扶正祛邪復(fù)方對人白血病細(xì)胞HL-60的增殖及凋亡的影響*

張曉丹 周永明 嚴(yán)靜賢 祝海霞

［1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437；3.上海市崇明區(qū)第三人民醫(yī)院，上海市崇明區(qū)岳陽醫(yī)院崇明分院，上海 202150；4.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院寶山分院（大場醫(yī)院），上海 200043］

急性白血病是常見的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，其特征就是骨髓或其他造血組織中白細(xì)胞及幼稚細(xì)胞的惡性增殖，浸潤全身組織及器官，臨床表現(xiàn)為貧血、感染、出血等癥狀。白血病的病情重、死亡率高、進(jìn)展快等特點(diǎn)使其成為嚴(yán)重威脅人們健康的惡性腫瘤疾病。白血病的發(fā)生與白血病細(xì)胞的增殖與凋亡失衡相關(guān)。誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡是目前臨床常用化療藥物的主要機(jī)制，是鑒定藥物是否敏感、能否有效的一項指標(biāo)。雖然目前的化療已經(jīng)取得了顯著療效，但是仍不能根治，其毒副作用、復(fù)發(fā)率高等缺點(diǎn)，迫使我們尋求新的路徑。中醫(yī)藥治療急性白血病具有一定的特色優(yōu)勢。扶正祛邪復(fù)方是本文通信作者周永明教授治療白血病的經(jīng)驗(yàn)方，在臨床使用中取得了一定的療效。本實(shí)驗(yàn)用不同質(zhì)量濃度的扶正祛邪復(fù)方對HL-60細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，觀察HL-60細(xì)胞的增殖及凋亡，為臨床療效提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 HL-60人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞（原粒細(xì)胞，懸浮生長），購自上海中科院細(xì)胞庫。

1.2 試劑與儀器 生物安全柜（Thermo，1386，USA）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，3111，USA）；倒置顯微鏡（Olympus，F(xiàn)SX100，Japan）；靜 音 混 合 器（Kylin-Bell，BS 223S，China）；電子分析天平（Sartorius，BT 25S，Germany）；超低溫冰箱（Thermo，PRIMO，USA）；紫外分光光度計（Thermo，1658001，USA）；流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter，Cytomicsfc500，USA）；多功能酶標(biāo)儀（BIOTEK，IX 51，USA）；恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；臺式離心機(jī)（Thermo，ND2000，USA）；微量移液器（北京大龍公司，China）；Cell Counting Kit-8細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒（Rainbio，R3000-4，China）；雙抗（MIULTICELL，450-201-EL，USA）；胎牛血清（FBS）（Hyclone，SH30084.03，USA）；細(xì)胞周期試劑盒（BD，51-66211E，USA）；Annexin V/FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（BD，556547，USA）；RPMI-1640培養(yǎng)基（Hyclone，SH30809.01，USA）；PBS 緩沖液（Hyclone，SH30022.01B，USA）；0.2 μm除菌濾網(wǎng)（Rephile，RJP3222SH）；流式管（FALCON，21115036，USA）。

1.3 扶正祛邪復(fù)方培養(yǎng)液的制備與分組 扶正祛邪中藥復(fù)方采用天江顆粒，方藥為太子參、炒白術(shù)、生地黃、制半夏、牡丹皮、炒黃柏、白花蛇舌草、半枝蓮、木饅頭、炒枳殼、炙甘草等。將中藥復(fù)方溶于RPMI-1640培養(yǎng)液中，配成100 mg/mL的復(fù)方中藥培養(yǎng)液。將裝有中藥藥液的玻璃杯置于水浴鍋中，加熱至100℃，并用玻璃棒勻速攪拌，充分混勻所有顆粒。用0.22 μm無菌濾器過濾至15mL離心管中，封口膜封口，當(dāng)作母液，4℃保存。實(shí)驗(yàn)時用RPMI-1640完全培養(yǎng)液稀釋成不同質(zhì)量濃度的扶正祛邪復(fù)方培養(yǎng)液，將pH值調(diào)整為7。對照組為正常RPMI-1640完全培養(yǎng)液；實(shí)驗(yàn)組質(zhì)量濃度依次為20、15、10、5、1 mg/mL的中藥復(fù)方培養(yǎng)液。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞換液遵循懸浮細(xì)胞換液的技術(shù)，完全遵守?zé)o菌操作，每2～3天換液1次，每次添加約5 mL的完全培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)液由10%胎牛血清、1%雙抗、RPMI-1640培養(yǎng)基組成，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×105/mL，置于5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 臺盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期HL-60細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，一共6組，每組設(shè)3個復(fù)孔，共接種3板。每孔加細(xì)胞懸液100 μL，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h，待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后，對照組加入培養(yǎng)基10 μL，各實(shí)驗(yàn)組每孔加入不同質(zhì)量濃度的扶正祛邪復(fù)方中藥液，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，在相應(yīng)時間點(diǎn)取出一板。用EP管收集各個孔中的細(xì)胞，室溫下1 000 r/min，離心5 min，棄上清，加入0.3 mL不含血清的培養(yǎng)基，吹打混勻后加入0.4%的臺盼藍(lán)溶液0.3 mL，輕輕混勻。2～3 min后，吸取10 μL細(xì)胞懸液，從細(xì)胞計數(shù)板邊緣滴入。死細(xì)胞被染成明顯的藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染呈無色透明狀。在低倍顯微鏡下計數(shù)活細(xì)胞的數(shù)量，并記錄。另取EP管中剩余細(xì)胞，分裝在96孔板中，在倒置顯微鏡中觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.6 CCK-8法檢測HL-60細(xì)胞的抑制 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物干預(yù)步驟同前一實(shí)驗(yàn)，在3個時間點(diǎn)分別取出培養(yǎng)板，每孔加入CCK-8試劑10 μL，振蕩后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h。將96孔板放入酶標(biāo)儀中，以空白組孔調(diào)零，在波長450 nm處測定各孔吸光度值，并計算抑制率。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測HL-60細(xì)胞周期、凋亡率 選取活力旺盛、呈現(xiàn)對數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞，用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基制成以2×106/mL濃度的單細(xì)胞懸液，以每孔1 mL接種于無菌6孔板，各空白組加入完全培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組每孔分別加入不同質(zhì)量濃度的扶正祛邪復(fù)方中藥液10 μL。在37℃、5% CO2及95%飽和濕度下，培養(yǎng)48 h后，離心，收集細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞周期檢測（按照試劑盒說明操作）。將收集的細(xì)胞用預(yù)冷PBS洗滌2次，1 000 r/min離心后棄上清，重懸細(xì)胞，倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整各組細(xì)胞數(shù)為1.0×106/mL。取不同質(zhì)量濃度扶正祛邪中藥液處理后的細(xì)胞樣本，使細(xì)胞數(shù)達(dá)到2×105～1×106個，1 000 r/min離心5 min，棄上清，收集個細(xì)胞，離心棄上清。用PBS洗滌1次，離心棄上清。加入1 mL DNA染色液和10 μL滲透液，渦旋振蕩5～10 s混勻。室溫避光孵育30 min。選擇最低上樣速度，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測細(xì)胞周期；細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)與中藥干預(yù)同前，收集細(xì)胞后首先按照凋亡試劑盒中的說明，進(jìn)行儀器的參數(shù)調(diào)節(jié)，然后進(jìn)行樣品的檢測。收集1×106個細(xì)胞，用預(yù)冷PBS離心洗滌2次，棄上清，稀釋工作液，用1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，每管加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI。輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育5 min。加入500 μL Apoptosis Po在流式細(xì)胞儀上，用空白管調(diào)節(jié)FSC、SSC和熒光通道的電壓，并在此電壓條件下，用單染管調(diào)節(jié)熒光通道的補(bǔ)償，然后樣品管進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差異性時用LSD法，涉及24、48、72 h增殖抑制率比較采用two-ways ANOVA。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臺盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)觀察各組白血病細(xì)胞形態(tài) 見圖1。本實(shí)驗(yàn)對臺盼藍(lán)染色后的細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行不同組別之間的比較，觀察扶正祛邪復(fù)方中藥對白血病細(xì)胞形態(tài)的影響。如圖1可見空白組白血病細(xì)胞懸浮生長，密度適中，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞質(zhì)均勻透亮，細(xì)胞核清晰，細(xì)胞未被染色為藍(lán)色，為透亮；而各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞隨藥物質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞密度逐漸下降，折光性減低，胞體逐漸變小，可見不同數(shù)量的被臺盼藍(lán)染為藍(lán)色的死細(xì)胞。隨著中藥質(zhì)量濃度的增加，被臺盼藍(lán)染色的細(xì)胞增多，說明中藥干預(yù)后的白血病細(xì)胞有凋亡現(xiàn)象，并隨著藥物質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞凋亡數(shù)目增加。

圖1 臺盼藍(lán)染色后各組細(xì)胞形態(tài)

2.2 臺盼藍(lán)染色細(xì)胞計數(shù)法檢測各組HL-60細(xì)胞抑制率 見表1。用細(xì)胞抑制率公式計算細(xì)胞生長抑制率，并以細(xì)胞生長抑制率對藥物質(zhì)量濃度繪制生長曲線。細(xì)胞抑制率＝［1-（實(shí)驗(yàn)組活細(xì)胞數(shù)/對照組活細(xì)胞數(shù)）］×100%。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。數(shù)據(jù)以重復(fù)測量方差分析，結(jié)果顯示：group與time的交互作用有統(tǒng)計學(xué)意義。時間因素方差分析的F值為29.69，P1＜0.05；分組因素方差分析的F值為28.65，P2＜0.01，說明時間層面，同一質(zhì)量濃度下隨著時間的延長扶正祛邪復(fù)方對HL-60細(xì)胞的抑制作用越強(qiáng)。同一時間點(diǎn)，不同質(zhì)量濃度組之間隨質(zhì)量濃度的增加，對白血病細(xì)胞的抑制率越高。

表1 臺盼藍(lán)染色細(xì)胞計數(shù)法檢測各組HL-60細(xì)胞抑制率（%，±s）

表1 臺盼藍(lán)染色細(xì)胞計數(shù)法檢測各組HL-60細(xì)胞抑制率（%，±s）

與空白組比較，*P＜0.05；同一時間點(diǎn)，與前一質(zhì)量濃度組比較，△P＜0.05；與本組前一時間點(diǎn)相比較，▲P＜0.05。下同

組別空白組中藥1 mg/mL組中藥5 mg/mL組中藥10 mg/mL組中藥15 mg/mL組中藥20 mg/mL組24 h 0.00±0.00 7.98±4.27*17.10±4.41△*19.07±8.46△*25.80±11.27△*30.57±5.70△*48 h 0.00±0.00 12.08±5.51*▲21.91±5.75△*▲27.85±8.16△*▲31.74±10.87△*▲35.97±7.57△*▲72 h 0.00±0.00 12.19±5.40*▲22.52±6.34△*▲28.22±4.13△*▲37.63±4.14△*▲42.41±2.37△*▲

2.3 CCK-8法檢測各組HL-60細(xì)胞的抑制 見表2。測定各孔吸光度值，并計算抑制率，結(jié)果以重復(fù)測量方差分析，時間因素方差分析的F值為118.9，P1＜0.01；分組因素方差分析的F值為365.4，P2＜0.01，說明時間層面，同一質(zhì)量濃度下，隨著時間的延長扶正祛邪復(fù)方對HL-60細(xì)胞的抑制率越高；同一時間點(diǎn)，各不同質(zhì)量濃度組之間隨扶正祛邪復(fù)方質(zhì)量濃度的增加，對白血病細(xì)胞HL-60的抑制率越高，說明扶正祛邪復(fù)方對HL-60細(xì)胞活性具有抑制作用，且呈一定的質(zhì)量濃度與時間的依賴性。

表2 CCK-8法檢測各組HL-60細(xì)胞的抑制率（%，±s）

表2 CCK-8法檢測各組HL-60細(xì)胞的抑制率（%，±s）

組別空白組中藥1 mg/mL組中藥5 mg/mL組中藥10 mg/mL組中藥15 mg/mL組中藥20 mg/mL組24 h 0.00±0.00 4.30±1.90*10.41±2.61△*13.24±0.89△*15.80±1.99△*25.7±1.82△*48 h 0.00±0.00 8.46±0.87*▲16.45±2.13△*▲24.29±2.56△*▲29.97±3.80△*▲36.94±0.72△*▲72 h 0.00±0.00 11.49±1.43*▲18.62±1.73△*▲28.34±2.08△*▲35.60±3.13△*▲42.56±2.33△*▲

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組HL-60細(xì)胞周期和凋亡見表3，圖2。采用流式儀檢測扶正祛邪復(fù)方干預(yù)白血病HL-60細(xì)胞對細(xì)胞周期及凋亡的影響。經(jīng)單因素方差分析，與空白組比較，復(fù)方中藥組可將HL-60白血病細(xì)胞周期阻滯于G1期，S期的細(xì)胞比例減少（P＜0.05），并且隨著質(zhì)量濃度的增高，對白血病細(xì)胞周期的阻滯作用越強(qiáng)。可以誘導(dǎo)HL-60白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡（P＜0.05），且隨著中藥質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞凋亡率越高，具有一定的質(zhì)量濃度依賴性。

圖2 各組HL-60細(xì)胞周期比較

表3 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組HL-60細(xì)胞周期和凋亡（%，±s）

表3 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組HL-60細(xì)胞周期和凋亡（%，±s）

與空白組比較，*P＜0.05；與中藥1 mg/mL組比較，△P＜0.05；與中藥5 mg/mL組比較，○P＜0.05；與中藥10 mg/mL組比較，▲P＜0.05；與中藥15 mg/mL組比較，◆P＜0.05

組 別G1期S期G2期 凋亡率空白組中藥1 mg/mL組中藥5 mg/mL組中藥10 mg/mL組中藥15 mg/mL組中藥20 mg/mL組39.51±2.53 42.17±2.89*47.02±1.48*△49.46±0.64*△○57.27±2.20*△○▲64.28±4.06*△○▲◆51.48±1.68 46.88±1.53*41.08±1.45*△35.02±2.34*△○28.63±4.79*△○▲23.99±3.54*△○▲◆9.02±1.53 10.96±4.36 11.91±1.73 15.52±1.98 14.10±2.99 11.73±1.37 7.04±5.34 10.38±2.76 14.31±1.60*△19.29±5.76*△○30.00±13.56*△○▲38.27±8.17*△○▲

3 討論

細(xì)胞的增殖和凋亡的動態(tài)平衡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，白血病的發(fā)病也是如此。細(xì)胞凋亡是腫瘤機(jī)制研究的常見方向與切入點(diǎn)。所謂細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞程序性的死亡，也就是說細(xì)胞受到一定的基因調(diào)控，按照一定的程序進(jìn)行自殺性的死亡［1］。細(xì)胞凋亡不是病理性細(xì)胞死亡，而是另一種生理過程。正常情況下，細(xì)胞凋亡使機(jī)體細(xì)胞數(shù)量保持一定的相對平衡，維持著人體穩(wěn)態(tài)。細(xì)胞凋亡機(jī)制受到一定的抑制時，就會相對地導(dǎo)致細(xì)胞增殖的過度。在白血病的發(fā)病與進(jìn)展中，白血病細(xì)胞的失控性增殖是造成病情迅速惡化與進(jìn)展的主要原因，而化療藥物一般就是通過誘導(dǎo)凋亡來抑制白血病細(xì)胞的過度增殖。中藥干預(yù)HL-60細(xì)胞誘導(dǎo)其凋亡，主要與PI3K/Akt通路、Wnt/β-catenin通路、Fas/CD95通路、RaF/MEK/ERK通路、ERK/MAPK通路等細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)揮作用［2-3］。其中PI3K/Akt通路、Wnt/β-catenin通路為目前在腫瘤中研究最為廣泛的信號通路，通過藥物手段或基因干擾抑制該兩條通路的活化均具有較好的抗腫瘤效果［4-5］。這些通路通常與Caspase激活（包括Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性變化）、BAX蛋白表達(dá)、BCL-2蛋白表達(dá)、Cyt-C蛋白表達(dá)、c-myc蛋白、DR5的表達(dá)［6-8］等相關(guān)。通過對文獻(xiàn)的閱讀發(fā)現(xiàn)，大部分中藥都是多靶點(diǎn)地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，通過對不同蛋白、基因的表達(dá)來調(diào)控信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞周期是一個細(xì)胞從一次分裂完成開始到下次細(xì)胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程。細(xì)胞分裂過程異?？赡軐?dǎo)致腫瘤的發(fā)生，細(xì)胞的快速生長和分裂是所有腫瘤細(xì)胞的共同特征。而細(xì)胞周期蛋白是細(xì)胞周期調(diào)控因子中最重要的蛋白之一，這些周期調(diào)控蛋白包括CDC2、CDC7、CDC23、MCAK、mki67a和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ等［9］。這些不僅是正常細(xì)胞功能所需的，而且是癌細(xì)胞增殖過程中的重要參與者，其異常表達(dá)可能引發(fā)腫瘤。在白血病中，miR-375-HOXB3-CDCA3/DNMT3B調(diào)節(jié)通路在疾病進(jìn)展中起重要作用，在該通路中調(diào)低HOXB3表達(dá)可降低CDCA3表達(dá)，從而抑制白血病細(xì)胞增殖［10］。

扶正祛邪方是以扶正、祛邪并舉的驗(yàn)方，祛邪不忘扶正，正安則可達(dá)邪。全方諸藥配伍，清補(bǔ)兼施，益氣養(yǎng)陰、清解邪毒。大量臨床應(yīng)用中，本方能改善患者的生存質(zhì)量，抑制患者化療期間的嘔吐、骨髓抑制等毒副作用，具有增效減毒之功效。本方中的單味中藥都具有一定的抗腫瘤作用。其中有研究表明［11］白術(shù)內(nèi)酯能抑制白血病細(xì)胞HL-60的增殖活性，抑制小鼠白血病模型中白血病細(xì)胞P-388的活力，說明白術(shù)內(nèi)酯具有一定的抗腫瘤作用。何立麗等［12］發(fā)現(xiàn)半夏可以調(diào)節(jié)抑癌基因表達(dá)、降低細(xì)胞毒性、阻斷細(xì)胞增殖信號、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲、化療增敏、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、逆誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用。Yin等［13］通過流式細(xì)胞分析法發(fā)現(xiàn)丹皮酚100、200 mg/L組細(xì)胞凋亡率顯著升高，且促凋亡蛋白的水平顯著增高。有研究者通過對乳腺癌紫杉醇多藥耐藥細(xì)胞株（MCF-7/PTX）的研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚可以誘導(dǎo)乳腺癌多重耐藥細(xì)胞株的凋亡［14-15］。扶正祛邪復(fù)方具有一定的抗腫瘤的藥理學(xué)依據(jù)。

基于白血病細(xì)胞的增殖與凋亡的平衡，我們進(jìn)行了上述實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示扶正祛邪復(fù)方對細(xì)胞活性有著明顯的抑制作用。為進(jìn)一步探討本方抑制白血病細(xì)胞的存活能力是否與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期有關(guān)，本研究使用流式細(xì)胞儀檢測了不同質(zhì)量濃度中藥干預(yù)后的白血病細(xì)胞的凋亡變化和周期變化。結(jié)果顯示扶正祛邪復(fù)方干預(yù)白血病細(xì)胞，對細(xì)胞活性有明顯的抑制作用，存在細(xì)胞凋亡，而隨著中藥質(zhì)量濃度的增加，凋亡的細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，早期凋亡與晚期凋亡的細(xì)胞都有表現(xiàn)。這說明扶正祛邪復(fù)方能誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的凋亡，且呈劑量依賴性。通過PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測白血病細(xì)胞周期的變化，結(jié)果顯示不同質(zhì)量濃度的扶正祛邪復(fù)方處理白血病細(xì)胞后，均可以使細(xì)胞周期阻滯在G1期，S期的細(xì)胞比例相對減少，且隨著扶正祛邪復(fù)方質(zhì)量濃度的增加，阻滯在G1期的白血病細(xì)胞數(shù)目也逐漸增加，相對的S期的白血病細(xì)胞數(shù)目也逐漸減少。由此得出本扶正祛邪復(fù)方能抑制人白血病細(xì)胞HL-60的增殖，其作用機(jī)制可能與影響細(xì)胞周期及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)。