基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討熊果酸治療骨質(zhì)疏松的分子機(jī)制

趙俊 孫加琳 劉洪玲 劉廣偉 李祥鵬 倉懷芹 梁瑜 張傳洲 韓冰 隋忠國

中圖分類號(hào) R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）17-2066-08

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.17.04

摘 要 目的：探討熊果酸治療骨質(zhì)疏松癥（OP）的潛在分子機(jī)制。方法：運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)數(shù)據(jù)庫、PubMed數(shù)據(jù)庫、UniProt數(shù)據(jù)庫篩選單體化合物熊果酸的作用靶點(diǎn)基因，借助GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索OP相關(guān)靶點(diǎn)基因，并運(yùn)用Venny 2.1在線作圖工具獲取成分-疾病的共有靶點(diǎn)基因;運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建成分-疾病共有靶點(diǎn)基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系（PPI）網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，篩選度值大于平均度值的核心靶點(diǎn)基因;使用DAVID數(shù)據(jù)庫對成分-疾病共有靶點(diǎn)基因進(jìn)行基因本體（GO）功能注釋和KEGG通路富集分析。以核心靶點(diǎn)基因編碼蛋白為受體、熊果酸為配體，采用AutoDock Vina 1.1.2軟件進(jìn)行分子對接。結(jié)果：共挖掘出熊果酸相關(guān)靶點(diǎn)基因55個(gè)、OP相關(guān)靶點(diǎn)基因4 273個(gè)，兩者共有靶點(diǎn)基因44個(gè)。上述共有靶點(diǎn)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)共包含節(jié)點(diǎn)44個(gè)、邊513條，平均節(jié)點(diǎn)度值為23.3;核心靶點(diǎn)基因共24個(gè)，包括VEGFA、TP53、IL6、CASP3等。共富集到GO功能條目340個(gè)（校正后P值小于0.05），其中生物過程263個(gè)（涉及凋亡過程的負(fù)調(diào)控等）、分子功能25個(gè)（涉及蛋白質(zhì)結(jié)合等）、細(xì)胞組分52個(gè)（涉及胞質(zhì)溶膠等）;共富集到KEGG信號(hào)通路90條（校正后P值小于0.05），如癌癥通路、乙型肝炎、腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號(hào)通路等。熊果酸與TP53等6個(gè)核心靶點(diǎn)基因編碼蛋白的結(jié)合能均低于-5 kcal/mol，有較強(qiáng)的結(jié)合活性。結(jié)論：熊果酸對OP的治療作用可能是通過調(diào)控VEGFA、TP53、IL6、CASP3、JUN等核心靶點(diǎn)基因，作用于癌癥通路、乙型肝炎、TNF信號(hào)通路等多條關(guān)鍵通路而實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞 熊果酸;骨質(zhì)疏松癥;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對接;分子機(jī)制

Molecular Mechanism of Ursolic Acid in the Treatment of Osteoporosis Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

ZHAO Jun，SUN Jialin，LIU Hongling，LIU Guangwei，LI Xiangpeng，CANG Huaiqin，LIANG Yu，ZHANG Chuanzhou，HAN Bing，SUI Zhongguo（Dept. of Pharmacy， the Affiliated Hospital of Qingdao University， Shandong Qingdao 266003， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To explore the potential molecular mechanism of ursolic acid in the treatment of osteoporosis （OP）. METHODS： TCMSP， PubMed database and UniProt database were used to screen potential targets of monomer compound ursolic acid. OP related target genes were searched with GeneCards database. The common target genes of component-disease were obtained by Venny 2.1 online mapping tool. The protein-protein interaction （PPI） network of component-disease common target genes was constructed by using STRING database， and topological analysis was carried out; the core target genes， whose degree value was greater than the average degree value， were screened. GO functional annotation and KEGG pathway enrichment analysis of component-disease common target genes were carried out by DAVID database. AutoDock Vina 1.1.2 software was used for molecular docking， using protein encoded by the core target gene as receptor and ursolic acid as ligand. RESULTS： A total of 55 ursolic acid related target genes and 4 273 OP related target genes were excavated， with a total of 44 common target genes. PPI network with above common target genes included 44 nodes and 513 edges， with an average node degree of 23.3. There were 24 core target genes， including VEGFA， TP53， IL6， CASP3. There were 340 GO functional items were enriched （corrected P<0.05）， including 263 biological processes （negative regulation of apoptosis， etc.）， 25 molecular functions （protein binding， etc.） and 52 cell components （cytosol， etc.）. There were 90 KEGG signaling pathways （corrected P<0.05）， such as tumor pathway， hepatitis B pathway， TNF signaling pathway， viral carcinogenesis and phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B （PI3K-Akt） signaling pathway. The binding energy between ursolic acid and 6 proteins encoded by core target genes such as TP53 was lower than -5 kcal/mol， which had strong binding activity. CONCLUSIONS： The therapeutic effect of ursolic acid on OP may be achieved by regulating VEGFA， TP53， IL6， CASP3， JUN and other core target genes and acting on multiple key pathways such as cancer pathway， hepatitis B and TNF signaling pathway.

KEYWORDS? ?Ursolic acid; Osteoporosis; Network pharmacology; Molecular docking; Molecular mechanism

隨著人口增長及老齡化的加劇，骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）的發(fā)病率也逐年上升，已成為我國主要的公共衛(wèi)生問題[1]。并且，該癥還有誘發(fā)其他疾病的可能，給患者家庭和社會(huì)均造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。老年人是OP的主要患病人群，目前臨床上治療OP的藥物大多以調(diào)節(jié)骨代謝的化學(xué)藥為主，但其可引起腎損傷等一系列不良反應(yīng)，使得其臨床應(yīng)用受限[3]。OP在祖國醫(yī)學(xué)中屬于“骨痿”范疇，《素問》中載“腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿”，中醫(yī)治療以補(bǔ)腎益精、活血祛瘀為基本原則[4]。但中醫(yī)藥治療OP的相關(guān)分子機(jī)制并未完全闡明，這制約了相關(guān)中醫(yī)藥理論向臨床實(shí)踐的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化。

熊果酸（ursolic acid）具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等多種功效，在自然界分布廣泛，同時(shí)因其價(jià)格低廉、療效穩(wěn)定且不良反應(yīng)少而備受關(guān)注[5]。相關(guān)研究表明，熊果酸具有明顯改善腎損傷的作用[6]。而祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎虛是OP的主要病機(jī)，且中醫(yī)主張OP治療應(yīng)與腎功能保護(hù)進(jìn)程并行[7]。因此，根據(jù)中醫(yī)“補(bǔ)腎壯骨”理論，熊果酸可能具有潛在的OP改善作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是利用計(jì)算機(jī)科學(xué)、分子生物學(xué)、藥學(xué)等學(xué)科的成果，對傳統(tǒng)中藥成分的潛在靶點(diǎn)、藥理作用進(jìn)行多基因、多靶點(diǎn)、多途徑的系統(tǒng)研究，可為中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究提供新的思路[8]。分子對接則是通過受體與藥物分子之間的相互作用方式來預(yù)測其結(jié)合模式和親和力的一種理論模擬方法[9]。本研究擬利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接技術(shù)，初步探討熊果酸治療OP的潛在作用靶點(diǎn)及通路，以期為進(jìn)一步闡明熊果酸治療OP的分子機(jī)制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 熊果酸作用靶點(diǎn)基因的提取

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)數(shù)據(jù)庫（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索熊果酸的潛在作用靶點(diǎn)蛋白，并在PubMed數(shù)據(jù)庫（https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）中進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對。通過UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）將上述靶點(diǎn)對應(yīng)的蛋白轉(zhuǎn)換成種屬為人的基因，構(gòu)建熊果酸單體化合物及其作用靶點(diǎn)基因的數(shù)據(jù)庫。

1.2 OP相關(guān)靶點(diǎn)基因的篩選

以“osteoporosis”為關(guān)鍵詞，在Gene Cards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）中進(jìn)行人類基因檢索，以獲取OP的疾病靶點(diǎn)基因;同時(shí)，在該數(shù)據(jù)庫中以相關(guān)性分?jǐn)?shù)（relevance score）的中位值進(jìn)行篩選，以期獲得更多的疾病相關(guān)靶點(diǎn)基因。

1.3 成分-疾病共有靶點(diǎn)基因的篩選

將“1.1”“1.2”項(xiàng)下篩選出的兩組靶點(diǎn)分別輸入Venny 2.1在線作圖工具（https：// bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）以繪制韋恩圖，得到成分-疾病的共有靶點(diǎn)基因。

1.4 共有靶點(diǎn)基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及拓?fù)鋵W(xué)分析

將成分-疾病的共有靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/cgi/input.pl），設(shè)定生物種類為“homo sapiens（智人）”，構(gòu)建共有靶點(diǎn)基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并將構(gòu)建結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件中進(jìn)行可視化展示?？梢暬W(wǎng)絡(luò)圖中，以節(jié)點(diǎn)表示共有靶點(diǎn)基因，其顏色越深、形狀越大表示對應(yīng)靶點(diǎn)基因的度值（degree）越大，即此靶點(diǎn)基因越重要;以邊表示共有靶點(diǎn)基因之間的關(guān)聯(lián)，其線條越粗表示靶點(diǎn)基因間的結(jié)合分?jǐn)?shù)（combine score）越大，即靶點(diǎn)基因與靶點(diǎn)基因之間的相關(guān)性越顯著[10]。

借助Cystoscape 3.8.0軟件中的“network analyzer”工具對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析。以度值、介數(shù)中心性（betweenness centrality）、接近中心性（closeness centrality）等3個(gè)參數(shù)的中位值為參考指標(biāo)。其中，介數(shù)中心性代表經(jīng)過某一節(jié)點(diǎn)的最短路徑的數(shù)量，介數(shù)中心性越大，該節(jié)點(diǎn)影響力越大[11];接近中心性代表節(jié)點(diǎn)與網(wǎng)絡(luò)中其他節(jié)點(diǎn)的平均距離，接近中心性越大的節(jié)點(diǎn)其信息流動(dòng)性越佳[12];選取度值大于平均度值的靶點(diǎn)基因作為核心靶點(diǎn)基因[13]，并選取度值、介數(shù)中心性、接近中心性均排名前10位的核心靶點(diǎn)基因的拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果進(jìn)行展示。

1.5 基因本體功能注釋及KEGG通路富集分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對成分-疾病的共有靶點(diǎn)基因進(jìn)行基因本體（GO）功能注釋和KEGG通路富集分析。其中，GO功能注釋分析涉及生物過程（BP）、分子功能（MF）、細(xì)胞組分（CC）等功能。設(shè)置物種為“homo sapiens（智人）”、標(biāo)識(shí)符（identifier）為“official gene symbol（官方名稱）”，保留校正后P值小于0.05的條目，并按照校正后P值從小到大進(jìn)行排序。選擇排名前20位的條目導(dǎo)入RStudio 3.6.3軟件中，實(shí)現(xiàn)富集結(jié)果的可視化。

1.6 成分-核心靶點(diǎn)基因編碼蛋白的分子對接實(shí)驗(yàn)

從PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）下載核心靶點(diǎn)基因編碼蛋白的三維（3D）結(jié)構(gòu)，保存為“PDB”格式，作為蛋白受體。使用AutoDock Tools 1.5.6軟件對蛋白受體進(jìn)行去除水分子、分離蛋白質(zhì)、添加非極性氫等處理，并計(jì)算其結(jié)構(gòu)的Gasteiger電荷以確保原子遵循AutoDock中的原子類型，然后將其保存為“pdbqt”格式文件。從PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載熊果酸的二維（2D）結(jié)構(gòu)，保存為“mol2”格式，使用AutoDock Tools 1.5.6軟件進(jìn)行加氫、加電荷、檢測配體分子的中心節(jié)點(diǎn)以及進(jìn)行可旋轉(zhuǎn)鍵的搜尋與定義后，保存為“pdbqt”格式文件，作為配體。將受體設(shè)置為剛性，配體設(shè)置為柔性，采用AutoDock Vina 1.1.2軟件對核心靶點(diǎn)基因編碼蛋白受體和熊果酸配體進(jìn)行分子對接。通過結(jié)合能來評估配體和受體的結(jié)合能力，結(jié)合能小于0則表示配體與受體能夠自發(fā)結(jié)合，且其值越小表示兩者的結(jié)合活性越高[14]。采用PyMOL 2.3軟件進(jìn)行對接結(jié)果的可視化展示（本文僅對結(jié)合能從小到大排名前6位的化合物的對接結(jié)果進(jìn)行可視化展示）。

2 結(jié)果

2.1 熊果酸與OP相關(guān)靶點(diǎn)基因的篩選結(jié)果

經(jīng)檢索及匯總刪重后，共獲得熊果酸相關(guān)靶點(diǎn)基因55個(gè);在GeneCards數(shù)據(jù)庫中共檢索到OP相關(guān)靶點(diǎn)基因4 273個(gè)。將上述靶點(diǎn)基因輸入Venny 2.1軟件中，共得到成分-疾病的共有靶點(diǎn)基因44個(gè)，詳見圖1。

2.2 共有靶點(diǎn)基因PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)基因篩選結(jié)果

成分-疾病共有靶點(diǎn)基因的PPI可視化網(wǎng)絡(luò)見圖2。由圖2可見，該網(wǎng)絡(luò)中共有節(jié)點(diǎn)44個(gè)、邊513條，平均節(jié)點(diǎn)度值為23.3。網(wǎng)絡(luò)中未出現(xiàn)孤立節(jié)點(diǎn)，且各節(jié)點(diǎn)之間連通性良好，表明熊果酸可通過多靶點(diǎn)的協(xié)同調(diào)控發(fā)揮其治療OP的作用。

網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果顯示，該網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)度值大于平均度值（23.318）的核心靶點(diǎn)基因共有24個(gè)，度值、介數(shù)中心性、接近中心性同時(shí)排名前10位的核心靶點(diǎn)基因分別為VEGFA、TP53、IL6、CASP3、JUN、MMP9、STAT3、TNF、MAPK8和PTGS2，其拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果見表1。

2.3 GO功能富集分析結(jié)果

按校正后P值小于0.05的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，共富集到GO功能條目340個(gè)，BP、MF、CC分別有263、25、52個(gè)。其中，BP主要涉及凋亡過程的負(fù)調(diào)控（15個(gè)）、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控（13個(gè)）、凋亡進(jìn)程（13個(gè)）、細(xì)胞增殖的正調(diào)控（13個(gè)）、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控（13個(gè)）、藥物反應(yīng)（12個(gè)）等;CC主要涉及胞質(zhì)溶膠（30個(gè)）、細(xì)胞核（29個(gè)）、細(xì)胞質(zhì)（28個(gè)）、質(zhì)膜（20個(gè)）等;MF主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合（47個(gè)）、相同蛋白質(zhì)結(jié)合（13個(gè)）、蛋白激酶結(jié)合（11個(gè)）、蛋白質(zhì)異二聚化活性（11個(gè)）、蛋白質(zhì)同二聚化活性（11個(gè)）等。GO功能富集分析的氣泡圖（校正后P值排名前20位）見圖3。

2.4 KEGG通路富集分析結(jié)果

按校正后P值小于0.05的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，共富集到KEGG信號(hào)通路90條。校正后P值排名前20位的條目的可視化展示結(jié)果見圖4，其具體信息見表2。由圖4、表2可知，熊果酸治療OP的潛在靶點(diǎn)包括癌癥通路、乙型肝炎、腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號(hào)通路、人類嗜T淋巴細(xì)胞白血病病毒Ⅰ型（HTLV-Ⅰ）感染等多條通路。

2.5 成分-核心靶點(diǎn)基因編碼蛋白的分子對接結(jié)果

熊果酸與核心靶點(diǎn)基因CASP3、IL6、MAPK8、JUN、TP53、VEGFA編碼蛋白的結(jié)合能分別為-5.20、-5.43、? ?-6.68、-5.80、-6.89、-5.36 kcal/mol（1 kcal=4.186 kJ），均低于-5 kacl/mol，這提示熊果酸與核心靶點(diǎn)基因編碼蛋白之間有較強(qiáng)的結(jié)合活性[15]。以熊果酸與TP53基因編碼蛋白（p53）的結(jié)合為例，兩者的結(jié)合能為-6.89 kcal/mol，熊果酸與p53的氨基酸殘基GLY-1683可通過氫鍵連接（作用距離為2.5 ?），可得到較為穩(wěn)定的復(fù)合物。熊果酸與核心靶點(diǎn)基因編碼蛋白的分子對接結(jié)果（結(jié)合能排名前6位）見圖5。

3 討論

OP是一種全身性骨疾病，其特征是患者骨量逐漸減少、骨質(zhì)脆弱、骨折易發(fā)[16]。據(jù)首個(gè)中國OP流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示：OP已成為我國中老年人群的重要健康問題，50歲以上人群的OP患病率為19.2%;且在中老年女性中尤為嚴(yán)重，65歲以上女性的OP患病率更是達(dá)到了51.6%，嚴(yán)重影響了老年人群的生活質(zhì)量[17-18]。因此，OP的相關(guān)研究受到越來越多學(xué)者的關(guān)注。

目前臨床針對OP的藥物治療仍以化學(xué)藥為主，包括雌激素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、雙膦酸鹽類、降鈣素和骨形成促進(jìn)劑等[19]。臨床數(shù)據(jù)顯示，化學(xué)藥的大量使用除了會(huì)造成一定程度的腎損傷外，還存在誘發(fā)乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌等嚴(yán)重副作用，從而制約了其臨床應(yīng)用[19]。我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥在多種疾病的治療中均具有顯著的效果，且副作用小，特別適合于治療腎臟代謝功能衰退的老年性疾病[20]。因此，傳統(tǒng)中藥在防治腎損傷、改善OP方面具有廣闊的潛力和應(yīng)用前景。

熊果酸屬于烏蘇烷型五環(huán)三萜類化合物，存在于熊果、女貞子、野薔薇果、白花蛇舌草、車前草等自然界廣泛分布的天然藥物中，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等多種功效，并且已有多年的應(yīng)用歷史[21]。相對于目前化學(xué)藥治療OP致腎損傷等一系列不良反應(yīng)，熊果酸對腎損傷具有明顯的改善作用[6]。中醫(yī)認(rèn)為，腎藏精，精生髓，髓居于骨腔中以滋養(yǎng)骨骼，當(dāng)腎精虧虛時(shí)，則骨枯髓減，故腎臟在骨骼的生長和發(fā)育中起到至關(guān)重要的作用[22]。由以上研究結(jié)果和中醫(yī)理論可見，熊果酸具有潛在的治療OP作用。

本研究共挖掘出熊果酸相關(guān)靶點(diǎn)基因55個(gè)，OP相關(guān)靶點(diǎn)基因4 273個(gè);經(jīng)韋恩圖分析，獲得成分-疾病的共有靶點(diǎn)基因44個(gè)。上述共有靶點(diǎn)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)顯示，靶點(diǎn)基因之間相互聯(lián)系、共同作用;網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果顯示，熊果酸治療OP的核心靶點(diǎn)基因主要包括VEGFA、TP53、IL6、CASP3、JUN、MMP9、STAT3、TNF、MAPK8、PTGS2等。

OP的發(fā)生發(fā)展與多種炎性細(xì)胞因子關(guān)系密切。有研究指出，白細(xì)胞介素6（IL-6）、TNF-α被證實(shí)為參與骨吸收的重要炎性細(xì)胞因子，可促進(jìn)骨吸收并加重患者的病情發(fā)展[23-24]。其中，IL-6是一種多效應(yīng)性炎性細(xì)胞因子，可參與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、造血調(diào)節(jié)和腫瘤發(fā)生等多個(gè)過程[25]。研究表明，IL-6能通過多種信號(hào)通路調(diào)控成骨細(xì)胞的凋亡與分化，促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成，從而促進(jìn)骨吸收，最終導(dǎo)致OP的發(fā)生[26]。此外，IL-6還能夠誘導(dǎo)激活Janus激酶（JAK）家族的3個(gè)成員[信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、MAPK和PI3K]，而這3個(gè)因子均與OP的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[27-29]。TNF-α既可以通過誘導(dǎo)成骨細(xì)胞表達(dá)核因子κB（NF-κB）受體活化因子配體（RANKL）表達(dá)，也可以直接作用于RANKL來誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的形成和促進(jìn)骨吸收[30]。劉雁飛等[31]研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸可顯著降低慢性非細(xì)菌性前列腺炎模型大鼠血液中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的水平。以上內(nèi)容提示，IL-6、TNF-α是熊果酸治療OP的潛在靶點(diǎn)。

MAPK8屬于MAPK家族成員，在調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)中具有重要作用。一方面，MAPK對于破骨細(xì)胞的形成和活化具有重要作用，并且能夠通過介導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路來影響OP的發(fā)展[32];另一方面，活化的MAPK可促進(jìn)成骨細(xì)胞的生成，從而發(fā)揮其改善OP癥狀的作用[33]。前列腺素可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）和RANKL表達(dá)，還可促進(jìn)破骨細(xì)胞分化并抑制骨細(xì)胞功能[34]。前列腺素內(nèi)過氧化物酶2（PTGS2）為前列腺素生成的限速酶，對前列腺素的上述活性有一定的抑制作用[35]。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）兼具支持血管生成和促進(jìn)成骨細(xì)胞功能的作用，可部分通過自分泌、內(nèi)分泌機(jī)制以及旁分泌機(jī)制來調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的功能，促進(jìn)骨形成及減少骨吸收[36]。胱天蛋白酶（caspase）家族是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵因子，其中caspase3（CASP3基因表達(dá)產(chǎn)物）是該家族中最關(guān)鍵的凋亡效應(yīng)因子之一，被認(rèn)為是凋亡的執(zhí)行者，一旦caspase3被激活，細(xì)胞凋亡將不可被逆轉(zhuǎn)[37]。

本研究通過對共有靶點(diǎn)的GO功能注釋分析發(fā)現(xiàn)，GO生物過程主要集中在凋亡進(jìn)程、細(xì)胞增殖調(diào)控、藥物反應(yīng)等。通過對共有靶點(diǎn)基因的KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，其主要富集在腫瘤通路、TNF信號(hào)通路、乙型肝炎、PI3K/Akt信號(hào)通路、人類HTLV-Ⅰ感染等多條通路。其中，PI3K/Akt信號(hào)通路與骨組織代謝關(guān)系密切[38]。激活PI3K/Akt信號(hào)通路可刺激成骨細(xì)胞的增殖和分化，同時(shí)抑制其凋亡;另外，PI3K可刺激破骨細(xì)胞肌動(dòng)蛋白絲的形成，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞趨化、附著和擴(kuò)散等功能，抑制PI3K表達(dá)可減少成熟破骨細(xì)胞的骨吸收[39]。多項(xiàng)研究證實(shí)，熊果酸可抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而導(dǎo)致其下游促凋亡蛋白表達(dá)上調(diào)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路活化，最終促進(jìn)細(xì)胞凋亡[40-41]。相關(guān)研究證實(shí)，慢性乙型肝炎病毒感染與OP之間關(guān)系密切，其作用機(jī)制可能與該病毒感染后會(huì)引起慢性炎癥有關(guān)[42]。乙型肝炎病毒感染可誘導(dǎo)TNF-α、IL-1、IL-6等炎性細(xì)胞因子分泌，可增加RANKL表達(dá)而刺激骨吸收[43]。上述炎性細(xì)胞因子的綜合作用是慢性乙型肝炎病毒感染致OP的主要原因，其可導(dǎo)致骨形成減少和骨吸收增加，從而降低骨礦物質(zhì)密度[44]。另外，乙型肝炎病毒感染會(huì)抑制肝內(nèi)25-羥維生素D的生成以及維生素D的攝取，從而增加骨丟失并減少骨形成[45]。長期乙型肝炎病毒感染導(dǎo)致的肝臟失代償會(huì)通過抑制纖維細(xì)胞生長來影響骨基質(zhì)的膠原合成，同時(shí)可通過增加癌胚纖維連接蛋白的表達(dá)來共同抑制成骨細(xì)胞的功能[46]。本研究采用分子對接技術(shù)分別將熊果酸與核心靶點(diǎn)基因CASP3、IL6、MAPK8、JUN、TP53、VEGFA的編碼蛋白進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。結(jié)果顯示，熊果酸與上述核心靶點(diǎn)基因編碼蛋白均有較強(qiáng)的對接活性（結(jié)合能均小于-5.0 kcal/mol），這進(jìn)一步說明了熊果酸可與核心靶點(diǎn)基因編碼蛋白受體穩(wěn)定結(jié)合并發(fā)揮其治療OP的作用。該結(jié)果初步驗(yàn)證了上述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果的可靠性，可為后續(xù)熊果酸治療OP的作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，熊果酸對OP的治療作用可能是通過調(diào)控VEGFA、TP53、IL6、CASP3、JUN、MMP9、STAT3、TNF、MAPK8、PTGS2等核心靶點(diǎn)基因，作用于腫瘤通路、乙型肝炎、TNF信號(hào)通路等多條關(guān)鍵通路而實(shí)現(xiàn)的。其作用機(jī)制涉及了多個(gè)治療靶點(diǎn)及信號(hào)通路，體現(xiàn)出了中藥多靶點(diǎn)、多通路治療疾病的特點(diǎn)。但針對本研究預(yù)測的熊果酸治療OP的潛在靶點(diǎn)及通路，尚有待進(jìn)一步通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)予以驗(yàn)證。

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（收稿日期：2021-04-13 修回日期：2021-07-26）

（編輯：林 靜）