牛奶中β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)方法的研究

◎ 李 濱，張俊杰，徐 潔，張 磊

（江蘇海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 連云港 222000）

隨著我國(guó)對(duì)牛奶中抗生素殘留問(wèn)題關(guān)注度的提高和部分乳制品企業(yè)“無(wú)抗奶”目標(biāo)的制定和提出，抗生素殘留成為了人們關(guān)注的食品健康問(wèn)題，“無(wú)抗奶”這個(gè)名詞也成為了生產(chǎn)者和消費(fèi)者重點(diǎn)關(guān)注的話(huà)題。β-內(nèi)酰胺酶作為一種常見(jiàn)的抗生素分解酶常被不法商販用來(lái)掩蓋牛奶中的抗生素殘留[1]。目前市場(chǎng)上用來(lái)檢測(cè)抗生素殘留的方法有微生物法、碘量法、酸量法、顯色頭孢菌素法和高效液相色譜法等。其中微生物法與碘量法都因其具有成本低[2]、操作簡(jiǎn)單[3]等特點(diǎn)而被實(shí)驗(yàn)室廣泛使用，但前者檢測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)[4]，且無(wú)法定性、定量分析抗生素種類(lèi)及含量[5]，而后者反應(yīng)靈敏度低[6]，實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性也較差[7]，因此二者均難以在市場(chǎng)推廣。酸量法與顯色頭孢菌素法原理相似，均利用顏色的變化對(duì)β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行檢測(cè)分析，但酸量法無(wú)法區(qū)分內(nèi)源性和外源性的β-內(nèi)酰胺酶且不能用酶動(dòng)力學(xué)分析[8]，而顯色頭孢菌素法則由于假陽(yáng)性概率較大[9]，同樣無(wú)法滿(mǎn)足市場(chǎng)需求。高效液相色譜法是目前被廣泛應(yīng)用的一種理化檢測(cè)方法，該方法靈敏度較高、檢測(cè)時(shí)間短、效率高且自動(dòng)化程度高[10]，但檢測(cè)成本也高，樣品前處理較煩瑣[11]，檢測(cè)程序復(fù)雜、費(fèi)用較高[12]，一般在大型實(shí)驗(yàn)室使用，更適合于精確測(cè)定。

本研究根據(jù)β-內(nèi)酰胺酶的性質(zhì)以及其分解產(chǎn)物（青霉素噻唑酸）的性質(zhì)作為出發(fā)點(diǎn)進(jìn)行研究，設(shè)計(jì)出一種新的檢測(cè)方法——硫酸銅-紫外分光光度計(jì)法。該方法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)成本極低，有效降低了β-內(nèi)酰胺酶的最低檢出限，滿(mǎn)足市場(chǎng)檢測(cè)需求，為β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)方法開(kāi)發(fā)提供了新的解決思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

市售鮮牛奶（新希望乳業(yè)有限公司），牛奶β-內(nèi) 酰胺酶快速檢測(cè)試紙條（深圳市易瑞生物科技有限公司），青霉素鉀標(biāo)準(zhǔn)品（合肥博美生物科技有限公司），β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品（上海阿拉丁生化科技有限公司），硫酸銅（南京化學(xué)試劑一廠(chǎng)），三氯乙酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），甲基紅指示劑，氫氧化鈉，頭孢硝噻吩（長(zhǎng)沙俄里翁生物科技有限公司），二甲基亞砜（麗媛棠科教儀器商城）

1.1.2 儀器

電熱恒溫水浴鍋（HW-YS，浙江舟山市定海區(qū)海源儀器廠(chǎng)）；自動(dòng)純水蒸餾器（SZ-93，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）；電子天平（BP221S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；立體式冰箱（BCD-205F/T，青島海爾電器有限公司）；臺(tái)式離心機(jī)（TL-5.0，上海市離心機(jī)械研究所）；精密pH計(jì)（PHS-3C，上海精密科學(xué)儀器有限公司-雷磁儀器）；測(cè)色色差計(jì)（WSC-S，上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司）；超聲波清洗儀（JPS-100AL，上海煜南儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

按質(zhì)量比無(wú)抗奶粉∶蒸餾水=1∶10配制含青霉素鉀質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1，β-內(nèi)酰胺酶濃度 60 U·mL-1的樣品牛奶溶液及空白（不含β-內(nèi)酰胺酶）牛奶溶液，在最適酶促反應(yīng)溫度32.5 ℃水浴 50 min[13]；取空白牛奶（不含β-內(nèi)酰胺酶）5 mL，加入5 mL的三氯乙酸（TCA），用旋渦混合器充分振蕩，使其混合均勻，然后放入多用途臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速8 000 r·min-1[14]，離心15 min，離心后取上清液10 mL放入燒杯，添上標(biāo)簽樣品1；取含β-內(nèi)酰胺酶及青霉素鉀的樣品牛奶溶液5 mL，加入5 mL的TCA，用旋渦混合器充分振蕩，使其混合均勻，然后放入多用途臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速8 000 r·min-1，離心15 min，離心后取上清液10 mL放入燒杯，添上標(biāo)簽樣品2；在樣品1和樣品2中分別加入0.2 mol·L-1的硫酸銅溶液3 mL作為反應(yīng)劑和顯色劑[15]，測(cè)定溶液OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 各個(gè)影響因素的優(yōu)化

2.1.1 樣品最大吸光度的測(cè)定

在最適酶促反應(yīng)條件下，分別測(cè)定溶液在波長(zhǎng)200～600 nm的OD值。如圖1所示，在200～263 nm階段，OD值呈上升趨勢(shì)，隨后下降直至平穩(wěn)，溶液在263 nm處有最大吸收峰。

圖1 樣品最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定圖

2.1.2 底物青霉素鉀與硫酸銅用量及樣液添加量?jī)?yōu)化

由圖2可知，當(dāng)酶濃度達(dá)到2 mg·mL-1時(shí)其峰值與5 mg·mL-1基本相同，由于5 mg·mL-1青霉素鉀濃度是過(guò)量的，且青霉素鉀濃度過(guò)高時(shí)會(huì)自身分解，所以5 mg·mL-1以上不再試驗(yàn)。出于節(jié)約材料、高效實(shí)驗(yàn)的目的選擇底物青霉素鉀用量為2 mg·mL-1。

圖2 不同青霉素鉀用量的樣品檢測(cè)光譜圖

由圖3可知，0.2 mol·L-1的硫酸銅試劑添加量為 0.150 mL時(shí)其光譜的峰值最大，但0.100 mL和0.150 mL的硫酸銅試劑添加量的光譜圖基本相同，出于節(jié)約材料以及硫酸銅添加量不宜過(guò)多方面考慮，0.2 mol·L-1的硫酸銅試劑最適添加量為0.100 mL。

圖3 不同硫酸銅添加量的樣品光譜圖

由圖4可知，樣液添加量為2.7 mL時(shí)，該樣液的光譜峰值最大，所以樣液的最佳添加量為2.7 mL。

圖4 不同樣液添加量的樣品光譜圖

綜上所述，可知最佳條件為底物濃度2 mg·mL-1， 0.2 mol·L-1的硫酸銅試劑添加量為0.100 mL，樣液添加量為2.7 mL，反應(yīng)時(shí)間為18 min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及最低檢出限的確定

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)分別測(cè)定β-內(nèi)酰胺酶的濃 度 為5 U·mL-1、15 U·mL-1、30 U·mL-1、60 U·mL-1和100 U·mL-1的5組樣品在263 nm處的吸光度，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖5所示。β-內(nèi)酰胺酶與其在263 nm處的OD值呈比較好的線(xiàn)性關(guān)系，由此可以初步確定其最低檢出限為5 U·mL-1。

圖5 不同酶濃度樣品峰值的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖

3 結(jié)論

運(yùn)用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描得到絡(luò)合物在263 nm 處有最大吸收峰，底物濃度2 mg·mL-1，0.2 mol·L-1的硫酸銅試劑添加量為0.100 mL，樣液添加量為2.7 mL，反應(yīng)時(shí)間為18 min的最優(yōu)條件下建立β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)線(xiàn)性關(guān)系，R2為0.976 1，相關(guān)性良好，最低檢出限為5 U·mL-1。該硫酸銅-紫外分光光度計(jì)法是一種檢測(cè)成本低、易于操作、檢出限較低的檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶方法，該方法可基本滿(mǎn)足目前市場(chǎng)需求。