彌漫內(nèi)生性腦橋膠質(zhì)瘤靶向治療新策略的體外篩選與驗(yàn)證

李 瑞，韓雨潔，張 蕾，唐玉杰

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，細(xì)胞分化與凋亡教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200025

腫瘤是目前14歲以下兒童死亡的第二大原因，僅次于意外［1］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤已經(jīng)超過白血病成為發(fā)生率和致死率均列第一的兒童腫瘤類型［2］。彌漫內(nèi)生性腦橋膠質(zhì)瘤（diffuseintrinsic pontine glioma，DIPG）發(fā)生在兒童腦干的腦橋區(qū)域，中位生存期約為9個(gè)月，2年生存率低于10%，5年生存率不足1%，是目前已知致死性較高的腫瘤類型［3-4］。由于DIPG發(fā)生的腦橋區(qū)域存在控制心率和呼吸的重要神經(jīng)，而腫瘤本身又具有很強(qiáng)的浸潤性，因此臨床上該類腫瘤無法通過手術(shù)來治療［5］。目前僅放射治療（放療）能夠發(fā)揮一定的作用，但治療后腫瘤會(huì)很快復(fù)發(fā)并形成放療耐受，因此亟需發(fā)現(xiàn)針對(duì)DIPG的有效治療手段［6］。

研究［7］發(fā)現(xiàn)約80%的DIPG患者攜帶H3組蛋白編碼基因H3F3A（H3-3A gene）或HIST1H3B（H3 clustered histone 2）的體細(xì)胞突變，使得第27位賴氨酸突變成甲硫氨酸，即H3K27M突變。雖然DIPG中H3K27M的表觀遺傳腫瘤驅(qū)動(dòng)功能已經(jīng)被業(yè)內(nèi)公認(rèn)，但是該突變很難被小分子直接靶向，因此近年來包括筆者所在團(tuán)隊(duì)在內(nèi)的國內(nèi)外多個(gè)團(tuán)隊(duì)都聚焦在鑒定能夠間接拮抗H3K27M致癌功能的表觀遺傳靶向策略，并報(bào)道了溴結(jié)構(gòu)域和外端家族（bromodomain and extra terminal protein，BET）抑制劑［8］、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶7（cyclin-dependent kinase 7，CDK7）抑制劑［8］以及組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）抑制劑［9］等表觀遺傳靶向小分子能夠在臨床前腫瘤模型中有效治療DIPG，開拓了DIPG的表觀遺傳靶向治療新思路。其中HDAC抑制劑panobinostat已獲美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)用于多發(fā)性骨髓瘤的治療［10］，多個(gè)BET抑制劑和CDK7抑制劑已進(jìn)入腫瘤治療的早期臨床試驗(yàn)［11］。然而，筆者所在團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)體外長期亞致死劑量藥物作用可以誘導(dǎo)DIPG細(xì)胞產(chǎn)生針對(duì)panobinostat的獲得耐藥性；BET抑制劑處理DIPG細(xì)胞主要產(chǎn)生增殖抑制作用，并不誘導(dǎo)顯著的細(xì)胞毒作用［8］，這些都將限制其潛在的臨床應(yīng)用。

存活蛋白（survivin）由BIRC5（baculoviral IAP repeat containing 5）基因編碼，是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis，IAP）家 族 成 員［12］。腫 瘤 中survivin的高表達(dá)通常與化療耐藥、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加、腫瘤復(fù)發(fā)的高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，使其在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)可作為能反映較差預(yù)后的生物標(biāo)志物［13］。同時(shí)survivin靶向抑制劑YM155也進(jìn)入了臨床試驗(yàn)［14-15］。

本研究結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析和藥物庫篩選尋找DIPG可能的靶向治療策略，并進(jìn)行體外驗(yàn)證，旨在為后續(xù)體內(nèi)驗(yàn)證和機(jī)制挖掘奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細(xì)胞 DIPG原代細(xì)胞SU_DIPG13和SU_DIPG17由美國斯坦福大學(xué)Dr.Monje贈(zèng)予，均來自H3.3組蛋白K27M突變的DIPG患者，經(jīng)原代培養(yǎng)后可在體外穩(wěn)定連續(xù)傳代培養(yǎng)。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)基 DIPG培養(yǎng)基成分包括：Neurobasal-A培養(yǎng)基（10888022，美國Gibco）、DMEM/F12培養(yǎng)基、HEPES緩沖溶液（15630-080，美國Invitrogen）、丙酮酸鈉溶液（11360-070，美國Invitrogen）、非必需氨基酸（11140-050，美國Invitrogen）、GlutaMAX-I（35050-061，美國Invitrogen）、B-27（12587-010，美國Invitrogen）、人表皮生長因子（AF-100-15-100，美國PeproTech）、人成纖維細(xì)胞生長因子（100-18B-100，美國PeproTech）、人血小板源生長因子AA（100-13A-50，美國PeproTech）、人血小板源生長因子BB（100-14B-50，美國PeproTech）、肝素（07980，加拿大StemCell Technologies）、抗菌抗真菌劑（15240-096，美國Invitrogen）。

小鼠神經(jīng)干細(xì)胞（mouse neural stem cell，mNSC）培養(yǎng)基成分包括：鼠源神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基（NeuroCult NS-A proliferation kit mouse）（Cat05702，加 拿 大StemCell Technologies）、鼠表皮細(xì)胞生長因子（315-09-100，美國PeproTech）、鼠堿性成纖維細(xì)胞生長因子（450-33-50，美國PeproTech）、肝素、抗菌抗真菌劑。

1.1.3 其他試劑 篩選所用藥物庫部分由美國兒童癌癥治療發(fā)展研究所Dr.Charles Keller贈(zèng)予，部分從美國Cayman Chemical和Selleck公司購買。Matrigel、多聚右旋賴氨酸（poly-D-lysine，PDL）、PBS（GP200603，武漢賽維爾生物科技有限公司），HBSS、蛋白裂解液、TRIzol、TrypLE、DNA酶、CellTiter-Blue（G8080，美國Promega），CellTiter-Glo（G9243，美國Promega），BCA蛋白定量試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green、EdU試劑盒、凋亡試劑盒、SDS-PAGE凝膠（上海熠晨生物科技有限公司），survivin抗體（71G4B7，美國Cell Signal Technology）。死亡結(jié)構(gòu)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域BH3的模擬抑制劑ABT-737、酪蛋白激酶2（casein kinase 2，CK2）抑制劑CX4945（美國Selleck）。

1.1.4 小鼠 出生后48 h的BALB/c小鼠2只，飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部SPF級(jí)動(dòng)物房。動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（滬）2018-0027，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2018-0007。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)操作均獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) DIPG原代細(xì)胞37℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。mNSC從出生后48 h的BALB/c小鼠小腦獲取。2只小鼠斷頭處理，取出小腦，去腦膜，分離皮層，培養(yǎng)皿中切碎后用TrypLE在37℃振蕩消化11 min，離心后HBSS重懸，40μm濾網(wǎng)過濾，離心后mNSC培養(yǎng)基重懸培養(yǎng)，0.1 mg/mL的PDL包被孔板37℃放置2 h，蒸餾水洗凈后用于mNSC培養(yǎng)。

1.2.2 DIPG轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析 8例DIPG腫瘤組織以及6例對(duì)照遠(yuǎn)端正常腦組織的mRNA測序（mRNA sequencing，RNA-seq）數(shù)據(jù)來自前期發(fā)表的文章［9］。R包DESeq2用于分析差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），以調(diào)整P值（adjustedPvalue，padj）≤0.05、|log2差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）|≥1為標(biāo)準(zhǔn)篩選。R包ggplot2繪制散點(diǎn)圖、火山圖，R包pheatmap繪制熱圖?；蚋患治觯℅ene Set Enrichment Analysis，GSEA）進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）和通路（Pathway）分析。GO分析包括生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）；Pathway分析包括京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes，KEGG）、BioCarta和REACTOME。

1.2.3 靶向小分子單藥和組合篩選 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組分析并結(jié)合DIPG和其他腦膠質(zhì)瘤的已有靶向治療研究成果，選擇若干靶向小分子進(jìn)行DIPG原代細(xì)胞的殺傷篩選和驗(yàn)證。選擇一些已經(jīng)在DIPG中報(bào)道過的靶向小分子作為陽性對(duì)照，包括靶向小分子THZ1、panobinostat、AUY922、PR-171、flavopiridol等［8-9，16］。

設(shè)置0.01、0.1、1、10μmol/L 4個(gè)篩選濃度，以不做處理的空白組（MOCK）和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）處理組為陰性對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。384孔板每孔鋪板1 500個(gè)SU_DIPG13細(xì)胞，加藥處理72 h，CellTiter-Blue檢測細(xì)胞活力。

同時(shí)用以上靶向小分子在0.01、0.1、1、10μmol/L濃度下與BET抑制劑JQ1或HDAC抑制劑panobinostat進(jìn)行組合篩選。JQ1和panobinostat的篩選濃度為40%抑制濃度（inhibitory concentration，IC），即IC40。同樣以不做處理的MOCK組和DMSO處理組為陰性對(duì)照。

1.2.4 藥物反應(yīng)曲線測定 對(duì)于要體外單獨(dú)驗(yàn)證的藥物，分別選擇5個(gè)藥物濃度（0.000 1、0.001、0.01、0.1、1μmol/L）繪制藥物反應(yīng)曲線。96孔板每孔鋪板5 000個(gè)SU_DIPG13細(xì)胞，每個(gè)濃度條件設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，加藥72 h后CellTiter-Glo檢測細(xì)胞活力，用GraphPad Prism 8軟件繪制藥物反應(yīng)曲線。

1.2.5 Western blotting 藥物處理SU_DIPG13細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞懸液至EP管中，離心，棄上清液，沉淀用含有苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）的蛋白裂解液吹打，并在冰上裂解30 min，離心。收集上清液至新的離心管中，BCA試劑盒檢測蛋白濃度并定量。配制SDS-PAGE凝膠，每個(gè)樣品上樣10μg，100 V電壓條件下進(jìn)行電泳，直至溴酚藍(lán)遷移至膠底部。聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜用甲醇活化后轉(zhuǎn)膜，90 min后取出，用5%牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）搖床封閉1 h后，加一抗（1∶1 000），于4℃搖床中過夜。微管蛋白為內(nèi)參。TBST洗膜后，二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，TBST洗膜后顯影。

1.2.6 實(shí)時(shí)定量PCR 藥物處理24 h后，收集SU_DIPG13細(xì)胞懸液至EP管中，離心，棄上清液，500μL TRIzol吹打至沉淀完全溶解；每管加入100μL氯仿，快速混勻，靜置2 min；12 000×g、4℃離心15 min，吸取上清液至新的EP管中；每管加入2μL糖原、250μL預(yù)冷異丙醇，混勻靜置2 min；12 000×g、4℃離心10 min；棄上清液，加入1 mL預(yù)冷75%乙醇，7 500×g、4℃離心2 min，重復(fù)此步驟；加20～30μL DEPC水溶解沉淀，定量。反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR）試劑檢測RNA表達(dá)水平。BIRC5和GAPDH引物序列如下：BIRC5上游引物5'-AGGACCACCGCATCT CTACAT-3'，下游引物5'-AAGTCTGGCTCGTTCTCAGT G-3'；GAPDH上游引物5'-TGACTTCAACAGCGACAC CCA-3'，下游引物5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA3'。

1.2.7 藥物對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響 設(shè)置MOCK、DMSO處理組作為對(duì)照組，設(shè)置藥物處理組為實(shí)驗(yàn)組，分別檢測SU_DIPG13細(xì)胞的增殖和凋亡水平。在藥物處理細(xì)胞18 h后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均加入EdU，使其終濃度為10μmol/L，37℃孵育6～8 h后收集細(xì)胞并消化為單細(xì)胞，4%多聚甲醛固定并破膜處理，APC熒光染色后，避光室溫孵育30 min，流式細(xì)胞儀（CytoFLEX S，美國Beckman Coulter）檢測細(xì)胞增殖活性。藥物處理細(xì)胞48 h后，收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，并消化細(xì)胞為單細(xì)胞后，Annexin V和碘化丙啶（propidium iodide，PI）同時(shí)對(duì)細(xì)胞染色，避光室溫孵育5 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平。

1.2.8 靶向小分子的組合驗(yàn)證 組合的2個(gè)靶向小分子各選擇4個(gè)逐步升高的濃度分別進(jìn)行單藥和組合藥物抑制率檢測，并利用CalcuSyn 2.0軟件計(jì)算組合指數(shù)（combination index，CI）。CI<1、CI=1、CI>1分別表示2個(gè)靶向小分子在對(duì)應(yīng)濃度下存在協(xié)同抑制、疊加抑制、拮抗腫瘤細(xì)胞生長的效果［17］。

2 結(jié)果

2.1 DIPG腫瘤組織的轉(zhuǎn)錄組分析

為了鑒定新的DIPG靶向治療策略，利用課題組前期已經(jīng)發(fā)表的8例DIPG腫瘤組織和6例對(duì)照遠(yuǎn)端正常腦組織的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行DEGs分析［9］，篩選出2 319個(gè)DEGs，包括1 020個(gè)在腫瘤中顯著上調(diào)和1 299個(gè)在腫瘤中顯著下調(diào)的基因（圖1A、B）。對(duì)上述基因分別進(jìn)行GO分析和Pathway分析，用于鑒定富集了表達(dá)失調(diào)轉(zhuǎn)錄本的致癌或抑癌相關(guān)生物學(xué)功能或信號(hào)通路（圖1C、D）。DIPG中顯著上調(diào)的基因主要存在于細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞表面，參與微管、細(xì)胞外基質(zhì)等形成和功能；顯著下調(diào)的基因主要存在于突觸上，功能上主要參與突觸信號(hào)以及細(xì)胞之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和神經(jīng)分化。

2.2 DIPG原代細(xì)胞的靶向小分子篩選

以DIPG腫瘤轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果為基礎(chǔ)，共挑選出10類66個(gè)靶向小分子（圖2A）。這10類分子包括BET抑制劑、HDAC抑制劑、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（histone methyltransferaseinhibitor，HMTi）、組蛋白去甲基化酶抑制劑（histone demethylase inhibitor，HDMi）、細(xì)胞周期類抑制劑（cell cycle inhibitor，CCi）、代謝類藥物（metabolic drug，MD）、激酶抑制劑（kinase inhibitor，KI）、mTOR抑制劑（mTOR inhibitor，mTORi）和通路抑制劑（signaling pathway inhibitor，SPi）等。

選擇DIPG原代細(xì)胞SU_DIPG13對(duì)上述66個(gè)靶向小分子進(jìn)行體外細(xì)胞活性抑制篩選。針對(duì)每個(gè)靶向小分子，分別測試了藥物在4個(gè)濃度下處理SU_DIPG13細(xì)胞72 h之后對(duì)細(xì)胞活性的影響（圖2B）。結(jié)果顯示，在0.01、0.1、1、10μmol/L濃度條件下抑制率超過50%的靶向小分子分別有2、3、11和22個(gè)。最終以1μmol/L濃度下對(duì)細(xì)胞生長抑制率大于50%為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲得符合該標(biāo)準(zhǔn)的11個(gè)靶向小分子；其中包含5個(gè)陽性對(duì)照小分子。根據(jù)抑制率大小，從高到低分別是YM155、AUY922、THZ1、CDK1/2 inhibitorⅢ、dinaciclib、PR-171、panobinostat、flavopiridol、LY2874455、INK128和JIB-04（圖2C）。11個(gè)小分子中除了THZ1和JIB-04，均已進(jìn)入臨床試驗(yàn)（表1）；而CDK7抑制劑THZ1有同類小分子藥物進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)（NCT04247126）。

2.3 BIRC5靶向小分子藥物YM 155對(duì)DIPG的抑制作用

在11個(gè)小分子的靶基因中，BIRC5、CDK2、CDK4、PSMB8、PSMB9在DIPG中特異性高表達(dá)（log2FC≥1，padj≤0.05）。其中只有靶基因?yàn)锽IRC5的小分子YM155尚未在DIPG中報(bào)道過，并且與正常腦組織轉(zhuǎn)錄組比較BIRC5在DIPG中上調(diào)的倍數(shù)最高（log2FC=4.64，P=0.018；圖2D）。此外，YM155殺傷SU_DIPG13細(xì)胞的IC50最小，且在1μmol/L濃度下的抑制效果也最強(qiáng)（表1）。因此，接下來對(duì)BIRC5基因進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證。

表1 在1μmol·L-1條件下對(duì)SU_DIPG13細(xì)胞抑制率大于50%的藥物Tab 1 Drugs with growth inhibition rate over 50%at 1μmol·L-1 in SU_DIPG13 cells

首先通過qRT-PCR和Western blotting檢測YM155在體外對(duì)BIRC5表達(dá)的影響。YM155處理SU_DIPG13細(xì)胞后BIRC5的表達(dá)在mRNA和蛋白水平均受到明顯抑制（圖3A、B）。平行比較YM155在2個(gè)DIPG原代細(xì)胞SU_DIPG13、SU_DIPG17和對(duì)照細(xì)胞mNSC的濃度-抑制率曲線后，2個(gè)DIPG原代細(xì)胞的IC50（0.004、0.007μmol/L）顯著低于mNSC（0.03μmol/L），YM155在體外對(duì)DIPG細(xì)胞有更顯著的抑制作用（圖3C）。進(jìn)一步通過EdU和Annexin V/PI標(biāo)記染色的方法分別測試YM155處理DIPG原代細(xì)胞后對(duì)其增殖和凋亡的影響。結(jié)果顯示，與MOCK和DMSO組相比，YM155在0.005μmol/L和0.01μmol/L濃度下均能夠顯著抑制SU_DIPG13細(xì)胞增殖（圖3D），促進(jìn)細(xì)胞凋亡（圖3E）。

2.4 DIPG原代細(xì)胞的靶向小分子組合篩選與驗(yàn)證

為了解決DIPG治療中HDAC抑制劑的獲得性耐藥和BET抑制劑未能顯著誘導(dǎo)細(xì)胞毒殺傷的問題［8］，本研究在單藥篩選的基礎(chǔ)上進(jìn)行藥物庫與HDAC抑制劑panobinostat和BET抑制劑JQ1的組合篩選。

在組合篩選中，將66種藥物在0.01、0.1、1、10μmol/L濃度下分別與濃度為IC40的panobinostat和JQ1進(jìn)行組合篩選，并分別計(jì)算單藥、JQ1組合篩選和panobinostat組合篩選中各個(gè)小分子在不同濃度下的腫瘤細(xì)胞活性抑制率。然后以同一藥物濃度下panobinostat組或JQ1組較DMSO組抑制率高10%作為標(biāo)準(zhǔn)，篩選具有潛在協(xié)同抑制作用的小分子組合（圖4A）。

為了驗(yàn)證以上組合篩選結(jié)果可靠性，在panobinostat組和JQ1組中各挑選了一個(gè)未在DIPG中被報(bào)道過的組合［HDAC抑制劑與B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因（B-cell lymphoma/leukemia gene-2，Bcl-2）抑制劑、BET抑制劑與CK2抑制劑］在2個(gè)DIPG原代細(xì)胞中進(jìn)行體外組合抑制測試。其中ABT-737為死亡結(jié)構(gòu)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域BH3的模擬抑制劑，作用于Bcl-2［18］；CX4945是一種有效的、可口服的ATP競爭性的CK2抑制劑［19］。分別測試4個(gè)濃度條件下的單藥抑制率和組合抑制率，并計(jì)算其CI。結(jié)果顯示，除了SU_DIPG17細(xì)胞中panobinostat與ABT-737的最低濃度組合條件之外，其他組合其CI均小于1，說明HDAC抑制劑與Bcl-2抑制劑以及BET抑制劑與CK2抑制劑之間存在針對(duì)DIPG細(xì)胞的協(xié)同抑制作用（圖4B、C）。以上驗(yàn)證結(jié)果表明我們篩選發(fā)現(xiàn)的一系列具有協(xié)同抑制作用的DIPG靶向組合新策略具備進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證的潛力。

圖4 DIPG的體外藥物組合篩選及驗(yàn)證Fig 4 Screening and validation of combinatory drug for DIPG in vitro

3 討論

DIPG是一類發(fā)病率高且極為惡性的兒童腦腫瘤，目前僅放療具有一定的效果，因此亟需尋找有效的靶向治療方法［6］。在本研究中，我們根據(jù)DIPG腫瘤組織的轉(zhuǎn)錄組分析選擇多個(gè)靶向小分子在患者來源DIPG原代細(xì)胞中進(jìn)行了體外篩選。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示，在DIPG中顯著上調(diào)的基因富集于細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞表面，參與微管、細(xì)胞外基質(zhì)等的形成和功能；這些在DIPG中表達(dá)上調(diào)的基因可能通過激活細(xì)胞外基質(zhì)以及核糖體相關(guān)的信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖［20］。與之一致的是，在DIPG中已經(jīng)有血小板源性生長因子受體α多肽（platelet-derived growth factor receptorα，PDGFRA）、RAS、1型激活素受體（activin receptor type-1，ACVR1）以及成纖維生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）等多條細(xì)胞外基質(zhì)或膜表面相關(guān)信號(hào)通路被發(fā)現(xiàn)具有重要致癌作用［21-24］。DIPG中顯著下調(diào)的基因富集于突觸，參與突觸和細(xì)胞以及細(xì)胞之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞分化。突觸通常隨著神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育而不斷形成［25］。DIPG中與神經(jīng)突觸、信號(hào)傳遞功能相關(guān)的基因表達(dá)顯著下調(diào)，表明其具有去分化或分化抑制特性，而這種分子特征對(duì)于腫瘤的形成和維持可能具有重要作用［26］，這與已有研究結(jié)果一致［22，27］。

結(jié)合篩選和體外驗(yàn)證結(jié)果，我們鑒定出DIPG中顯著高表達(dá)的BIRC5基因的靶向小分子藥物YM155對(duì)DIPG細(xì)胞具有較強(qiáng)的體外殺傷效果。進(jìn)一步的研究表明YM155能夠顯著抑制DIPG原代細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。這為DIPG的靶向治療提供了一種新策略。YM155已經(jīng)進(jìn)入腫瘤治療的臨床試驗(yàn)（表1）。本研究結(jié)果為該藥物的相關(guān)研究成果盡快進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化提供了重要基礎(chǔ)。

目前已經(jīng)明確H3K27M組蛋白突變引起的表觀遺傳失調(diào)在DIPG中發(fā)揮了關(guān)鍵的腫瘤驅(qū)動(dòng)功能［28-29］，但該突變本身并不是合適的藥物靶標(biāo)。針對(duì)這個(gè)情況，近年來包括我們在內(nèi)的多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)開辟了DIPG的靶向治療新方向，揭示了多個(gè)能在臨床前腫瘤模型中有效殺傷DIPG的表觀遺傳靶向策略，包括BET抑制劑、HDAC抑制劑和CDK7抑制劑等［8-9］。其中最值得關(guān)注的是HDAC抑制劑panobinostat，其已經(jīng)進(jìn)入治療DIPG的Ⅰ期臨床試驗(yàn)。但我們發(fā)現(xiàn)藥物長期作用可誘導(dǎo)DIPG細(xì)胞產(chǎn)生針對(duì)panobinostat的獲得耐藥性，BET抑制劑也存在不能顯著誘導(dǎo)細(xì)胞毒作用的短板［8］。為了解決這些問題，我們同時(shí)進(jìn)行了基于BET抑制劑或HDAC抑制劑的組合篩選和初步驗(yàn)證。篩選結(jié)果中panobinostat與JQ1以及與PR-171（蛋白酶體抑制劑）的協(xié)同抑制作用已在DIPG中有過報(bào)道［30］；而panobinostat與PR-171或RAD001（mTOR抑制劑）的潛在組合已分別進(jìn)入多發(fā)性骨髓瘤（NCT01301807）和淋巴瘤（NCT00967044）的臨床試驗(yàn)，這些均說明我們的篩選方法有效。在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)HDAC抑制劑與Bcl-2抑制劑以及BET抑制劑與CK2抑制劑等新的潛在聯(lián)合藥物治療策略，為后續(xù)進(jìn)行針對(duì)DIPG體內(nèi)臨床前腫瘤模型的組合治療驗(yàn)證提供了初步證據(jù)。

DIPG是發(fā)生在腦干中腦橋區(qū)域的顱內(nèi)腫瘤類型，血腦屏障的存在會(huì)顯著阻礙多種小分子藥物進(jìn)入腫瘤區(qū)域。因此與其他腦腫瘤一樣，DIPG的藥物治療面臨著更大的挑戰(zhàn)［31-32］。本研究發(fā)現(xiàn)的能在單藥或組合治療中顯著抑制DIPG的靶向小分子HDAC抑制劑、BET抑制劑和CK2抑制劑均能有效通過血腦屏障，且已有藥物（panobinostat、OTX015、CX4945）進(jìn)入腦腫瘤治療的早期臨床試驗(yàn)，但Bcl-2抑制劑以及BIRC5抑制劑類藥物尚無法有效跨越血腦屏障［33-35］。因此，在后續(xù)應(yīng)用體內(nèi)模型進(jìn)行藥物治療測試時(shí)，要么選取可有效通過血腦屏障的同類靶向小分子藥物，要么通過特殊的方法來實(shí)現(xiàn)顱內(nèi)有效藥物遞送。對(duì)流增強(qiáng)遞送（convection enhanced delivery，CED）是一種直接將藥物注入腫瘤所在部位從而克服血腦屏障的顱內(nèi)藥物遞送技術(shù)，目前正在臨床上開展腦腫瘤治療的試驗(yàn)［36-37］。已有研究［38-39］表明該方法同樣適用于DIPG的治療，其與免疫放射療法聯(lián)合后表現(xiàn)出良好的安全性和可行性。因此，該方法的應(yīng)用有望大大促進(jìn)我們所發(fā)現(xiàn)的DIPG靶向新策略的體內(nèi)驗(yàn)證與臨床轉(zhuǎn)化。

綜上所述，我們通過轉(zhuǎn)錄組分析和靶向小分子單藥或組合篩選，發(fā)現(xiàn)并初步驗(yàn)證了DIPG的一些潛在有效靶向治療策略，為它們進(jìn)一步在DIPG的體內(nèi)臨床前腫瘤模型中的研究提供了初步證據(jù)。后續(xù)更加深入的研究有望為DIPG這類嚴(yán)重危害兒童健康的疾病提供新的治療思路。

參·考·文·獻(xiàn)

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