隔膜;分生孢子梗著生次生分生孢子小梗或者三生分生孢子小梗，其末端著生橢圓形分生孢子[（2.88～3.32 μm）×（3.25～5.05 μm）]，形狀像掃帚。

分離菌株BLGF28在PDA培養(yǎng)基上30 ℃條件下培養(yǎng)7 d（圖1-2），菌落直徑為2.80 cm，質(zhì)地緊密，菌落中心呈深青色，邊緣為白色，菌落背面呈淡青色。菌落在25 ℃查氏瓊脂培養(yǎng)基上恒溫培養(yǎng)8 d（圖2-2），菌落直徑達(dá)到2.94 cm，為不規(guī)則圓形，中間有不規(guī)則臍狀較薄的突起，菌絲顏色為白色、絮狀，生長不均勻，不易產(chǎn)生分生孢子，背面淡黃色。在 WA培養(yǎng)基上25 ℃條件下恒溫培養(yǎng)6 d進(jìn)行顯微觀察（圖3-2），其菌絲存在隔膜;分生孢子梗著生次生分生孢子小梗，其末端著生橢圓形分生孢子[（2.96～3.22 μm）×（3.24～3.35 μm）]，形狀像掃帚。

分離菌株BLGF4在PDA培養(yǎng)基上30 ℃條件下培養(yǎng)7 d（圖1-3），菌落的直徑為3.80 cm，質(zhì)地較疏松，呈同心輪紋狀，菌落中心呈淺綠色，邊緣為土灰色，背面呈灰綠色。在25 ℃條件下查氏瓊脂培養(yǎng)基上恒溫培養(yǎng)8 d（圖2-3），菌落直徑約為 3.52 cm，質(zhì)地緊密，菌落中心呈青綠色，邊緣為白色，菌落背面呈黃綠色，生長均勻，易產(chǎn)生分生孢子。在 WA培養(yǎng)基上25 ℃條件下恒溫培養(yǎng)6 d進(jìn)行顯微觀察（圖3-3），其菌絲存在隔膜;分生孢子梗著生次生分生孢子小梗，其末端著生橢圓形分生孢子[（2.23～2.89 μm）×（3.02～3.38 μm）]，形狀像掃帚。

分離菌株BLGF21在PDA培養(yǎng)基中的形態(tài)學(xué)特征（圖1-4）表現(xiàn)為，在PDA培養(yǎng)基上30 ℃條件下培養(yǎng)7 d，菌落直徑為2.90 cm，質(zhì)地緊密，菌落中心呈深青色，邊緣為白色，背面呈淡青色，易產(chǎn)生大量分子孢子。在25 ℃條件下查氏瓊脂培養(yǎng)基上恒溫培養(yǎng)8 d（圖2-4），菌落直徑為3.93 cm，菌落質(zhì)地緊密，菌落中心呈深青色，邊緣為白色，背面呈黃綠色。生長均勻，易產(chǎn)生分生孢子。在WA培養(yǎng)基上25 ℃條件下培養(yǎng) 6 d 進(jìn)行顯微觀察（圖3-4），分生孢子梗著生次生分生孢子小?；蛘呷稚咦有」?，其末端著生橢圓形分生孢子[（2.52～3.24 μm）×（3.60～3.98 μm）]，形狀像掃帚。

2.2 青霉屬真菌致病性

利用青霉菌BLGF25、BLGF28、BLGF4、BLGF21分別回接板栗果進(jìn)行致病性鑒定，結(jié)果顯示4種病原菌均可導(dǎo)致種仁腐爛（圖4），再分離后均可以獲得與接種菌形態(tài)特征一致的菌株，表明4種分離菌都對板栗果實(shí)具有致病性。

2.3 病原菌的分類鑒定

提取的4種青霉菌的基因組DNA片段大小約 650 bp（圖5），4種青霉菌基因組DNA條帶片段在1.5%瓊脂糖凝膠上顯示清晰，表明這4種青霉菌的基因組DNA具有較好的完整性和較高的純度。

將擴(kuò)增得到的ITS序列送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序，菌株BLGF25、BLGF28、BLGF4和BLGF21的ITS序列提交GenBank，基因登錄號分別為MN647648、MN646966、MN641484和MN647649。Blantn比對顯示：菌株BLGF25、BLGF28、BLGF4和BLGF21分別與草酸青霉菌（Penicillium oxalicum：MT446169，MT446079）、簡青霉菌（P. simplicissimum： HQ607998，MK387979）、光孢青霉菌（P. glabrum：MN251036，MK910045）和菌核青霉菌（P. sclerotiorum：KY445778，F(xiàn)J884128）的相似度均大于99%。

通過Mega X件利用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6），結(jié)果顯示，菌株BLGF25、BLGF28、BLGF4和BLGF21分別與P. oxalicum、P. simplicissimum、P. glabrum和P. sclerotiorum歸為一枝。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，10株青霉屬致病菌中6株為P. glabrum，1株為P. sclerotiorum，2株為P. oxalicum，1株為P. simplicissimum。

3 討論與結(jié)論

青霉菌是引起貯藏期果實(shí)腐爛常見的腐生性真菌之一，由青霉菌造成的柑橘、檸檬、佛手等柑橘類水果研究報(bào)道較多[7，11，15-16]。相關(guān)研究報(bào)道表明，指狀青霉（P. digitatum）、意大利青霉（P. italicum）和柑橘酸腐菌（Geotrichumcitri aurantii）是柑橘類水果中致病性最強(qiáng)的真菌[17-18]。相關(guān)學(xué)者

研究了引起新疆棗果霉?fàn)€病的幾種青霉菌，包括波蘭青霉（P. polonicum）、短密青霉（P. brevicompactum）、變幻青霉（P. variabile）、產(chǎn)黃青霉（P. chrysogenum）、朱黃青霉（P. minioluteum），其中波蘭青霉分離頻率最高，為優(yōu)勢種[8]。然而，青霉屬真菌引起的板栗果實(shí)腐爛的報(bào)道較少，有研究表明，在板栗貯藏期無癥狀和帶有癥狀的板栗種仁上均可以長出青霉屬真菌（Penicillium spp.），但并未明確致病青霉菌種類[5-6]。以上研究結(jié)果表明，不同類型的植物果實(shí)在貯藏期感染青霉菌的種類也不相同，應(yīng)該有針對性地采取防控措施。本研究利用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對引起貯存期板栗內(nèi)腐病的青霉菌進(jìn)行了分類鑒定。其中，小刺青霉有6株、草酸青霉有2株、菌核青霉有1株和簡青霉有1株。小刺青霉占分離青霉菌總數(shù)的60%，為優(yōu)勢種，研究結(jié)果為防治由青霉屬引起的貯藏期板栗內(nèi)腐病奠定了理論基礎(chǔ)。

青霉屬真菌利用傳統(tǒng)的形態(tài)和生理生化特征方法進(jìn)行分類鑒定存在很多不確定性，科學(xué)家們一直致力于完善適合青霉屬真菌的系統(tǒng)和分類鑒定方法。Karim等根據(jù)青霉菌特有的帚狀枝結(jié)構(gòu)提出青霉分類系統(tǒng)，將青霉分成單輪青霉、對稱二輪青霉、不對稱青霉和多輪青霉4個(gè)組，這種傳統(tǒng)的分類方法得到大多數(shù)分類學(xué)家的認(rèn)可[17]。Samson等將青霉分為無性型和有性型，把少數(shù)具有有性階段的青霉種歸類到子囊菌亞門[18]。Pitt又使用 Czapek Yeast Extract Agar（ CYA）、Malt Extract Agar （MEA）和25% Glycerol Nitrate Agar（ G25N ）3種鑒定青霉的培養(yǎng)基和方法至今在青霉的分類上占有重要的地位[19]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏優(yōu)點(diǎn)的分子標(biāo)記技術(shù)逐漸成為青霉菌分類鑒定的主要手段。目前，將傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法和分子生物學(xué)方法結(jié)合起來進(jìn)行分類鑒定已成為科學(xué)家們通用的方法。本研究利用PDA、WA和碳源培養(yǎng)基觀察其形態(tài)特征，并結(jié)合基于ITS序列的分子生物學(xué)方法對所分離的青霉菌進(jìn)行鑒定，從而確定其分類地位。本研究明確了貯藏期致病性青霉的種類以及病害癥狀，為今后開展板栗貯藏期病害研究提供了依據(jù)。

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