超飽和體系改善阿昔洛韋脂肪酸酯前體藥物的透皮遞送

周燁 張琴 顧悅 金怡蘭 許曉樂(lè) 陳勇

中圖分類(lèi)號(hào) R944.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）16-1975-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.16.10

摘 要 目的：制備親脂性阿昔洛韋（ACV）前體藥物的超飽和體系，增加ACV的皮膚生物利用度。方法：采用酸酐?；ê铣葾CV的乙酸酯（ACV-Ace）、丁酸酯（ACV-But）和己酸酯（ACV-Hex）等3種ACV前體藥物。使用核磁共振氫譜、高分辨質(zhì)譜確證ACV及3種ACV前體藥物的結(jié)構(gòu);采用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定ACV及3種ACV前體藥物的濃度，并計(jì)算其在不同體積分?jǐn)?shù)的丙二醇-水溶液中的飽和溶解度，篩選出超飽和體系形成潛力最大的化合物。通過(guò)共溶劑法制備該化合物的超飽和體系，并采用光學(xué)顯微鏡觀(guān)察羥丙基甲基纖維素E3（HPMC E3）對(duì)其物理穩(wěn)定性的影響。采用立式Franz擴(kuò)散池研究超飽和度（DS）和HPMC E3對(duì)該超飽和體系在離體豬皮上作用1 h后藥物皮膚蓄積量的影響，采用冷凍層切-分層定量法測(cè)定使用上述超飽和體系和上市阿昔洛韋乳膏1 h后藥物在離體豬皮中的分布情況。結(jié)果：3種ACV前體藥物均被成功合成。建立的定量方法符合生物樣品分析要求。在3種前體藥物中，ACV-Hex顯示出最小的水飽和溶解度[（0.5±0.0） mmol/L]和最大的丙二醇飽和溶解度[（53.4±14.2） mmol/L]，具備形成具有較高DS的超飽和體系的潛力。在10%丙二醇-水體系中，HPMC E3的加入可保證DS不超過(guò)4的ACV-Hex超飽和體系在1 h內(nèi)保持物理穩(wěn)定。含有HPMC E3的DS為4的ACV-Hex超飽和體系作用1 h后的總皮膚蓄積量（ACV+ACV-Hex）高于DS<4或不含HPMC E3的ACV-Hex超飽和體系作用后的總皮膚蓄積量;另外，上述超飽和體系滲透進(jìn)入基底表皮層（皮膚厚度為100～160 μm）的ACV量顯著高于上市藥品阿昔洛韋乳膏（P<0.05）。結(jié)論：ACV的親脂性前體藥物ACV-Hex可在HPMC E3存在下，于10%丙二醇-水體系中形成穩(wěn)定的DS為4的超飽和體系;其作用于離體皮膚1 h后可在基底表皮層蓄積較高濃度的ACV，可能對(duì)局部治療單純皰疹病毒皮膚感染具有一定價(jià)值。

關(guān)鍵詞 阿昔洛韋;親脂性前體藥物;超飽和體系;皮膚感染;單純皰疹病毒

Improvement of Transdermal Delivery of Aciclovir Aliphatic Ester Prodrugs by Using Supersaturated System

ZHOU Ye1，ZHANG Qin1，2，GU Yue1，JIN Yilan1，XU Xiaole1，CHEN Yong1，3（1. School of Pharmacy， Nantong University， Jiangsu Nantong 226001， China; 2. Nantong Food and Drug Supervision and Inspection Center， Jiangsu Nantong 226005， China; 3. Nantong Novast Pharmaceutical Ltd.， Jiangsu Nantong 226009， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To prepare supersaturated system of lipophilic aciclovir （ACV） prodrug， and to increase the cutaneous bioavailability of ACV. METHODS： Three prodrugs of ACV were synthesized by anhydride acylation， i.e. aciclovir acetate （ACV-Ace），butyrate （ACV-But） and hexanoate （ACV-Hex）. The structures of ACV and three ACV prodrugs were confirmed by 1H-NMR and HRESI-MS; the concentrations of ACV and three ACV prodrugs were determined by UPLC-triple quadrupole tandem mass spectrometry， and saturated solubility of them in different volume fractions of propylene glycol-water solution was calculated. The compound with the greatest potential of form supersaturated system was screened out. The supersaturated system of that compound was prepared by co-solvent method. The effect of hydroxypropyl methylcellulose E3 （HPMC E3） on its physical stability was observed by light microscope. Vertical Franz diffusion cells were used to study the effects of degree of supersaturation （DS） and HPMC E3 on the deposited amount of drug in the excised porcine skin after using the supersaturated system for 1 h. The distribution of ACV in the excised porcine skin was determined by frozen slicing stratified quantitative method after using the supersaturated system and marketed aciclovir cream for 1 h. RESULTS： Three ACV prodrugs were successfully synthesized. The established quantification methods met the requirements of biological sample analysis. Among all of the three ACV prodrugs，ACV-Hex showed the lowest saturated solubility in water [（0.5±0.0）mmol/L] and the highest saturated solubility in propylene glycol [（53.4±14.2）mmol/L]， which made it potentially feasible to form supersaturated system with high DS. In 10% propylene glycol-water system， the addition of HPMC E3 enabled ACV-Hex supersaturated systems， with DS no more than 4， to maintain physical stability within 1 h. The total deposited amount （ACV+ACV-Hex） in skin after the application of ACV-Hex supersaturated system with DS of 4 for 1 h was higher than that after the application of ACV-Hex supersaturated system with DS less than 4 or without HPMC E3. In addition， the concentration of ACV in the basal epidermis （skin thickness was 100-160 mm） by supersaturated system was significantly higher than that of the marketed aciclovir cream （P<0.05）. CONCLUSIONS： ACV-Hex， the lipophilic prodrug of ACV， can form stable supersaturated system with DS of 4 in 10% propylene glycol-water system in the presence of HPMC E3. High concentration of ACV could be accumulated in the basal epidermis after the skin was exposed to supersaturated system for 1 h， which may be valuable for local treatment skin infection of herpes simplex virus.

KEYWORDS? ?Aciclovir; Lipophilic prodrug; Supersaturated system; Skin infection; Herpes simplex virus

阿昔洛韋（aciclovir，ACV）是一種無(wú)環(huán)嘌呤核苷類(lèi)似物，可高效抑制單純皰疹病毒（HSV），臨床用于治療皮膚、黏膜等部位的HSV感染[1]。ACV的口服生物利用度較低（10%～20%）[2]，需較大的口服劑量（約1 g/d）[3]，存在誘發(fā)腎衰竭的風(fēng)險(xiǎn)[4];而靜脈注射給藥可能誘發(fā)靜脈炎[5]，使其臨床應(yīng)用受到一定限制。由于HSV可在感染前趨癥狀期于皮膚基底表皮層大量復(fù)制[6]，若能使ACV經(jīng)皮擴(kuò)散至該部位，理論上可實(shí)現(xiàn)直接靶向治療，降低ACV的全身暴露量。但ACV的親脂性差（Log P=-1.57）[7]，且水溶性亦差[水溶解度約0.2%（m/V，37 ℃）][8]，導(dǎo)致其外用時(shí)難以透過(guò)角質(zhì)層到達(dá)靶部位，因此ACV的臨床治療效果有限[9-10]。

超飽和體系是通過(guò)提高藥物在溶劑中的熱力學(xué)活度，從而增加藥物的釋放及透皮驅(qū)動(dòng)力，最終達(dá)到促滲的目的，具有促滲效果明顯、成本低廉和使用方便等優(yōu)點(diǎn)[11]。在實(shí)驗(yàn)室條件下，超飽和體系可通過(guò)共溶劑法快速制備，但前提條件是脂溶性目標(biāo)化合物需要在溶劑A（一般為可與水混溶的有機(jī)溶劑，如乙醇、丙二醇等）中的溶解度較好，而在溶劑B（一般為水）中的溶解度差。制備時(shí)，首先將目標(biāo)化合物溶于溶劑A中，再將上述溶液以一定比例與溶劑B混合，在混合瞬間，理論上能產(chǎn)生一系列超飽和度可知的超飽和體系[12]。然而，因ACV的水溶性和脂溶性均較差，導(dǎo)致了其難以通過(guò)該法形成超飽和體系。故筆者設(shè)想，若將ACV制成脂溶性前體藥物，使其在水中和有機(jī)溶劑中的溶解度差距拉大，則有可能利用共溶劑法形成ACV前體藥物的超飽和體系。前體藥物經(jīng)皮吸收后，通過(guò)皮膚酶水解作用釋放原藥ACV，從而在皮膚靶部位起效。鑒于此，本研究擬合成和篩選適宜的ACV脂溶性前體藥物，并通過(guò)共溶劑法將其制備成超飽和體系，以使具有高熱力學(xué)活度的ACV脂溶性前體藥物更易透皮吸收，從而增加ACV的皮膚局部生物利用度，并促進(jìn)ACV遞送至基底表皮層，以期為提高現(xiàn)有ACV皮膚外用制劑的生物利用度提供新的思路。

1 材料

1.1 主要儀器

Acquity?型超高效液相色譜儀串聯(lián)Xevo?型三重四極桿質(zhì)譜儀購(gòu)自美國(guó)Waters公司;Gemini NMR 300 MHz型核磁共振波譜儀購(gòu)自美國(guó)Varian公司;API QSTAR? Pulsar ESI-Qtof型高分辨質(zhì)譜（HRESI-MS）儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司;立式Franz擴(kuò)散池由南通科華玻璃儀器有限公司定做，有效擴(kuò)散面積為2.0 cm2;Thomas Stadie-Riggs型真皮刀組件購(gòu)自美國(guó)Thomas Scientific公司;YS-100型三目顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司;HM 560 Cryostat型切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Microm公司;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購(gòu)自上海亞榮生化儀器廠(chǎng);HZS-H型恒溫水浴振蕩器購(gòu)自哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司;HHS-11-4型電熱恒溫水浴鍋購(gòu)自海門(mén)市恒昌儀器廠(chǎng);TGL-16B型離心機(jī)購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng);Milli-Q Advantage A10型超純水儀購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.2 主要藥品與試劑

ACV原料藥（批號(hào)180423，純度>99%）購(gòu)自武漢東康源科技有限公司;阿昔洛韋乳膏（批號(hào)317005，規(guī)格5%）購(gòu)自福建省三明天泰制藥有限公司;羥丙基甲基纖維素E3（HPMC E3，批號(hào)7088323）購(gòu)自日本Shin-Etsu公司;乙腈（批號(hào)20095282，色譜純）購(gòu)自美國(guó)TEDIA試劑公司;丙二醇（批號(hào)20171230，分析純）購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠(chǎng);柱層析硅膠（粒徑100～200目，批號(hào)0180172）購(gòu)自青島海洋化工廠(chǎng);OCT冰凍切片包埋劑購(gòu)自美國(guó)Sakura公司;其余試劑均為分析純，水為超純水（電阻率>18 MΩ·cm）。

1.3 動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為雄性尤卡坦豬，體質(zhì)量為100～150 kg，購(gòu)自南通市港閘區(qū)永興生豬廠(chǎng)，動(dòng)物防疫條件合格證號(hào)為（蘇通）動(dòng)防合字第20180151號(hào)。

2 方法與結(jié)果

2.1 ACV前體藥物的合成

采用酸酐酰化法合成ACV前體藥物。將ACV原料藥1.0 g加熱溶解于二甲基甲酰胺（DMF）105 mL中，自然降溫至50 ℃，分別滴加含乙酸酐2.3 g、丁酸酐3.5 g或己酸酐4.8 g的無(wú)水吡啶溶液30 mL。反應(yīng)15 h后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（真空度0.09 MPa，溫度80 ℃）除去DMF，所得物質(zhì)經(jīng)少量甲醇溶解后，與柱層析硅膠5 g混合均勻，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（真空度0.09 MPa、溫度50 ℃，下同）除去甲醇。將所得固態(tài)粉末分別加入已裝填柱層析硅膠50 g的玻璃層析柱中，以二氯甲烷-甲醇（10 ∶ 1～20 ∶ 1，V/V）進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液，采用薄層色譜法（TLC）進(jìn)行產(chǎn)物鑒定，合并相同洗脫部分的洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，分別得到ACV前體藥物ACV-Ace 0.97 g、ACV-But 0.67 g和ACV-Hex 1.11 g，產(chǎn)率分別為82%、51%和77%。上述產(chǎn)物均為白色粉末狀固體;經(jīng)高效液相色譜-紫外法（λ=254 nm）檢測(cè)，其純度均大于98%。

2.2 ACV及ACV前體藥物的結(jié)構(gòu)確證

通過(guò)核磁共振氫譜（1H-NMR）和HRESI-MS確證ACV及3種前體藥物的結(jié)構(gòu)及分子量。1H-NMR譜圖中各信號(hào)峰的歸屬以及HRESI-MS的計(jì)算值（Calc.）和實(shí)測(cè)值（Exp.）如下：

2.2.1 ACV 分子式為C8H11N5O3。1H-NMR（DMSO-d6，300 MHz）δ：3.46（m，4H，12-H，13-H），4.67（s，1H，13-OH），5.34（s，2H，10-H），6.50（s，2H，2-NH2），7.80（s，1H，8-H），10.63（s，1H，1-NH）。HRESI-MS[M+H]+：Calc. 226.093 5，Exp. 226.093 1。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故確定為ACV。

2.2.2 ACV-Ace 分子式為C10H13N5O4。 1H-NMR（DMSO- d6，300 MHz）δ：1.94（s，3H，2?-H），3.65（m，2H，12-H），4.07（m，2H，13-H），5.33（s，2H，10-H），6.54（s，2H，2-NH2），7.80（s，1H，8-H），10.67（s，1H，1-NH）。HRESI- MS[M+H]+：Calc. 268.104 0，Exp. 268.104 1。

2.2.3 ACV-But 分子式為C12H17N5O4。 1H-NMR（DMSO- d6，300 MHz）δ：0.86（m，3H，4′-H），1.49（m，2H，3′-H），2.21（m，2H，2′-H），3.67（m，2H，12-H），4.10（m，2H，13-H），5.34（s，2H，10-H），6.52（s，2H，2-NH2），7.81（s，1H，8-H），10.63（s，1H，1-NH）。HRESI-MS[M+H]+：Calc. 296.135 3，Exp. 296.135 3。

2.2.4 ACV-Hex 分子式為C14H21N5O4。 1H-NMR（DMSO- d6，300 MHz）δ：0.85（m，3H，6′-H），1.24（m，4H，4′-H，5′-H），1.47（m，2H，3′-H），2.22（m，2H，2′-H），3.67（m，2H，12-H），4.10（m，2H，13-H），5.34（s，2H，10-H），6.51（s，2H，2-NH2），7.84（s，1H，8-H），10.62（s，1H，1-NH）。HRESI-MS[M+H]+：Calc. 324.166 6，Exp. 324.166 1。

2.3 ACV及ACV前體藥物含量的測(cè)定

采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)定[13]。

2.3.1 檢測(cè)條件 （1）色譜條件：色譜柱為Waters XBridge?BEH C18（50 mm×2.1 mm，2.5 μm），配備Waters XBridge? BEH C18保護(hù)柱（5 mm×2.1 mm，2.5 μm）;流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液-乙腈（70 ∶ 30，V/V）;柱溫為30 ℃;流速為0.2 mL/min;進(jìn)樣量為5 μL;樣品管理器溫度為8 ℃。（2）質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（ESI）在正離子模式下檢測(cè)，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式進(jìn)行掃描;毛細(xì)管電壓為2.5 kV;錐孔電壓為31 V;離子源溫度為160 ℃;脫溶劑氣體（氮?dú)猓囟葹?50 ℃，脫溶劑氣體流量為650 L/h;錐孔氣流量為50 L/h;碰撞氣體為氬氣，碰撞能量為19 eV;定量監(jiān)測(cè)離子對(duì)為m/z 226.2→152.0（ACV）、m/z 268.1→152.0（ACV-Ace）、m/z 296.1→152.0（ACV-But）、m/z 324.2→152.0（ACV-Hex）。

2.3.2 樣品的制備 （1）空白皮膚提取液：將新鮮小豬皮膚（按“2.6”項(xiàng)下皮膚處理方法操作所得）剪碎，置于玻璃瓶中，加入流動(dòng)相，置于磁力攪拌器上攪拌1 h，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得空白皮膚提取液樣品。（2）供試品溶液：分別精密稱(chēng)取ACV或ACV前體藥物適量于量瓶中，用流動(dòng)相溶解并制成濃度均為5 μmol/L的貯備液。分別精密量取上述各貯備液適量，以流動(dòng)相稀釋成濃度分別為1 000、750、500、200、100、75、50和15 nmol/L的系列供試品溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察 按生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則進(jìn)行方法學(xué)考察[13]。專(zhuān)屬性試驗(yàn)結(jié)果顯示，空白皮膚對(duì)ACV或ACV前體藥物的測(cè)定均無(wú)干擾，提示本方法的專(zhuān)屬性較好。以待測(cè)物的峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到ACV的線(xiàn)性方程為Y=838.3 X-326.4（r=0.998 6）、ACV-Ace為Y=1 028.6X-579.8（r=0.994 5）、ACV-But為Y=687.4X-308.2（r=0.991 8）、ACV-Hex為Y=773.1 X-337.4（r=0.992 9），各化合物均在15～1 000 nmol/L濃度范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，定量下限均為15 nmol/L。取定量下限（15 nmol/L）和低、中、高濃度（100、500和800 nmol/L）ACV和ACV前體藥物的樣品溶液進(jìn)行方法精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)。結(jié)果，日內(nèi)、日間精密度試驗(yàn)的RSD均小于1%（n=3）、準(zhǔn)確度[（實(shí)際濃度/理論濃度）×100%]為95.47%～103.72%（RSD<1.0%，n=6），提示方法的精密度和準(zhǔn)確度均較好。各待測(cè)物的提取回收率均超過(guò)90%（RSD<6.5%，n=6）。各待測(cè)物的基質(zhì)因子介于0.96～1.08之間，RSD≤7.33%（n=6），提示該方法無(wú)明顯的離子抑制或增強(qiáng)效應(yīng)。取上述以空白皮膚提取液配制的ACV和ACV前體藥物供試品溶液，分別考察其在室溫下放置10 h、反復(fù)凍融（-20 ℃～室溫）3次、-20 ℃冰箱中保存45 d，考察ACV和ACV前體藥物的穩(wěn)定性，結(jié)果ACV和ACV前體藥物在上述3種條件下放置后含量的RSD≤1.35%（n=6），表明兩者在上述條件下的穩(wěn)定性較好。

2.4 ACV和ACV前體藥物飽和溶解度的測(cè)定

配制一系列體積分?jǐn)?shù)為10%～90%的丙二醇-水溶液。分別將過(guò)量的ACV或ACV前體藥物加入至上述系列丙二醇-水溶液以及水（丙二醇體積分?jǐn)?shù)為0）和丙二醇（丙二醇體積分?jǐn)?shù)為100%）中，在32 ℃下攪拌30 h。將各混懸液以10 000 r/min離心15 min后，取上清液，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過(guò)，續(xù)濾液用甲醇-水溶液（3 ∶ 7，V/V）適當(dāng)稀釋?zhuān)ㄏ♂尡稊?shù)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，以保證測(cè)定結(jié)果在線(xiàn)性范圍內(nèi)為標(biāo)準(zhǔn)）后，分別按“2.3.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并代入線(xiàn)性方程，計(jì)算ACV和ACV前體藥物的濃度，再根據(jù)各樣品的稀釋倍數(shù)計(jì)算其飽和溶解度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，ACV在水和丙二醇中的飽和溶解度分別為（10.3±0.1）、（28.4±0.1） mmol/L，飽和溶解度曲線(xiàn)變化幅度不大;與ACV相比，ACV-Ace在不同體積分?jǐn)?shù)丙二醇-水溶液中的飽和溶解度曲線(xiàn)變化較平緩。因此，ACV和ACV-Ace均不適合通過(guò)共溶劑法制備超飽和體系。ACV-But和ACV-Hex的飽和溶解度曲線(xiàn)隨著丙二醇體積分?jǐn)?shù)的增加出現(xiàn)了明顯的上升趨勢(shì)，二者在水中的飽和溶解度極低[（2.4±0.1）、（0.5±0.0）mmol/L]，但在丙二醇中的飽和溶解度分別達(dá)到了（51.4±2.1）、（53.4±14.2） mmol/L。這提示ACV-But和ACV-Hex在不同體積分?jǐn)?shù)丙二醇-水溶液中的飽和溶解度有較大差異，二者有可能通過(guò)共溶劑法制備超飽和體系。

2.5 ACV前體藥物超飽和體系的構(gòu)建

2.5.1 最大理論超飽和度的計(jì)算 本研究通過(guò)測(cè)定最大理論超飽和度（DSmax）來(lái)評(píng)估各化合物在理論上能形成超飽和體系的最大潛力[12]。分別將含ACV或ACV前體藥物的丙二醇飽和溶液與水按照體積比1 ∶ 9、2 ∶ 8、……、9 ∶ 1混合，計(jì)算其在混合瞬間所形成的理論濃度α（α=丙二醇溶液中某化合物的摩爾量/與水混合后體系的總體積）。由于在特定混合比例下某化合物的實(shí)際溶解度（β）已通過(guò)“2.4”項(xiàng)下飽和溶解度實(shí)驗(yàn)予以測(cè)定，因此可通過(guò)下式計(jì)算各混合比例下的DSmax ∶ DSmax=（α-β）/β[12]。DSmax計(jì)算的示意圖見(jiàn)圖2。

分別按上述方法計(jì)算ACV及3種ACV前體藥物的DSmax，并繪制ACV和ACV前體藥物在不同體積分?jǐn)?shù)丙二醇-水溶液中DSmax的變化曲線(xiàn)，詳見(jiàn)圖3。由圖3可知，ACV和ACV-Ace的DSmax曲線(xiàn)均處于較低位置，且變化幅度較小;ACV-But和ACV-Hex的DSmax曲線(xiàn)變化明顯，且隨著丙二醇體積分?jǐn)?shù)的增加，兩者的DSmax均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)丙二醇體積分?jǐn)?shù)介于20%～40%時(shí)，ACV-But的DSmax曲線(xiàn)處于較高位，DSmax分別為3.1±0.2、3.3±0.1、3.0±0.2（丙二醇體積分?jǐn)?shù)分別為20%、30%和40%）。當(dāng)丙二醇體積分?jǐn)?shù)介于10%～30%時(shí)，ACV-Hex的DSmax曲線(xiàn)處于較高位，DSmax分別為10.5±3.2、12.3±4.6和12.0±3.4（丙二醇體積分?jǐn)?shù)分別為10%、20%和30%）?？梢?jiàn)，4種化合物形成超飽和體系的潛力大小依次為ACV-Hex>ACV-But>ACV≈ACV-Ace?？紤]到ACV-Hex形成超飽和體系的潛力最大，也就是實(shí)際能形成的DS[DS=（實(shí)際濃度/飽和溶解度）×100%]的范圍較寬，故本研究最終確定ACV-Hex為最優(yōu)的超飽和體系候選前體藥物，并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.5.2 ACV-Hex超飽和體系的構(gòu)建 采用共溶劑法制備ACV-Hex超飽和體系。

（1）溶液體系的確定。由“2.4”“2.5.1”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)丙二醇體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，ACV-Hex的飽和溶解度為（0.56±0.03） mmol/L、DSmax>10。由于在該條件下所用丙二醇的量較少，且形成的DSmax較高，因此本研究決定使用10%丙二醇-水溶液體系來(lái)制備ACV-Hex超飽和體系。

（2）抗成核高分子材料HPMC E3對(duì)ACV-Hex超飽和體系物理穩(wěn)定性的影響。由于超飽和體系為熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，故使用共溶劑法制備時(shí)，常需先在水相中加入一些抗成核高分子材料來(lái)抑制結(jié)晶形成[11-12]。鑒于此，本研究在水相中加入1%（m/V）抗成核高分子材料HPMC E3，并考察其對(duì)具有不同DS的ACV-Hex溶液的成核抑制作用[12]：精密稱(chēng)取ACV-Hex 1.29 g，置于100 mL量瓶中，加入10%丙二醇-水溶液溶解并定容，得濃度為40.0 mmol/L的ACV-Hex貯備液。取該貯備液適量，用10%丙二醇-水溶液逐級(jí)稀釋?zhuān)瞥葾CV-Hex濃度分別為2.8、5.6、11.2、16.9、22.5和28.0 mmol/L的系列溶液。取1 mL上述系列溶液（丙二醇的密度約為1.04 g/mL，與水接近），加入到9 mL含或者不含1%HPMC E3的水溶液中，混合均勻（混合后體積按10 mL計(jì)），即得系列ACV-Hex超飽和體系。在上述溶液混合瞬間，ACV-Hex的理論濃度分別為0.28、0.56、1.12、1.69、2.25和2.80 mmol/L，DS分別為0.5、1、2、3、4和5。將制備得到的系列超飽和體系迅速密封，于32 ℃水浴中靜置1 h，然后在顯微鏡下觀(guān)察，若在視野中出現(xiàn)清晰的棱角分明的晶體，則視為該溶液不穩(wěn)定。結(jié)果，當(dāng)DS為0.5和1時(shí)，添加或不添加HPMC E3的ACV-Hex超飽和體系在制備1 h后均澄清、透明;當(dāng)DS≥2且不添加HPMC E3時(shí)，ACV-Hex超飽和體系在制備1 h后均觀(guān)察到有晶體出現(xiàn)。與之相比，添加HPMC E3且DS≤4的所有ACV-Hex超飽和體系在制備1 h后仍保持澄清、透明，表明添加HPMC E3可以顯著提高ACV-Hex超飽和體系的物理穩(wěn)定性，在1 h內(nèi)可有效抑制該超飽和體系的成核和結(jié)晶行為，從而得以維持體系內(nèi)分子的熱力學(xué)活度。當(dāng)DS=5時(shí)，在剛剛混合后即出現(xiàn)了白色沉淀，表明即便添加HPMC E3也不能有效維持處在這個(gè)DS下溶液的物理穩(wěn)定性。這提示，在DS≤4的ACV-Hex超飽和體系中，加入1%HPMC E3可以在一定時(shí)間內(nèi)有效維持體系的物理穩(wěn)定性，抑制ACV-Hex的快速沉淀。DS為4的ACV-Hex超飽和體系物理穩(wěn)定性觀(guān)察的顯微圖見(jiàn)圖4。

2.6 ACV-Hex超飽和體系的被動(dòng)透皮實(shí)驗(yàn)

使用新鮮豬皮和立式Franz擴(kuò)散池進(jìn)行透皮實(shí)驗(yàn)。用手術(shù)刀將新鮮豬耳外側(cè)皮膚剝離，于-20 ℃冰箱中冷凍保存（保存時(shí)間不超過(guò)1個(gè)月），備用。實(shí)驗(yàn)前，將豬皮置于0.9%氯化鈉溶液中解凍約10 min，以濾紙吸去多余水分，然后剃除豬毛，剪成直徑約3 cm的圓形皮膚樣本，再用真皮刀削去脂肪及部分真皮組織，最終得厚度約為1 mm的皮膚樣本。將處理好的皮膚樣本緊密固定在給藥池和接收池之間，接收池中加入磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）10 mL，恒速（200 r/min）攪拌;接收池外水浴溫度保持在32 ℃。給藥池中加入0.9%氯化鈉溶液1 mL，平衡20 min后移除，用水洗滌2次。按照“2.5.2（2）”項(xiàng)下方法分別制備添加或不添加HPMC E3的DS為0.5～4的ACV-Hex超飽和體系，并立即取各溶液0.5 mL分別加至給藥池中，迅速用封口膜密封給藥池并開(kāi)始計(jì)時(shí)。此時(shí)，在給藥池中的藥物量分別為0.07（DS=0.5）、0.14（DS=1）、0.28（DS=2）、0.42（DS=3）和0.56（DS=4） μmol/cm2。1 h后，從每個(gè)接收池中取樣品溶液1 mL。拆除擴(kuò)散池，將皮膚樣品用水沖洗約1 min后，將其剪成小塊（直徑<3 mm），然后置于甲醇-水溶液（3 ∶ 2，V/V）5 mL中，密封攪拌3 h以提取皮膚內(nèi)部貯留的ACV和ACV-Hex。將上述皮膚提取液和取自接收池的樣品溶液分別以15 000 r/min離心15 min，取上清液，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過(guò)，收集續(xù)濾液，以流動(dòng)相適當(dāng)稀釋后（稀釋倍數(shù)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，以保證測(cè)定結(jié)果在線(xiàn)性范圍之內(nèi)為標(biāo)準(zhǔn)），按“2.3.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算ACV和ACV-Hex的濃度，將結(jié)果乘以各自樣品的稀釋倍數(shù)后，可得ACV和ACV-Hex在實(shí)際樣品中的濃度。規(guī)定皮膚中ACV的貯留量（QACV）和皮膚中ACV-Hex的貯留量（QACV-Hex）之和為皮膚貯留總量（QTOT）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。采用Excel 2007進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，具有相同DS的添加或不添加HPMC E3樣品的皮膚貯留量比較采用Students t檢驗(yàn)，具有不同DS的添加或不添加HPMC E3樣品的皮膚貯留量比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，所有ACV-Hex超飽和體系進(jìn)行被動(dòng)透皮1 h后，接收池中均未檢測(cè)到ACV-Hex或原型藥物ACV，而在皮膚提取液樣品中均檢測(cè)到了ACV和ACV-Hex。在不添加HPMC E3的情況下，當(dāng)DS為0.5時(shí)，QTOT為（0.12±0.03） nmol/cm2;當(dāng)DS為1時(shí)，QTOT增加至（0.27±0.06） nmol/cm2;當(dāng)DS為2、3、4時(shí)，QTOT分別為（0.30±0.03）、（0.41±0.14）、（0.64±0.25） nmol/cm2，組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。該結(jié)果表明，由于HPMC E3的缺失，導(dǎo)致超飽和體系中的ACV-Hex有結(jié)晶趨勢(shì)，無(wú)法維持體系的高熱力學(xué)活度，從而無(wú)法促進(jìn)藥物經(jīng)皮吸收。在添加HPMC E3的情況下，DS為0.5、1、2時(shí)，ACV-Hex超飽和體系的QTOT分別為（0.18±0.09）、（0.27±0.12）、（0.30±0.18） nmol/cm2;而當(dāng)DS增至3和4時(shí)，QTOT分別為（2.55±0.64）、（4.90±1.58） nmol/cm2，相比于同一DS下不添加HPMC E3樣品的QTOT均顯著增加（P<0.05）。由上述結(jié)果可知，添加HPMC E3的ACV-Hex超飽和體系的超飽和狀態(tài)能在一定時(shí)間內(nèi)得以維持，從而顯著增加ACV-Hex的透皮遞送量。

2.7 ACV-Hex超飽和體系的皮膚分布實(shí)驗(yàn)

采用冷凍層切-分層定量法進(jìn)行測(cè)定[14]。同 “2.6”項(xiàng)下超飽和體系透皮實(shí)驗(yàn)的濃度和操作方法，使用DS分別為1、4的添加了HPMC E3的ACV-Hex超飽和體系（ACV-Hex的劑量分別為0.14 、0.56 μmol/cm2，見(jiàn)“2.6”項(xiàng)）進(jìn)行被動(dòng)透皮實(shí)驗(yàn);同時(shí)，以上市藥物阿昔洛韋乳膏（100 mg，相當(dāng)于ACV劑量11.10 μmol/cm2）為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行比較。1 h后結(jié)束實(shí)驗(yàn)。將與藥物直接接觸的皮膚圓片剪下，用水沖洗約1 min后，拭干皮膚表面水分。將皮膚樣品用OCT冰凍切片包埋劑固定于冷凍切片機(jī)樣品托上，浸入用液氮冷卻的異戊烷中快速冷凍，取出后，以平行于皮膚表面的方式橫向切片，連續(xù)得到單片厚度為20 μm的10個(gè)皮膚切片，依次保存，分別置于1 mL甲醇-水溶液（3 ∶ 2，V/V）中提取3 h，提取液以15 000 r/min離心15 min，取上清液，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過(guò)，收集續(xù)濾液，按“2.3.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定并分別計(jì)算續(xù)濾液中ACV和ACV-Hex的濃度。規(guī)定在第1個(gè)皮膚切片（即厚度介于0～20 μm的皮膚組織）中檢測(cè)到的ACV和ACV-Hex的量分別為Q′1-ACV和Q′1-ACV-Hex，在第2個(gè)皮膚切片（即厚度介于20～40 μm的皮膚組織）中檢測(cè)到的ACV和ACV-Hex的量分別為Q′2-ACV和Q′2-ACV-Hex，以此類(lèi)推，直至Q′10-ACV和Q′10-ACV-Hex;規(guī)定第1個(gè)皮膚切片中藥物貯留量Q′1=Q′1-ACV+Q′1-ACV-Hex，第2個(gè)皮膚切片中藥物貯留量為Q′2=Q′2-ACV+Q′2-ACV-Hex，以此類(lèi)推，直至Q′10=Q′10-ACV+Q′10-ACV-Hex;規(guī)定Q′TOT-ACV=Q′1-ACV+Q′2-ACV+……+Q′10-ACV，Q′TOT-ACV-Hex=Q′1-ACV-Hex+Q′2-ACV-Hex+……+Q′10-ACV-Hex;規(guī)定Q′TOT=Q′TOT-ACV+Q′TOT-ACV-Hex。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用Excel 2007進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同ACV-Hex飽和體系在相同厚度皮膚中的藥物貯留量比較采用Students t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知，使用阿昔洛韋乳膏后，盡管在皮膚淺表處發(fā)現(xiàn)了較高濃度的ACV[Q′1-ACV為（0.47±0.19） nmol/cm2]，但在其后各層皮膚中ACV的量迅速下降，至第5層以后，已無(wú)法再檢出ACV。使用DS為1的ACV-Hex超飽和體系后，在第5層以后的各層皮膚中幾乎無(wú)法檢出藥物，且其Q′1～Q′4也都顯著低于阿昔洛韋乳膏（P<0.05）。使用DS為4的ACV-Hex超飽和體系后，從皮膚厚度為100 μm開(kāi)始（即從Q′5開(kāi)始），以后的每一層皮膚中檢出的ACV和ACV-Hex量之和均顯著高于阿昔洛韋乳膏在相同皮膚層中的ACV量（P<0.05）。使用DS為4的ACV-Hex超飽和體系后，在皮膚基底表皮層（厚度為100～160 μm）中的遞送量（即Q′6+Q′7+Q′8）為（0.40±0.12） nmol/cm2，其中ACV（即Q′5-ACV+? Q′7-ACV +Q′8-ACV）的量為（0.08±0.03） nmol/cm2。

3 討論

促進(jìn)ACV的透皮吸收，除了可以使用微乳、納米粒等制劑方法外[9，15]，還可以將ACV制成水溶性的氨基酸酯前體藥物，并利用離子導(dǎo)入將其遞送至皮膚[8]。超飽和體系的促滲機(jī)理在于提高了分子本身的熱力學(xué)活度，而非像促滲劑那樣改變了皮膚角質(zhì)層屬性[16]，因此其對(duì)皮膚的刺激性小;加之超飽和體系的構(gòu)成和制備均較簡(jiǎn)單，故在實(shí)際操作中可能會(huì)比納米粒制劑及離子導(dǎo)入裝置等更簡(jiǎn)便易行。雖然超飽和體系在透皮給藥領(lǐng)域的運(yùn)用已有多年，但一直未見(jiàn)將該技術(shù)用于促進(jìn)ACV透皮遞送的研究報(bào)道。為此，本課題組進(jìn)行了相關(guān)研究。

由于HSV的主要復(fù)制部位為皮膚基底表皮層，因此只知道藥物在整體皮膚中的濃度還不夠，還需通過(guò)皮膚分布實(shí)驗(yàn)來(lái)確定藥物在基底表皮層的濃度。藥物在皮膚中的生物利用度可采用膠帶粘提法（tape-stripping）和微透析法（microdialysis）進(jìn)行測(cè)定[17-18]。但前者只能研究藥物在角質(zhì)層中的分布，而后者對(duì)透析裝置的操作要求較為苛刻，且只能監(jiān)測(cè)到藥物在某個(gè)厚度皮膚組織中的吸收情況，無(wú)法反映藥物在皮膚中分布的全貌。冷凍層切-分層定量法是將皮膚橫切為數(shù)個(gè)切片，分別提取各切片中的藥物，然后通過(guò)定量測(cè)定提取液中的藥物含量，進(jìn)而得知不同厚度皮膚中所蓄積的藥物量，是一種行之有效的研究皮膚中藥物分布的手段[14]。

在本研究中，筆者首先基于飽和溶解度數(shù)據(jù)，明確了ACV-Hex是制備超飽和體系的最佳前體藥物，并確定了制備ACV-Hex超飽和體系的溶劑體系為10%丙二醇-水溶液。然后，通過(guò)加入一定量的抗成核高分子材料HPMC E3，證實(shí)了其在短期內(nèi)（1 h）可維持DS不超過(guò)4的ACV-Hex超飽和體系的物理穩(wěn)定性。接著，筆者又通過(guò)超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法確定了進(jìn)入皮膚的藥物量，證實(shí)了在HPMC E3的存在下，增加體系DS可以促進(jìn)ACV-Hex的皮膚吸收。最后，筆者通過(guò)冷凍層切-分層定量法證實(shí)了DS為4的ACV-Hex超飽和體系能在不同厚度皮膚層（特別是基底表皮層）中展現(xiàn)出較高的藥物蓄積量，提示其在治療皮膚局部HSV感染中可能具有一定的價(jià)值。另外，筆者還發(fā)現(xiàn)，在該體外透皮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，貯留在皮膚中的ACV-Hex量高于ACV量，說(shuō)明僅有少部分的ACV-Hex進(jìn)入皮膚后轉(zhuǎn)化為ACV。如在分別使用DS為3、4的添加HPMC E3的超飽和體系后，遞送進(jìn)入皮膚中的ACV-Hex分別只有（12.2±7.3）%和（4.1±1.6）%轉(zhuǎn)化為ACV，說(shuō)明在1 h內(nèi)的皮膚酶解是不完全的，筆者推測(cè)這可能是因?yàn)槠つw在處理和冷凍儲(chǔ)存過(guò)程中酶活性有所降低。雖然如此，這些已經(jīng)形成的ACV的量在理論上也足以抑制HSV感染：若假設(shè)ACV在厚度為100～160 μm的皮膚基底表皮組織中的分布均勻，則ACV在該組織中的理論濃度（不含未轉(zhuǎn)化的ACV-Hex）為（13.33±5.01） nmol/cm3。經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道，ACV治療HSV-1的半數(shù)抑制濃度為0.04～3.1 nmol/cm3[19]，這遠(yuǎn)低于使用DS為4的ACV-Hex超飽和體系1 h后在皮膚基底層中的ACV濃度。如考慮到在活體中，皮膚中酶的活力較體外更高，那么可以合理推測(cè)還將有相當(dāng)一部分的ACV-Hex可在皮膚內(nèi)部被快速酶解形成ACV，從而進(jìn)一步增加ACV的局部濃度。由此可見(jiàn)，本研究所制的DS為4的添加了HPMC E3的ACV-Hex超飽和體系對(duì)局部治療HSV皮膚感染可能具有一定價(jià)值。

綜上所述，本研究通過(guò)合成ACV的脂溶性前體藥物ACV-Hex并制備其超飽和體系，促進(jìn)了ACV的透皮吸收，改善了ACV皮膚生物利用度低的問(wèn)題。但本研究均在體外開(kāi)展，尚未對(duì)ACV-Hex超飽和體系在活體動(dòng)物皮膚上的應(yīng)用效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，也未直接證實(shí)ACV-Hex超飽和體系對(duì)HSV感染的治療效果，后續(xù)筆者將主要圍繞上述兩方面內(nèi)容開(kāi)展相關(guān)研究。

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（收稿日期：2020-12-14 修回日期：2021-06-09）

（編輯：林 靜）