壯藥華佗豆不同極性部位HPLC指紋圖譜的建立及其鎮(zhèn)痛抗炎作用的譜效關(guān)系

林婧 梁潔 黃春燕 韋金玉 黃冬芳 胡玨 祁金麗 陳輝華

中圖分類號 R284.1;R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）17-2079-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.17.06

摘 要 目的：建立壯藥華佗豆不同極性部位的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并研究其與鎮(zhèn)痛抗炎作用的譜效關(guān)系。方法：制備華佗豆總部位及乙酸乙酯、正丁醇、水部位。采用HPLC法進(jìn)行測定并結(jié)合《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012A版）建立不同極性部位的HPLC指紋圖譜，并進(jìn)行共有峰指認(rèn)。以小鼠扭體次數(shù)和耳腫脹度為鎮(zhèn)痛抗炎指標(biāo)，考察華佗豆不同極性部位的鎮(zhèn)痛抗炎活性;采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法、雙關(guān)變量分析法、偏最小二乘法（PLS）分析各極性部位HPLC指紋圖譜中共有峰與鎮(zhèn)痛抗炎指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果：華佗豆不同極性部位共有11個共有峰，指認(rèn)了5個成分，分別為新綠原酸（3號峰）、綠原酸（5號峰）、隱綠原酸（6號峰）、異綠原酸A（10號峰）、異綠原酸C（11號峰）。經(jīng)灰色關(guān)聯(lián)度分析發(fā)現(xiàn)，所有共有峰與鎮(zhèn)痛抗炎作用的關(guān)聯(lián)度均大于0.6（除6號峰與鎮(zhèn)痛作用的關(guān)聯(lián)度外），呈相關(guān)性; 3、7、10號峰與鎮(zhèn)痛抗炎作用的關(guān)聯(lián)度均大于0.8，呈高度相關(guān)性。經(jīng)雙關(guān)變量分析發(fā)現(xiàn)，1、3、4、7、9、10、11號峰與鎮(zhèn)痛抗炎作用的相關(guān)系數(shù)均大于0.6，呈相關(guān)性。經(jīng)PLS分析發(fā)現(xiàn)，1、3、4、7、9、10、11號峰對鎮(zhèn)痛抗炎作用的影響較大。結(jié)論：建立了華佗豆不同極性部位的HPLC指紋圖譜并指認(rèn)了5個共有峰成分;新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C以及1、4、7、9號峰所代表的化學(xué)成分可能是華佗豆發(fā)揮鎮(zhèn)痛抗炎作用的藥效物質(zhì)。

關(guān)鍵詞 華佗豆;鎮(zhèn)痛抗炎;指紋圖譜;譜效關(guān)系

Establishment of HPLC Fingerprint of Different Polar Parts of Zhuang Medicine Calonyction muricatum and Spectrum-effect Relationship of Its Analgesic and Anti-inflammatory Effects

LIN Jing1，2，LIANG Jie1，3，4，HUANG Chunyan5，WEI Jinyu1，HUANG Dongfang1，HU Jue1，QI Jinli1，CHEN Huihua1（1. School of Pharmacy， Guangxi University of TCM， Nanning 530200， China; 2. Dept. of Pharmacy， Guangxi Agricultural Vocational College， Nanning 530007， China; 3.Guangxi Zhuang Yao Medicine Center of Engineering and Technology， Nanning 530200， China; 4. Guangxi Superior Chinese Patent Medicine and Ethnic Medicine Development Engineering Technology Center， Nanning 530200， China; 5. Qinzhou Inspection and Test Institute， Guangxi Qinzhou 535000， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish HPLC fingerprints of different polar parts of Zhuang medicine Calonyction muricatum， and to study its spectrum-effect relationship with analgesic and anti-inflammatory effects. METHODS： The total part， ethyl acetate part， n-butanol part and water part of C. muricatum were prepared. HPLC fingerprints of different polar parts were established by HPLC method combined with the Similarity Evaluation System of TCM Chromatogramtic Fingerprint （2012A）， and the common peaks were identified. Using writhing times and ear swelling degree in mice as analgesic and anti-inflammatory indexes， analgesic and anti-inflammatory activity of different polar parts of C. muricatum were investigated. The correlation of the common peaks of HPLC fingerprint with analgesic and anti-inflammatory indexes was analyzed by grey correlation analysis， bivariate correlation analysis and partial least square （PLS） method. RESULTS： There were 11 common peaks for the different polar parts of C. muricatum， and 5 components were identified by reference comparison， i.e. neochlorogenic acid （peak 3）， chlorogenic acid （peak 5）， cryptochlorogenic acid （peak 6）， isochlorogenic acid A （peak 10）， isochlorogenic acid C （peak 11）. The grey correlation analysis showed that the correlation between all common peaks and analgesic and anti- inflammatory effects were greater than 0.6 （except the correlation between peak 6 and analgesic effects）， showing correlation relationship; the correlation of peaks 3， 7 and 10 with analgesic and anti-inflammatory effects were all greater than 0.8， which was highly related. Bivariate correlation analysis showed that the correlation of peak 1， 3， 4， 7， 9， 10， 11 with analgesic and anti-inflammatory effects were all greater than 0.6， showing correlation relationship. PLS method showed that peaks 1， 3， 4， 7， 9， 10， 11 contributed greatly to playing an analgesic and anti-inflammatory role. CONCLUSIONS： HPLC fingerprints of different polar parts of C. muricatum is established and five common peak components were identified. Neochlorogenic acid， isochlorogenic acid A， isochlorogenic acid C and chemical components represented by peaks 1，4，7， 9 may be the pharmacodynamic substances of C. muricatum to exert analgesic and anti-inflammatory effects.

KEYWORDS? ?Calonyction muricatum; Analgesic and anti-inflammatory; Fingerprint; Spectrum-effect relationship

華佗豆為旋花科植物丁香茄Calonyction muricatum （Linn） G.Don.的種子，壯藥名為跌打豆、丁香茄子，始載于《救荒本草》，分布于廣西、海南等地[1];其性寒、味苦，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抑菌及止血等藥效，是一味具有廣西民族特色的中藥材，民間常用于治療跌打損傷、小兒肺炎[2]。研究表明，華佗豆中含生物堿、黃酮類、酚酸類等化學(xué)成分[3]。經(jīng)本課題組前期藥理研究發(fā)現(xiàn)，華佗豆具有明顯的鎮(zhèn)痛抗炎作用[4]，但哪些成分起到了主要的藥效作用尚不明確。譜效學(xué)的廣泛應(yīng)用，為中藥的藥效物質(zhì)研究提供了有利手段，通過數(shù)理統(tǒng)計模型對指紋圖譜和藥效指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析，可尋找潛在的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[5]。基于此，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）建立華佗豆不同極性部位的指紋圖譜，并考察其鎮(zhèn)痛抗炎作用;同時，采用灰色關(guān)聯(lián)度分析、雙關(guān)變量分析以及偏最小二乘法（PLS）分析，研究華佗豆鎮(zhèn)痛抗炎作用與指紋圖譜共有峰之間的相關(guān)性，以期為進(jìn)一步闡明華佗豆的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的Waters 2695型HPLC儀，包括Waters 2998檢測器、Empower色譜工作站，均購自美國Waters公司;H1650-W型醫(yī)用離心機購自湘儀離心機儀器有限公司;KQ5200B型超聲清洗儀購自昆山超聲儀器有限公司;RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自上海亞榮生化儀器廠;XSR205DU型十萬分之一天平購自瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 主要藥品與試劑

華佗豆采自廣西金秀縣，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院滕建北教授鑒定為旋花科植物丁香茄 C. muricatum （Linn） G. Don.的干燥種子;新綠原酸對照品（ 批號RP190416，純度≥99.48%）、綠原酸對照品（批號RP190505，純度≥99.97%）、隱綠原酸對照品（批號RP200117，純度≥99.71%）、異綠原酸A對照品（批號RP190517，純度≥98.91%）、異綠原酸C對照品（批號RP190609，純度≥98%）均購自成都麥德生科技有限公司;醋酸地塞米松片（批號191030201，規(guī)格0.75 mg）購自辰欣藥業(yè)股份有限公司;羅通定片（批號200201，規(guī)格30 mg）購自四川迪菲特藥業(yè)有限公司;甲醇、乙腈均為色譜純，其他試劑為分析純，水為超純水。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF級昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（湘）2019-0004。小鼠飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)期間均自由攝食、飲水。實驗過程遵守《廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物管理條例》。所有小鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行后續(xù)實驗。

2 方法與結(jié)果

2.1 華佗豆不同極性部位的制備

將華佗豆粉碎，過二號篩，稱取其粉末4 kg，加入7倍量（按L/kg計）的80%乙醇，回流提取3次，每次2 h;過濾，取濾液，經(jīng)減壓濃縮、水浴蒸干后，得總部位浸膏（W1）778.75 g。將總部位浸膏加入適量水溶解后，依次加入乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，將各部位萃取液分別合并，經(jīng)減壓濃縮、水浴蒸干后，得乙酸乙酯部位浸膏（W2）123.48 g、正丁醇部位浸膏（W3）50 g、水部位浸膏（W4）259.07 g，于4 ℃條件下保存。動物實驗時，取不同極性部位浸膏適量，加入2%聚山梨酯80制成混懸液，備用。

2.2 華佗豆不同極性部位的HPLC指紋圖譜建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Aigenlun Eclipse PLus C18 （250 mm×4.6 mm，4.0 μm）;流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～16 min，5%A→10%A;16～25 min，10%A→12%A;25～32 min，12%A→15%A;32～38 min，15%A→20%A;38～65 min，20%A→30%A;65～70 min，30%A→60%A;70～75 min，60%A→90%A;75～95 min，90%A）;流速為0.6 mL/min;柱溫為30 ℃;檢測波長為246 nm;進(jìn)樣量為10 μL。

2.2.2 供試品溶液的制備 取“2.1”項下華佗豆不同極性部位浸膏適量，分別加入80%甲醇超聲（功率200 W，頻率40 kHz）溶解，定容，制成質(zhì)量濃度均為14 mg/mL母液（均以浸膏質(zhì)量計）。取上述母液，以13 000 r/min離心15 min;取上清液，以0.45 μm的微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.2.3 混合對照品溶液的制備 分別精密稱定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C的對照品各適量，置于同一量瓶中，以80%甲醇溶解、定容，制成上述成分質(zhì)量濃度分別為0.035、0.88、0.036、0.08、0.055 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.4 精密度試驗 取“2.1”項下華佗豆總部位浸膏適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次。以5號峰為參照峰（色譜峰峰形較好，下同），計算各共有峰的相對峰面積和相對保留時間。結(jié)果顯示，各共有峰相對峰面積的RSD為0.03%～2.47%，相對保留時間的RSD為0.01%～1.99%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗 取“2.1”項下華佗豆總部位浸膏適量，再按 “2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，按“2.2.1”色譜條件進(jìn)樣測定，以5號峰為參照峰，計算各共有峰的相對峰面積和相對保留時間。結(jié)果，各共有峰的相對峰面積的RSD為0.53%～1.56%，相對保留時間的RSD為0.01%～0.08%（n=6），表明該制備方法重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.1”項下華佗豆總部位浸膏適量，再按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，于室溫下放置0、2、4、8、16、24 h時，再按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。以5號峰為參照峰，計算各共有峰相對峰面積和相對保留時間。結(jié)果顯示，各共有峰相對峰面積的RSD為0.03%～2.88%，相對保留時間的RSD為0.09%～1.45%（n=6），表明該供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 指紋圖譜建立 取華佗豆不同極性部位浸膏適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，見圖1。將上述華佗豆不同極性部位的色譜圖導(dǎo)入到《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012A版）中，以華佗豆總部位的圖譜為參照（其峰形較好、峰面積適中、分離度較好），設(shè)置時間寬度為0.1 s，經(jīng)多點校正后進(jìn)行全峰匹配，得到華佗豆不同極性部位的指紋圖譜，詳見圖2。采用中位數(shù)法生成對照圖譜R，詳見圖3。

由圖2、圖3可知，華佗豆不同極性部位共有11個共有峰。取“2.2.3”項下混合對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，見圖4。通過與圖3進(jìn)行比對，指認(rèn)共有峰中3號峰為新綠原酸、5號峰為綠原酸、6號峰為隱綠原酸、10號峰為異綠原酸A、11號峰為異綠原酸C。

2.3 華佗豆不同極性部位的鎮(zhèn)痛作用考察

將60只小鼠分為空白組、羅通定組（0.03 g/kg）、華佗豆總部位組（25 g/kg，以生藥量計，下同）、華佗豆乙酸乙酯部位組（25 g/kg）、華佗豆正丁醇部位組（25 g/kg）、華佗豆水部位組（25 g/kg），每組10只。上述各給藥劑量均參考本課題組前期實驗結(jié)果設(shè)置[4]。空白組小鼠灌胃水，其余各組小鼠灌胃相應(yīng)藥物，灌胃體積為2 mL/g，每天1次，連續(xù)給藥3 d。末次給藥后1 h，各組小鼠腹腔注射0.7%醋酸溶液，并觀察其20 min內(nèi)的扭體次數(shù)。采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以x±s表示;多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗;檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。結(jié)果顯示，與空白組比較，華佗豆各極性部位組小鼠扭體次數(shù)均顯著減少（P<0.05或P<0.01），詳見表1。

2.4 華佗豆不同極性部位的抗炎作用考察

將60只小鼠分為空白組、醋酸地塞米松組（ 0.006? g/kg）、華佗豆總部位組（25 g/kg，以生藥量計，下同）、華佗豆乙酸乙酯部位組（25 g/kg）、華佗豆正丁醇部位組（25 g/kg）、華佗豆水部位組（25 g/kg），每組10只。上述各給藥劑量均參考本課題組前期實驗結(jié)果設(shè)置[4]。各組小鼠按“2.3”項下方法灌胃給藥或水，連續(xù)給藥7 d。抗炎實驗前小鼠禁食不禁水12 h;末次給藥后45 min，滴二甲苯溶液0.05 mL于小鼠右耳廓致炎;15 min后脫頸椎處死小鼠，沿雙耳對稱的耳根部剪下雙耳，以6 mm 打孔器在兩耳相同位置打下耳片，以分析天平稱耳片質(zhì)量，并計算耳腫脹度（耳腫脹度=右耳片質(zhì)量-左耳片質(zhì)量）。按“2.3”項下統(tǒng)計學(xué)方法處理數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，與空白組比較，華佗豆各極性部位組小鼠耳腫脹度均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表1。

2.5 華佗豆不同極性部位鎮(zhèn)痛抗炎作用的譜效關(guān)系分析

2.5.1 鎮(zhèn)痛抗炎指標(biāo)的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化 將“2.3”“2.4”項下各組小鼠的扭體次數(shù)、耳腫脹度進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化，分別計算鎮(zhèn)痛率[鎮(zhèn)痛率=（空白組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù)）/空白組扭體次數(shù)×100%]和腫脹抑制率[腫脹抑制率=（空白組腫脹度-給藥組腫脹度）/空白組腫脹度×100%]，結(jié)果見表2。

2.5.2 灰色關(guān)聯(lián)度分析 灰色關(guān)聯(lián)度分析是研究因素間發(fā)展趨勢的相似或相異程度、衡量不同因素間關(guān)聯(lián)程度的方法，適用于評價中藥化學(xué)成分與藥效之間的關(guān)聯(lián)程度[6]。本研究以鎮(zhèn)痛率和腫脹抑制率為參考序列，以華佗豆各極性部位HPLC指紋圖譜的共有峰峰面積為比較序列，計算參考序列與比較序列的灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)（即關(guān)聯(lián)度），并對關(guān)聯(lián)度大小進(jìn)行排序。若關(guān)聯(lián)度>0.6，則表明該共有峰與藥效指標(biāo)呈相關(guān)性;若關(guān)聯(lián)度>0.8，則表明該共有峰與藥效指標(biāo)呈高度相關(guān)性[7]。結(jié)果顯示，除了6號峰外，其余10個共有峰與鎮(zhèn)痛作用的關(guān)聯(lián)度均大于0.6，且對鎮(zhèn)痛作用影響大小的排序為3號峰（新綠原酸）>7號峰>10號峰（異綠原酸A）>9號峰>11號峰（異綠原酸C）>1號峰>4號峰>2號峰>8號峰>5號峰（綠原酸）>6號峰。所有共有峰與抗炎作用的關(guān)聯(lián)度均大于0.6，且對抗炎作用影響大小的排序為3號峰（新綠原酸）>10號峰>7號峰>5號峰（綠原酸）>9號峰>11號峰（異綠酸C）>1號峰>4號峰=6號峰>8號峰>2號峰。其中，3號峰（新綠原酸）、7號峰、10號峰（異綠原酸A）與鎮(zhèn)痛抗炎作用的關(guān)聯(lián)度均大于0.8，呈高度相關(guān)性，詳見表3。

2.5.3 雙變量相關(guān)分析 雙變量相關(guān)分析可以描述兩變量間的相關(guān)性，所得相關(guān)系數(shù)的大小可反映兩變量相關(guān)性的大?。喝粝嚓P(guān)系數(shù)絕對值|r|≥0.8，則表明兩變量呈顯著相關(guān)性;若|r|≥0.6，則表明兩變量呈相關(guān)性;且|r|越接近1，則表明兩變量相關(guān)性越強[8-9]。本研究以華佗豆各極性部位HPLC指紋圖譜的共有峰峰面積為自變量，以鎮(zhèn)痛率和腫脹抑制率為因變量，采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行雙變量相關(guān)分析，得到華佗豆不同極性部位共有峰與藥效指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)，詳見表4。

由表4可知，1、3（新綠原酸）、4、7、9、10、11（異綠原酸C）號峰與鎮(zhèn)痛抗炎的|r|均大于0.6，表明這些共有峰與鎮(zhèn)痛抗炎相關(guān)，可能是鎮(zhèn)痛抗炎的藥效物質(zhì)。

2.5.4 PLS分析 在PLS分析中，回歸系數(shù)的絕對值可反映共有峰對藥效指標(biāo)的貢獻(xiàn)程度，其數(shù)值越大，則貢獻(xiàn)越大; 變量投影重要性（VIP）值表示自變量對因變量的重要程度，當(dāng) VIP>1 時，則表明自變量對因變量是重要的[10]。本研究以華佗豆不同極性部位HPLC指紋圖譜的共有峰峰面積為自變量，以鎮(zhèn)痛率和腫脹抑制率為因變量，采用SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行PLS模型擬合，得到回歸系數(shù)和VIP值，詳見圖5、圖6。

由圖5、圖6可知，除了2、5、6、8號共有峰外，其余各共有峰（1、3、4、7、9、10、11號峰）的回歸系數(shù)的絕對值均較大，且其VIP值均大于1，表明這7個共有峰對鎮(zhèn)痛抗炎作用均有顯著影響。該分析結(jié)果與雙變量相關(guān)分析結(jié)果一致。

3 討論

中藥化學(xué)成分是一個復(fù)雜的體系，并非所有成分在疾病治療中，都能發(fā)揮同樣重要的功效，故需應(yīng)用一種可量化的方法進(jìn)行研究，以便明確在藥效學(xué)中貢獻(xiàn)較多的成分[11]。本研究采用HPLC法建立華佗豆不同極性部位的指紋圖譜，共獲得11個共有峰，并指認(rèn)3號峰為新綠原酸、5號峰為綠原酸、6號峰為隱綠原酸、10號峰為異綠原酸A、11號峰為異綠原酸C;同時，采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法、雙關(guān)變量分析法以及PLS分析了華佗豆不同極性部位HPLC指紋圖譜與鎮(zhèn)痛抗炎作用的相關(guān)性。結(jié)果顯示，經(jīng)灰色關(guān)聯(lián)度分析法分析發(fā)現(xiàn)，所有共有峰與鎮(zhèn)痛抗炎作用的關(guān)聯(lián)度均大于0.6（除6號峰與鎮(zhèn)痛作用的關(guān)聯(lián)度外），呈相關(guān)性; 3、7、10號峰與鎮(zhèn)痛抗炎作用的關(guān)聯(lián)度均大于0.8，呈高度相關(guān)性。經(jīng)雙關(guān)變量分析發(fā)現(xiàn)，1、3、4、7、9、10、11號峰與鎮(zhèn)痛抗炎作用的相關(guān)系數(shù)均大于0.6，呈相關(guān)性。經(jīng)PLS分析發(fā)現(xiàn)，1、3、4、7、9、10、11號峰對鎮(zhèn)痛抗炎作用的影響較大。由此可知，1、3、4、7、9、10、11號峰可能是華佗豆發(fā)揮鎮(zhèn)痛抗炎作用的藥效物質(zhì)，且這些峰主要在華佗豆的總部位、正丁醇部位和乙酸乙酯部位中富集，這與本課題組前期相關(guān)研究結(jié)果基本一致[4]。另外，目前已有相關(guān)研究報道，3、10、11號峰所對應(yīng)的化學(xué)成分（新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C）具有抗炎作用[12]。故筆者推測，華佗豆的藥效物質(zhì)成分可能是其中等極性成分，且其發(fā)揮鎮(zhèn)痛抗炎作用可能是其多種成分相互協(xié)同作用的結(jié)果。

綜上所述，本研究建立了華佗豆不同極性部位的HPLC指紋圖譜并指認(rèn)了5個共有峰成分;新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C以及1、4、7、9號峰所代表的化學(xué)成分可能是華佗豆發(fā)揮鎮(zhèn)痛抗炎作用的藥效物質(zhì)。

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（收稿日期：2021-04-07 修回日期：2021-06-10）

（編輯：唐曉蓮）