云南傳統(tǒng)腌制韭菜中一株乳酸菌的分離及發(fā)酵特性研究

杜永新，李瓊瑩，尹柯茹，張麗波，郝亞琴，劉雪英，趙世偉，馬萬平，楊子彪

（云南皇氏來思爾乳業(yè)有限公司，云南大理 671003）

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）隸屬于原核微生物中的鏈球菌屬，是一種對機(jī)體有益的乳酸菌，作為一種工業(yè)化發(fā)酵劑而被廣泛使用；形態(tài)多為球形或者卵球形，直徑一般小于1 μm，成對或者鏈狀生長，其最適生長溫度為38～43 ℃、pH 值6.0～7.0，通常情況下菌體的形態(tài)會受到培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度的影響[1]；大多數(shù)菌株在50 ℃下能夠生長，在60 ℃下加熱30 min 仍能存活；嗜熱鏈球菌是一種革蘭氏陽性菌，其固有特征為無芽孢、無鞭毛、無運(yùn)動性，屬于兼性厭氧同型發(fā)酵乳酸菌，能夠利用乳糖生成L（+）型乳酸、乙醛和丁二酮，屬于化能異養(yǎng)型微生物；其擁有多種蛋白水解酶，但對乳蛋白水解能力較弱，必須從外界吸收多種小分子營養(yǎng)物質(zhì)才能較好地實(shí)現(xiàn)自身的新陳代謝[2]；嗜熱鏈球菌作為乳品生產(chǎn)過程中非常重要的發(fā)酵菌株[3]，具有重大的市場價(jià)值[4]，是公認(rèn)安全的食品級微生物，對人體腸道菌群的平衡、乳糖不耐癥的改善和機(jī)體免疫力的調(diào)節(jié)具有積極作用[5-6]。

云南腌制韭菜產(chǎn)自云南省大理白族自治州賓川縣，由當(dāng)?shù)刈援a(chǎn)韭菜、韭花等食材泡制而成，其味道鮮美、酸香味濃郁、色澤鮮艷[7]。腌制韭菜中微生物群落復(fù)雜多樣，含有豐富的乳酸菌、酵母菌等，而獨(dú)特的產(chǎn)香性能也與其微生物群落中乳酸菌所產(chǎn)雙乙酰等有關(guān)。雙乙酰亦稱雙乙酰酮或2,3-丁二酮，是一種重要的食品風(fēng)味物質(zhì)[8-9]。雙乙酰是很多發(fā)酵乳制品如奶油、酪乳、發(fā)酵乳、干酪的主要風(fēng)味物質(zhì)，在合適濃度時(shí)，其可增加發(fā)酵乳制品的香味，同時(shí)也是啤酒和葡萄酒等的重要異味來源[10]。

試驗(yàn)選取產(chǎn)自云南地區(qū)的腌制韭菜，利用傳統(tǒng)的微生物分離純化及分子鑒定技術(shù)，對其中的產(chǎn)雙乙酰乳酸菌進(jìn)行分離鑒定，并確定篩選菌株的雙乙酰產(chǎn)量，最終篩選出一株生長性能佳、產(chǎn)雙乙酰、耐受性良好的優(yōu)勢菌種，旨在為開發(fā)風(fēng)味獨(dú)特的工藝化乳酸菌發(fā)酵劑和新型功能性食品制備提供理論依據(jù)及數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

韭菜腌菜，云南大理特色食品廠提供；MC 培養(yǎng)基、M17 培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司提供；雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma 提供；PCR Mix 酶、細(xì)菌16S rDNA 通用引物、ddH2O，生工生物工程（上海）股份有限公司提供；DNA 提取試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司提供；三氯乙酸，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司提供；氫氧化鈉，天津大茂化學(xué)試劑廠提供。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

PCR 儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，北京科創(chuàng)銳新生物科技有限公司產(chǎn)品；顯微鏡；漩渦振蕩器，濟(jì)南歐萊博生物科技有限公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；SW-CJ-1F 型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；臥式高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品中疑似乳酸菌的分離與保藏

吸取1 mL 腌制韭菜汁，采用PBS 對其進(jìn)行10 倍梯度稀釋，選擇合適的濃度梯度，吸取1 mL 涂布于M17 固體平板，置于38 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后挑選出平板上性狀不同的單菌落在M17培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，直至獲得純培養(yǎng)物，然后進(jìn)行革蘭氏染色和接觸酶試驗(yàn)。純化菌株經(jīng)濃縮后轉(zhuǎn)接于含有10%甘油的M17 液體培養(yǎng)基中冷凍保藏。

1.2.2 菌株的鑒定

（1）形態(tài)學(xué)觀察。將篩選出的疑似乳酸菌菌株培養(yǎng)液劃線接種到M17 固體培養(yǎng)基上，恒溫38 ℃培養(yǎng)48 h，觀察并記下菌落的特征、形態(tài)、大小、表面光滑程度，菌面隆起程度、菌落邊緣的整齊程度等基本特征。將菌株的純培養(yǎng)物進(jìn)行涂片，然后進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察記錄其細(xì)胞形態(tài)特征。

（2）菌株總DNA 提取。乳酸菌基因組總DNA由上海生工公司提供的Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提??；1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，檢測后保存在-20 ℃的冰箱中。

（3）16S rRNA 擴(kuò)增。16S rRNA 擴(kuò)增的上、下游引物采用的是細(xì)菌通用引物。引物序列及擴(kuò)增目標(biāo)長度如下。

細(xì)菌通用引物序列及擴(kuò)增片段長度見表1。

表1 細(xì)菌通用引物序列及擴(kuò)增片段長度

按下表反應(yīng)體積及反應(yīng)程序進(jìn)行PCR 擴(kuò)增目的基因。

PCR 反應(yīng)體積及反應(yīng)程序見表2。

表2 PCR 反應(yīng)體積及反應(yīng)程序

按照反應(yīng)體系加樣后，輕輕混勻并簡短離心，反應(yīng)結(jié)束取5 μL PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并設(shè)空白對照。

（4）序列分析。在NCBI 上將GenBank 核酸序列數(shù)據(jù)庫的已知序列和所得序列進(jìn)行比較，當(dāng)相似度在98%以上的，可以被認(rèn)為是同一種。

1.2.3 菌株性能測定

（1）耐受性測定。將活化好的嗜熱鏈球菌C198-B-03 轉(zhuǎn)接至pH 值分別為2.5 的M17 培養(yǎng)液中混勻，于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)38 ℃下靜置培養(yǎng)2 h，培養(yǎng)結(jié)束測定活菌數(shù)；按公式計(jì)算存活率；將活化好的嗜熱鏈球菌C198-B-03 轉(zhuǎn)接至膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的M17 培養(yǎng)液中混勻，于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)38 ℃下靜置培養(yǎng)3 h，培養(yǎng)結(jié)束測定活菌數(shù)。

（2）奶管中發(fā)酵性能測定。將活化后的菌種按2%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接至12%（W/V）脫脂乳管內(nèi)，于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)38 ℃下靜置培養(yǎng)，記錄凝乳時(shí)間、凝乳時(shí)滴定酸度；測定接種后24，48，72，96 h 3 個溫度梯度保藏（4 ℃、室溫、38 ℃）下的活菌數(shù)和滴定酸度，活菌數(shù)、滴定酸度測定分別參照GB 4789.35—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)[11]和GB 5009.239-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品酸度的測定[12]所述方法測定。

1.2.4 嗜熱鏈球菌C198-B-03 產(chǎn)雙乙酰含量測定

（1）雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。取一定量的雙乙酞標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度分別為0，3.0，6.0，9.0，12.0，15.0 mg/L 的雙乙酞標(biāo)準(zhǔn)溶液。再取12 支試管分兩排放置，分別加入5 mL 上述不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液各2 支，第一排試管中加入1%的鄰苯二胺溶液0.25 mL，第二排試管作為空白組不加，搖勻后置于黑暗處放置30 min。待反應(yīng)完全，第一排試管加4.0 mol/L 鹽酸溶液1.0 mL，第二排試管加4.0 mol/L鹽酸溶液1.25 mL，終止反應(yīng)。混勻后以空白組作為參比液，于波長335 nm 處測定吸光度。以雙乙酞質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）發(fā)酵乳樣品中雙乙酰含量的測定。

①取待測發(fā)酵乳20 mL，與等體積16%三氯乙酸溶液混勻，靜置10 min，于4 ℃下以轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心10 min；②離心結(jié)束，小心吸出上清液，并用濾紙過濾，保證上清液澄清；③吸取步驟（2）制得的溶液各10 mL 于2 只試管內(nèi)，分別編號為1 和2，向1 號管內(nèi)加入1%鄰苯二胺溶液0.5 mL，充分混勻，2 號管不加；④將1、2 號管置于暗處避光反應(yīng)30 min；⑤反應(yīng)結(jié)束后分別向1 號管內(nèi)加入4 mol/L HCl 溶液1 mL，2 管內(nèi)加4 mol/L HCl 溶液2.5 mL 混勻終止反應(yīng)；⑥以2 號管作為參比，利用紫外-可見分光光度計(jì)于波長335nm 處測定其OD 值，每個樣品重復(fù)3 次試驗(yàn)；⑦根據(jù)雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得待測樣品中雙乙酰質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定

2.1.1 C198-B-03 菌株菌落形態(tài)

C198-B-03 菌落生長形態(tài)情況見圖1，C198-B-03 菌體鏡檢情況見圖2。

圖1 C198-B-03 菌落生長形態(tài)情況

由圖1 可知，C198-3-03 菌落呈圓形、乳白色、不透明，表面有凸起、光滑濕潤，邊緣整齊，菌落直徑大小約為0.1 mm。由圖2 可知，經(jīng)革蘭氏染色后在光學(xué)顯微鏡下C198-B-03 菌株為革蘭氏陽性（G+），菌體形狀呈球形長鏈狀存在，無芽孢、無鞭毛。

圖2 C198-B-03 菌體鏡檢情況

2.1.2 菌株分子生物學(xué)鑒定

（1）C198-B-03 菌株16S rRNA 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。將初步獲得革蘭氏陽性（G+）、過氧化氫酶陰性的菌株暫定為乳酸菌，按UNI-Q 柱式細(xì)菌DNA抽提試劑盒說明書步驟提取細(xì)菌基因組，以細(xì)菌16S rRNA 通用引物作為引物，細(xì)菌基因組為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳。

C198-B-03 PCR 產(chǎn)物凝膠電泳情況見圖3。

圖3 C198-B-03 PCR 產(chǎn)物凝膠電泳情況

由圖3 可知，擴(kuò)增產(chǎn)物的片段長度為1 500 bp左右，與預(yù)期大小一致，圖像清晰、無彌散且無雜帶，表明PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量較高，可用于后續(xù)的測序。

（2）C198-B-03 菌株16S rRNA 序列分析。將C198-B-03 菌株的16S rRNA PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物序列長度為1 375 bp。將C198-B-03 菌株的16S rRNA 序列與Gen-bank 數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行同源性比較。

C198-B-03 菌株的同源性比較見表3。

表3 C198-B-03 菌株的同源性比較

結(jié)果顯示，C198-B-03 菌株和嗜熱鏈球菌ST64987、嗜熱鏈球菌PNGR K13 等的同源性相似度最高，達(dá)100%，可初步判定C198-B-03 菌株為嗜熱鏈球菌。

（3）C198-B-03 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。將16S rRNA基因序列在NCBI 上進(jìn)行BLAST 比對，利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[13]。由C198-B-03 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹可知，C198-B-03 菌株與Streptococcus thermophilus strain ST64987、Streptococcus thermophilusstrain N4L 等具有較高的親緣關(guān)系，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及基因序列分析結(jié)果，可將C198-B-03 菌株確定為嗜熱鏈球菌。

菌株C198-B-03 基于16S rRNA 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。

圖4 菌株C198-B-03 基于16S rRNA 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 菌株耐受性分析

嗜熱鏈球菌作為益生菌被人和動物食用時(shí)，會遇到胃酸環(huán)境的脅迫；作為發(fā)酵菌株被用于食品工業(yè)時(shí)，會遇到加工和貯藏環(huán)境的酸脅迫；乳酸菌在培養(yǎng)過程中，會遇到自身產(chǎn)酸造成的脅迫；而益生菌在人體內(nèi)充分發(fā)揮其特定的益生功能最重要的一點(diǎn)需要順利通過胃中酸性環(huán)境和十二指腸高膽鹽環(huán)境，以活菌狀態(tài)到達(dá)小腸和大腸，這樣才能發(fā)揮益生菌微生態(tài)調(diào)節(jié)的功能，據(jù)此在益生菌篩選過程中對酸性環(huán)境和膽鹽的耐受是益生菌必備的生理特征。一般來說，人體胃酸pH 值為2～3，小腸中的膽鹽濃度為3～5 mmol/L，通常研究者以pH 值為2.5，膽鹽質(zhì)量濃度為3 g/L 的培養(yǎng)基介質(zhì)對菌株進(jìn)行耐酸耐膽鹽能力篩選[14]。通過將篩選的嗜熱鏈球菌C198-B-03在pH 值為2.5 的M17 液體培養(yǎng)基中作用2 h 后其存活率可達(dá)50.98%，經(jīng)膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的M17作用3 h 后存活率可達(dá)44.11%；即說明篩選得到的嗜熱鏈球菌C198-B-03 具有較優(yōu)的膽鹽耐受性和酸脅迫性，可作為腸道耐受潛在菌株應(yīng)用，有較大開發(fā)價(jià)值。

2.3 菌株產(chǎn)雙乙酰能力測定

2.3.1 雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5。

圖5 雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖5 可知，由圖可知，采用鄰苯二胺比色法測定雙乙酰的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性關(guān)系良好。該標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=0.079 7X+0.007 9，R2=0.999 7。

2.3.2 試樣中雙乙酰濃度測定

采用鄰苯二胺比色法測定試樣OD335值，并參照雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算試樣中雙乙酰的質(zhì)量濃度；根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果測得試樣OD335值為0.783 0，帶入回歸方程計(jì)算出試樣中雙乙酰的質(zhì)量濃度，即嗜熱鏈球菌C198-B-03 在12%脫脂乳中發(fā)酵6 h 后其代謝雙乙酰含量可達(dá)9.725 2 mg/L。

2.4 發(fā)酵特性分析

2.4.1 嗜熱鏈球菌C198-B-03 在M17 中的生長曲線

菌株C198-B-03 在M17 中，溫度38 ℃發(fā)酵的生長曲線。

C198-B-03 在M17 中的生長曲線見圖6。

圖6 C198-B-03 在M17 中的生長曲線

結(jié)果顯示，該菌在1 h 后開始進(jìn)入對數(shù)期，其對數(shù)期保持至4 h；4 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期，菌液OD 值保持在1.023 并趨于穩(wěn)定，一直持續(xù)至24 h；在M17液體培養(yǎng)基中38℃培養(yǎng)條件下嗜熱鏈球菌C198-B-03 的最大比生長率為0.38。

式中：dX——單位時(shí)間OD 值增量；

dT——單位時(shí)間。

2.4.2 嗜熱鏈球菌C198-B-03 在奶管中發(fā)酵性能及穩(wěn)定性測定

將活化后的菌株按2%（V/V）接種于滅菌后的脫脂乳管內(nèi)，于38 ℃下恒溫培養(yǎng)，凝乳后將奶管取出分別置于4 ℃，室溫38 ℃條件下保藏或繼續(xù)培養(yǎng)，并于24，48，72，96 h 后測定樣品滴定酸度和活菌數(shù)。

嗜熱鏈球菌C198-B-03 發(fā)酵奶管在不同條件下滴定酸度變化見圖7，嗜熱鏈球菌C198-B-03 發(fā)酵奶管在不同條件下活菌數(shù)變化見圖8。

圖7 嗜熱鏈球菌C198-B-03 發(fā)酵奶管在不同條件下滴定酸度變化

圖8 嗜熱鏈球菌C198-B-03 發(fā)酵奶管在不同條件下活菌數(shù)變化

結(jié)果表明，嗜熱鏈球菌C198-B-03 單菌株發(fā)酵12%脫脂乳時(shí)具有很快的產(chǎn)酸速度，發(fā)酵3 h 開始凝乳，其凝乳時(shí)滴定酸度達(dá)48°T，黏度7.098 Pa·s；冷藏條件下儲藏穩(wěn)定性測定結(jié)果顯示，4 ℃條件下96 h 內(nèi)滴定酸度由60°T 增至86°T，活菌數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，并趨于穩(wěn)定，其活菌數(shù)最高可達(dá)5.15×108CFU/mL；室溫條件下儲藏穩(wěn)定性結(jié)果表明，96 h 內(nèi)滴定酸度由64°T 增至106°T，活菌數(shù)隨儲藏時(shí)間增加而呈現(xiàn)下降趨勢，室溫下96 h 時(shí)活菌數(shù)為2.2×108CFU/mL。

在乳酸菌發(fā)酵過程中，隨著產(chǎn)酸量的增加，乳酸菌的生長受到抑制。一般情況下，與保加利亞乳桿菌相比，嗜熱鏈球菌的酸穩(wěn)定性較弱。因此，在酸性發(fā)酵乳中的穩(wěn)定性是限制嗜熱鏈球菌產(chǎn)酸能力的一個重要因素。在試驗(yàn)中，嗜熱鏈球菌C198-B-03 在38 ℃條件下連續(xù)發(fā)酵12%脫脂乳96 h 后，極限滴定酸度為120°T，活菌數(shù)仍保持在1.5×108CFU/mL，揭示該菌在酸性發(fā)酵乳中有較好的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

通過梯度稀釋法從腌制韭菜中分離到一株高產(chǎn)雙乙酰的嗜熱鏈球菌C198-B-03。在12%脫脂乳中發(fā)酵6 h 其代謝雙乙酰含量達(dá)9.725 2 mg/L；在pH值為2.5 條件下作用2 h 后其存活率為50.98%，在膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%條件下作用3 h 后存活率為44.11%；在M17 液體培養(yǎng)基中其最大比生長速率為0.38；在12%脫脂乳中產(chǎn)酸速率快，發(fā)酵3 h 開始凝乳，于38 ℃條件下發(fā)酵72 h 后酸不再上升，發(fā)酵96 h 極限滴定酸度為120°T，活菌數(shù)仍保持在1.5×108CFU/mL，有較好穩(wěn)定性；可作為優(yōu)良的酸奶劑發(fā)酵菌株及腸道耐受備用菌株開發(fā)。

4 討論

嗜熱鏈球菌作為干酷、酸奶等發(fā)酵乳制品的主要發(fā)酵劑，被公認(rèn)為是僅次于乳酸乳球菌的第二大重要商業(yè)化發(fā)酵劑供試菌種[15]。酸奶的質(zhì)量與發(fā)酵劑的生長性能、產(chǎn)酸能力、產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)能力是直接相關(guān)的[16]，用生長速度快、產(chǎn)酸能力強(qiáng)、后酸化低及產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)能力強(qiáng)的發(fā)酵劑能縮短發(fā)酵乳制備周期、提高產(chǎn)品質(zhì)量并節(jié)約成本；雙乙酰作為一種羰基化合物被認(rèn)為是酸奶中關(guān)鍵的風(fēng)味物質(zhì)[17-18]，試驗(yàn)從云南大理傳統(tǒng)腌制韭菜中分離得到一株產(chǎn)酸速率快、后酸化低、高產(chǎn)雙乙酰且對酸和膽鹽耐受性較優(yōu)良的嗜熱鏈球菌，并在發(fā)酵乳中有較好的穩(wěn)定性，可作為功能性發(fā)酵劑進(jìn)一步開發(fā)。