衰老大鼠腸道菌群的變化及人參-黃芪干預(yù)效應(yīng)

程波敏 汪棟材 吳海濱 宋曉容 尹霖 王慧

【摘要】目的：探討人參-黃芪對衰老大鼠模型腸道微生態(tài)的影響，探尋二者聯(lián)合使用對腸道微生態(tài)的影響及抗衰老機(jī)理研究。方法：模型組和人參-黃芪組大鼠皮下注射給予 D-氨基半乳糖制作衰老模型， 人參-黃芪組同時每日腹腔注射200 mg/kg 黃芪多糖及40 mg/kg 人參總皂苷持續(xù)8周，顯微鏡下觀察小腸黏膜的形態(tài)，檢測腸道iNOS、zo-1、occludin、claudin-1蛋白表達(dá)變化。結(jié)果：大鼠經(jīng)衰老誘導(dǎo)后，小腸絨毛表面細(xì)胞凋亡較為明顯，小腸iNOS、occludin、claudin-1表達(dá)顯著升高，zo-1表達(dá)顯著降低；而經(jīng)過人參與黃芪處理后，顯著抑制了大鼠小腸絨毛表面細(xì)胞的凋亡，同時抑制iNOS、occludin、claudin-1的表達(dá)，升高zo-1表達(dá)。結(jié)論：人參-黃芪聯(lián)合應(yīng)用可影響腸道菌群變化進(jìn)而發(fā)揮抗衰老作用。

【關(guān)鍵詞】人參；黃芪；抗衰老；腸道菌群

【中圖分類號】R951 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】2096-5249（2021）08-0006-02

衰老是一種自然的生命現(xiàn)象，以機(jī)體各部分組織和器官的功能活動逐漸衰退為特征。中醫(yī)延年學(xué)說對人體衰老或早衰的認(rèn)識源遠(yuǎn)流長，以氣血津液學(xué)說最為經(jīng)典，氣為生命之源，“衰老”在中醫(yī)中謂“氣虛”，即元?dú)獠蛔?，臟腑機(jī)能逐漸減退的虛弱癥候，臨床常用補(bǔ)益劑延年益壽[1]。現(xiàn)代研究認(rèn)為，衰老是一個內(nèi)外多種因素（基因、環(huán)境和精神心理等）共同作用的綜合結(jié)果[2]，可由多種應(yīng)激因素引起，如氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙等。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物變化會導(dǎo)致機(jī)體免疫功能衰退，同時導(dǎo)致衰老相關(guān)的慢性疾病，提示腸道微生物可能對衰老產(chǎn)生重要作用[3]。課題組前提研究提示人參-黃芪具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)功能，故本研究旨在探討人參-黃芪對衰老大鼠模型腸道微生態(tài)的影響，探尋二者聯(lián)合使用對腸道微生態(tài)的影響及抗衰老機(jī)理研究，為中醫(yī)藥抗衰老提供理論依據(jù)及實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3月齡SPF級SD雄性大鼠30只由實驗動物中心提供，體重分別為300～350 g/只。30只大鼠分為5組：對照組、模型組、人參組、黃芪組和人參黃芪組，大鼠在實驗動物中心SPF環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于試驗研究，室溫20～25℃，濕度40 %～60 %，定期紫外線燈消毒。

在模型組、人參組、黃芪組和人參黃芪組大鼠后肢外側(cè)皮下部位連續(xù)注射D-半乳糖，注射劑量為0.125 g/kg·d，注射時間為每天上午9∶00～13∶00，連續(xù)注射40 d。

30只大鼠均在自由攝食、飲水，標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)40 d。

1.2 干預(yù)方式

每日腹腔注射給予黃芪組大鼠200 mg/kg黃芪多糖，人參組大鼠40 mg/kg 人參總皂苷， 人參黃芪組大鼠200 mg/kg黃芪多糖及40 mg/kg 人參總皂苷， 同時給予對照組和衰老組大鼠等量生理鹽水，連續(xù)注射8周。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 大鼠小腸形態(tài)：研究期間觀察大鼠小腸形態(tài)變化。

1.3.2 大鼠腸道iNOS、zo-1、occludin、claudin-1蛋白表達(dá)檢測：取體積100 mg凍存組織，以RIPA裂解液提取組織總蛋白，蛋白經(jīng)純化后進(jìn)行定量，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，PAGE膠經(jīng)硝酸纖維膜轉(zhuǎn)膜后，分別孵育兔抗鼠iNOS、zo-1、occludin、claudin-1以及GAPDH一抗。再以HRP標(biāo)記的二抗孵育過夜。硝酸纖維膜經(jīng)定影、顯影后，以Quantity One v4.4.0軟件分析iNOS、zo-1、occludin、claudin-1以及GAPDH蛋白條帶的光密度。

2 結(jié)果

2.1 人參-黃芪處理對衰老大鼠小腸形態(tài)的影響

如圖1所示，與對照組大鼠相比較，大鼠經(jīng)衰老誘導(dǎo)后，小腸絨毛表面細(xì)胞凋亡較為明顯。而經(jīng)過人參與黃芪處理后，顯著抑制了大鼠小腸絨毛表面細(xì)胞的凋亡（人參組和黃芪組未觀察小腸形態(tài)）。

2.2 人參和黃芪處理對衰老大鼠腸道iNOS、zo-1、occludin、claudin-1蛋白表達(dá)的影響

如圖2所示，與對照組大鼠相比較，大鼠經(jīng)衰老誘導(dǎo)后，小腸iNOS、occludin、claudin-1表達(dá)顯著升高，但經(jīng)過人參與黃芪分別處理后，iNOS、occludin、claudin-1的表達(dá)顯著得到抑制。此外，與對照組大鼠相比較小腸zo-1表達(dá)顯著降低，但經(jīng)過人參與黃芪處理后，zo-1的表達(dá)顯著得到提高。

3 討論

隨著人口老齡化進(jìn)程的加劇，人們?nèi)找骊P(guān)注衰老問題及衰老所導(dǎo)致的疾病。研究顯示，腸道微生物與機(jī)體發(fā)育和衰老密切相關(guān)，腸道菌群也叫“第二基因組”[4]。隨著機(jī)體衰老，腸道微生物多樣性減少，尤其是有益菌群銳減，導(dǎo)致許多衰老相關(guān)疾病，如免疫相關(guān)疾病、糖尿病等代謝疾病、神經(jīng)退行性疾病等嚴(yán)重影響健康和生活質(zhì)量。

《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載：“人參主補(bǔ)五臟，安精神，定魂魄，止驚悸，除邪氣，明目開心益智，久服輕身延年?！比藚⑶o葉中提取的人參皂苷（Rb1、Rb2、Rc、Rg1、Rg2等）能不同程度的清除氧自由基，其中Rb1和Rg1被證實作用最強(qiáng)[5]。黃芪最早見于《五十二病方》，有“補(bǔ)氣”之功，其活性成分黃芪甲苷[6]具有抗衰老、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗纖維化等作用[7]。

本研究在衰老大鼠模型上證實了衰老誘導(dǎo)后，小腸絨毛表面細(xì)胞凋亡較為明顯，小腸iNOS、occludin、claudin-1表達(dá)顯著升高，zo-1表達(dá)顯著降低；而經(jīng)過人參與黃芪處理后，顯著抑制了大鼠小腸絨毛表面細(xì)胞的凋亡，同時抑制iNOS、occludin、claudin-1的表達(dá)，升高zo-1表達(dá)；表明人參-黃芪聯(lián)合應(yīng)用可通過影響腸道菌群變化進(jìn)而發(fā)揮抗衰老作用。衰老是人體必須經(jīng)歷的過程，從整體看，衰老代表健康的器官功能退化，但在細(xì)胞層面衰老也代表了細(xì)胞的功能減退和衰老凋亡的進(jìn)程[8]。衰老發(fā)生的機(jī)制復(fù)雜多樣，其中被廣泛認(rèn)可的假說是衰老受遺傳因素、飲食習(xí)慣和運(yùn)動等多種因素的影響，在炎癥和氧化應(yīng)激等多種機(jī)制的作用下引起細(xì)胞衰老等生理過程，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體各系統(tǒng)功能逐步退化[9]。而腸道微生物變化可以改變腸道屏障功能，破壞腸道屏障完整性，為后續(xù)的炎癥和感染提供條件[10]。與此同時，腸道菌群失調(diào)，尤其是吲哚丙酸代謝相關(guān)菌群減少破壞腸道抗氧化功能；雙歧桿菌和擬桿菌減少能夠減少抗炎因子IL-10的含量，上調(diào)TNF-α和IL-17的含量[11]。以上均表明腸道微生物變化與衰老密切相關(guān)。而本研究通過實驗已經(jīng)證實，人參-黃芪聯(lián)合作用能明顯改善腸道微生物的紊亂，起到抗衰老的作用，為抗衰老機(jī)制的探索及臨床上相關(guān)疾病的診治提供有力證據(jù)和作用靶點，值得繼續(xù)深入研究和應(yīng)用推廣。

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