威寧豆醬純種發(fā)酵工藝優(yōu)化及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

蒲 靜，宮沛文，楊瀟垚，孟淑真，包峻州，張問(wèn)平，吳擁軍

（貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物工程研究院 山地植物資源保護(hù)與保護(hù)種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心，貴州 貴陽(yáng) 550025）

豆醬又稱(chēng)黃豆醬、黃醬或大豆醬，是大豆自然發(fā)酵而成的固態(tài)發(fā)酵調(diào)味品[1-2]。豆醬具有多種產(chǎn)品如豆面醬、豆瓣醬及黃豆醬等[3]，其作為中國(guó)特色的傳統(tǒng)調(diào)味品，能提供豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（蛋白質(zhì)、脂肪、維生素及微量元素）[4-5]及不飽和脂肪酸（亞油酸、亞麻酸等），還可降低人群患心血管疾病幾率[6]。此外，豆醬中還含有多酚、大豆皂苷、類(lèi)黑精、異黃酮等多種對(duì)人體有益的生理活性物質(zhì)[7-11]，具有很好的保健功能。因此，豆醬不僅能使菜品呈現(xiàn)出更鮮美的滋味，增加菜品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還具有很好的保健功能。

威寧豆醬主要由大豆自然發(fā)酵獲得，因其具有獨(dú)特風(fēng)味深受人們的喜愛(ài)。然而，威寧豆醬目前多以家庭作坊式傳統(tǒng)自然發(fā)酵生產(chǎn)為主，衛(wèi)生條件較差、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、質(zhì)量不穩(wěn)定、產(chǎn)量不高、季節(jié)性較強(qiáng)，因此，較低地工業(yè)化生產(chǎn)水平不能滿足市場(chǎng)的需要，食品安全也存在隱患[12]。為能提高豆醬食用安全性、縮短生產(chǎn)周期[13]，并能全年生產(chǎn)，可以通過(guò)人工接種純種發(fā)酵豆醬的方式進(jìn)行生產(chǎn)，但目前市場(chǎng)上適用于威寧豆醬純種發(fā)酵的工業(yè)菌株種類(lèi)較少，而且制作出的豆醬風(fēng)味單一[14]，品質(zhì)難以達(dá)到傳統(tǒng)生產(chǎn)方式生產(chǎn)出的豆醬。因此，優(yōu)質(zhì)純種豆醬發(fā)酵菌株的選取及后續(xù)工藝條件的優(yōu)化是目前豆醬發(fā)酵中亟待解決的問(wèn)題。

本研究前期從威寧地區(qū)醬曲樣本中分離篩選出具有優(yōu)良發(fā)酵性能的菌株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）DX-9和異常威克漢姆酵母菌（Wickerhamomyces anomalus）DZ-3[12]，采用該菌株分別純種發(fā)酵大豆制作威寧豆醬，并以氨基酸態(tài)氮含量與感官評(píng)價(jià)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化制曲條件、輔料（食鹽、辣椒粉、五香粉）添加量與后發(fā)酵條件。最后，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀對(duì)自然發(fā)酵豆醬和純種發(fā)酵威寧豆醬成品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，為縮短威寧豆醬的生產(chǎn)周期、提高豆醬食用安全性以及促進(jìn)威寧豆醬工業(yè)化生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

黃豆、食鹽、五香粉：市售；辣椒粉：自制；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）DX-9（NC 000964）和異常威克漢姆酵母菌（Wickerhamomyces anomalus）DZ-3（KY 105887.1）：本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 試劑

氯化鈉（分析純）、氫氧化鈉（分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；36%甲醛溶液（分析純）：重慶江川化工（集團(tuán)）有限公司；結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（純度99.9%）：長(zhǎng)沙三行生物科技有限公司；三糖鐵瓊脂（生化試劑）：青島海博生物公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：參照文獻(xiàn)[15]配制；煌綠乳糖膽鹽（brilliant green lactose bile，BGLB）肉湯培養(yǎng)基、沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基：青島海博生物公司；賴(lài)氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基：上海賓穗生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD標(biāo)準(zhǔn)型凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；800Y多功能粉碎機(jī)：武義海納電器有限公司；GMSX-280高壓滅菌鍋：英國(guó)阿斯太歐公司；SHZ-82恒溫水浴鍋：中國(guó)金壇市醫(yī)療儀器廠；DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；JE203多功能電子天平：上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司；HP6890/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)安捷倫公司；57333-U手動(dòng)固相微萃取裝置：美國(guó)Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 威寧豆醬制作工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

挑選：挑選無(wú)蟲(chóng)蝕、無(wú)霉變、新鮮優(yōu)質(zhì)的非轉(zhuǎn)基因黃豆。

烘烤：將黃豆置于140 ℃烘箱中烘1.5 h。

磨粉：采用多功能粉碎機(jī)磨粉，黃豆粉過(guò)60目篩。

高壓滅菌：121℃高壓蒸汽滅菌20min，冷卻至30℃?zhèn)溆谩?/p>

混勻：按無(wú)菌水∶黃豆粉=4∶5（mL∶g）的比例混勻得到黃豆勻漿。

人工接種：將菌株DX-9、DZ-3分別接種到5 mL LB、PDA液體培養(yǎng)基中，分別于38 ℃、30 ℃，180 r/min條件下活化培養(yǎng)12 h。將活化后的菌液分別按1%（V/V）的接種量接種于30 ℃黃豆勻漿中。

制曲：將接種DX-9的黃豆勻漿于37 ℃恒溫發(fā)酵15 d，接種DZ-3的黃豆勻漿于28 ℃恒溫發(fā)酵15 d。

添加輔料：醬曲粉碎后加入10%食鹽、5%辣椒粉、1%五香粉，按醬曲∶無(wú)菌水=5∶3（g∶mL）混勻。

后發(fā)酵：將接種了DX-9與DZ-3的樣品分別置于37 ℃、28 ℃的恒溫水浴鍋中后發(fā)酵3個(gè)月[16]，即得威寧豆醬成品。

自然發(fā)酵威寧豆醬中不接種菌株，裝壇后置于室外進(jìn)行日曬夜露的開(kāi)放式發(fā)酵，定期攪拌，發(fā)酵時(shí)間為半年左右[17]。

1.3.2 制曲條件優(yōu)化

以醬曲中的氨基酸態(tài)氮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)置制曲溫度（DX-9制曲溫度為34 ℃、36 ℃、38 ℃、40 ℃、42 ℃、44 ℃、46 ℃，DZ-3制曲溫度為28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃、38 ℃、40 ℃）、菌株接種量（1%、2%、3%、4%、5%、6%，V/V）、制曲時(shí)間（3 d、6 d、9 d、12 d、15 d、18 d）為自變量，確定最優(yōu)制曲溫度、菌株接種量、制曲時(shí)間。

1.3.3 輔料添加量的優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

以DX-9發(fā)酵豆醬的感官評(píng)分為考察指標(biāo)，分別設(shè)置食鹽添加量（8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%）、辣椒粉添加量（1%、2%、3%、4%、5%、6%）、五香粉添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）為單因素自變量，考察食鹽添加量、辣椒添加量、五香粉添加量對(duì)DX-9發(fā)酵豆醬感官評(píng)分的影響。

（2）正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以DX-9發(fā)酵豆醬感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別選取食鹽（A）、辣椒（B）、五香粉（C）添加量為考察因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 輔料添加量?jī)?yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table1 Factors and levels of orthogonal tests for auxiliary material addition optimization

1.3.4 后發(fā)酵條件優(yōu)化

通過(guò)前期的實(shí)驗(yàn)確定制曲條件和輔料添加量后，以DX-9和DZ-3發(fā)酵豆醬的氨基酸態(tài)氮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)置后發(fā)酵溫度（DX-9后發(fā)酵溫度為34 ℃、36 ℃、38 ℃、40 ℃、42 ℃、44 ℃、46 ℃，DZ-3后發(fā)酵溫度為28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃、38 ℃、40 ℃）、后發(fā)酵時(shí)間（15 d、30 d、45 d、60 d、75 d、90 d）為自變量，確定最優(yōu)后發(fā)酵溫度、后發(fā)酵時(shí)間。

1.3.5 氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定

按國(guó)標(biāo)GB/T 24399—2009《黃豆醬》[18]中的甲醛法測(cè)定氨基酸態(tài)氮含量。

1.3.6 威寧豆醬的感官評(píng)價(jià)

威寧豆醬的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2[19-20]，滿分為100分。

表2 威寧豆醬的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table2 Sensory evaluation standards of Weining soybean paste

1.3.7 威寧豆醬微生物指標(biāo)的測(cè)定

大腸菌群的測(cè)定：采用國(guó)標(biāo)GB 4789.3—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》中的平板計(jì)數(shù)法[21]；沙門(mén)氏菌的測(cè)定：采用國(guó)標(biāo)GB 4789.4—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)》檢驗(yàn)方法[22]；金黃色葡萄球菌的測(cè)定：采用國(guó)標(biāo)GB 4789.10—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》中平板計(jì)數(shù)法[23]。

1.3.8 威寧豆醬中揮發(fā)性物質(zhì)的檢測(cè)與分析

采用GC-MS法測(cè)定自然發(fā)酵豆醬和純種發(fā)酵豆醬的揮發(fā)性物質(zhì)[24-25]，對(duì)總離子流色譜圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對(duì)美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院14和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，確定揮發(fā)性化學(xué)成分，采用峰面積歸一化法測(cè)定各化學(xué)成分的相對(duì)含量。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS25.0對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），確定主要揮發(fā)性物質(zhì)[26]。使用Excel2016和SPSS25.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 制曲條件優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 制曲溫度

菌株DX-9和DZ-3制曲溫度對(duì)醬曲氨基酸態(tài)氮含量的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知，隨著制曲溫度的逐漸升高，氨基酸態(tài)氮含量均呈先增后降的趨勢(shì)，分析原因可能是在各自的菌種最適生長(zhǎng)溫度下，菌株生長(zhǎng)情況最佳，分泌的蛋白酶也最多，對(duì)大豆蛋白質(zhì)的分解作用最強(qiáng)，因此氨基酸態(tài)氮含量也最高，溫度升高或降低都會(huì)影響菌株的生長(zhǎng)[27]。其中，菌株DX-9的最佳制曲溫度為38 ℃，菌株DZ-3最佳制曲溫度為34 ℃，在此溫度下，醬曲中氨基酸態(tài)氮含量分別為0.25 g/100 g、0.17 g/100 g。

圖1 菌株DX-9（A）和DZ-3（B）制曲溫度對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.1 Effect of koji-making temperature of strains DX-9 (A) and DZ-3(B) on amino acid nitrogen contents

2.1.2 菌液接種量

菌株DX-9和DZ-3接種量對(duì)醬曲中氨基酸態(tài)氮含量的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知，氨基酸態(tài)氮的含量隨著接種量的增加而增加，當(dāng)菌種添加量偏低時(shí)，豆曲生長(zhǎng)緩慢，曲香變淡，隨著接種量增加，豆曲生長(zhǎng)速率加快，消耗的水分增多。當(dāng)二者接種量分別大于2%和3%時(shí)，醬曲發(fā)黏變黑，品質(zhì)變差，影響翻曲[28]。因此，確定DX-9和DZ-3的最佳接種量分別為2%和3%。

圖2 菌株DX-9（A）和DZ-3（B）接種量對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.2 Effect of strains DX-9 (A) and DZ-3 (B) inoculum on amino acid nitrogen contents

2.1.3 制曲時(shí)間

菌株DX-9和DZ-3制曲時(shí)間對(duì)醬曲中氨基酸態(tài)氮含量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 菌株DX-9（A）和DZ-3（B）制曲時(shí)間對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.3 Effect of koji-making time of strains DX-9 (A) and DZ-3 (B) on amino acid nitrogen contents

由圖3可知，當(dāng)菌株DX-9發(fā)酵時(shí)間≤12 d、菌株DZ-3發(fā)酵時(shí)間≤18 d時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量均隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，醬曲顏色、質(zhì)地均勻。繼續(xù)發(fā)酵則表面產(chǎn)生了大量孢子，菌株生長(zhǎng)消耗了醬曲大量水分，醬曲開(kāi)始發(fā)黑、結(jié)塊[29]。因此，確定DX-9、DZ-3的最優(yōu)制曲時(shí)間為12 d、18 d，此時(shí)氨基酸態(tài)氮含量分別為0.21 g/100 g、0.19 g/100 g。

2.2 輔料添加量?jī)?yōu)化結(jié)果

2.2.1 單因素試驗(yàn)

自然發(fā)酵和菌株DX-9發(fā)酵豆醬均為褐色，菌株DZ-3發(fā)酵豆醬為紅褐色。制曲階段中菌株DX-9比DZ-3周期短6 d，并且氨基酸態(tài)氮含量比菌株DZ-3高。因此，選擇菌株DX-9為發(fā)酵菌株進(jìn)行輔料添加量的優(yōu)化。食鹽、五香粉和辣椒粉添加量對(duì)菌株DX-9發(fā)酵豆醬的感官評(píng)分的影響見(jiàn)圖4。

圖4 食鹽（A）、五香粉（B）及辣椒粉（C）添加量對(duì)豆醬感官評(píng)分的影響Fig.4 Effect of salt (A),five-spice (B) and chili power (C) addition on sensory evaluation of soybean paste

由圖4可知，隨著食鹽、五香粉及辣椒粉添加量的增加，菌株DX-9發(fā)酵豆醬的感官評(píng)分均呈先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)食鹽、五香粉及辣椒粉添加量分別為10%、1%、5%時(shí)，豆醬的感官評(píng)分均最高，分別為79分、80分、78分。因此，確定食鹽、五香粉及辣椒粉的最佳添加量分別為10%、1%、5%。

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

輔料添加量?jī)?yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表3 輔料添加量?jī)?yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table3 Results and analysis of orthogonal tests for auxiliary material addition optimization

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table4 Variance analysis of orthogonal tests results

由表3及表4可知，食鹽添加量（A）對(duì)豆醬感官評(píng)分影響最大（P＜0.05），其次為五香粉添加量（C），辣椒粉添加量（B）影響最小。優(yōu)化的條件組合為A2B2C3，即食鹽添加量為10%，辣椒粉添加量為5%，五香粉添加量為1.5%，此條件下豆醬感官評(píng)分最高，為87分。

2.3 后發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 后發(fā)酵溫度

菌株DX-9和DZ-3后發(fā)酵溫度對(duì)豆醬中氨基酸態(tài)氮含量的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知，氨基酸態(tài)氮含量均隨著后發(fā)酵溫度的升高呈先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)菌株DX-9和DZ-3的后酵溫度分別為40 ℃、36 ℃時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量最高，分別為0.66 g/100 g、0.55 g/100 g。因此，確定菌株DX-9和DZ-3的最佳后發(fā)酵溫度分別為40 ℃和36 ℃。

圖5 菌株DX-9（A）和DZ-3（B）后發(fā)酵溫度對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.5 Effect of post-fermentation temperature of strains DX-9 (A) andDZ-3 (B) on amino acid nitrogen contents

2.3.2 后發(fā)酵時(shí)間

菌株DX-9和DZ-3后發(fā)酵時(shí)間對(duì)豆醬中氨基酸態(tài)氮含量的影響見(jiàn)圖6。

圖6 菌株DX-9（A）和DZ-3（B）后發(fā)酵時(shí)間對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.6 Effect of post-fermentation time of strains DX-9 (A) and DZ-3(B) on amino acid nitrogen contents

由圖6可知，菌株DX-9和DZ-3的后發(fā)酵時(shí)間為30 d時(shí)，豆醬中氨基酸態(tài)氮含量分別為0.68 g/100 g、0.50 g/100 g，均達(dá)到國(guó)標(biāo)GB/T 24399—2009《黃豆醬》的要求（氨基酸態(tài)氮含量≥0.5 g/100 g）。結(jié)合感官評(píng)價(jià)，當(dāng)后發(fā)酵時(shí)間為30 d時(shí)，菌株DX-9和DZ-3發(fā)酵的豆醬色澤較淺、醬味不足、均勻度不夠。發(fā)酵至90 d時(shí)，菌種DX-9發(fā)酵的豆醬為褐色，菌種DZ-3發(fā)酵的豆醬為紅褐色，醬香味均濃郁，酯香氣均足，濃稠均適度。因此，確定菌株DX-9和DZ-3的最佳后發(fā)酵時(shí)間均為90 d。

2.4 威寧豆醬的感官評(píng)價(jià)

對(duì)自然發(fā)酵、菌株DX-9和DZ-3發(fā)酵的豆醬成品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，色澤上，菌株DX-9和自然發(fā)酵的豆醬為褐色，菌株DZ-3發(fā)酵的豆醬為紅褐色；在氣味上，自然發(fā)酵醬香濃郁，純種發(fā)酵豆醬兼具醬香和酯香；滋味上，3種豆醬味鮮醇厚、咸甜適口，但純種發(fā)酵豆醬更加細(xì)膩；形態(tài)上，純種發(fā)酵豆醬比自然發(fā)酵豆醬更粘稠，菌株DZ-3發(fā)酵豆醬相比DX-9發(fā)酵豆醬偏稀。綜合比較，菌株DX-9比菌株DZ-3發(fā)酵的豆醬品質(zhì)更佳。

表5 不同豆醬成品的感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table5 Sensory evaluation results of different soybean paste products

2.5 威寧豆醬微生物指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

自然發(fā)酵、菌株DX-9及DZ-3發(fā)酵豆醬的微生物指標(biāo)見(jiàn)表6。由表6可知，3種豆醬的微生物指標(biāo)均符合國(guó)標(biāo)GB 2718—2014《釀造醬》要求[20]。菌株DX-9和DZ-3發(fā)酵豆醬的大腸菌群數(shù)均小于自然發(fā)酵豆醬；菌株DX-9和DZ-3發(fā)酵豆醬均未檢測(cè)到金黃色葡萄球菌，自然發(fā)酵豆醬中金黃色葡萄球菌數(shù)量＜10 CFU/g；在3種豆醬成品中均未檢測(cè)到沙門(mén)氏菌。綜上可知，純種發(fā)酵安全性比自然發(fā)酵高。

表6 不同豆醬成品的微生物指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Table6 Determination results of microbial indexes of different soybean paste products

2.6 威寧豆醬中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果

2.6.1 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

不同豆醬成品中揮發(fā)性物質(zhì)的GC-MS分析結(jié)果見(jiàn)表7，韋恩圖見(jiàn)圖7。

圖7 不同豆醬成品揮發(fā)性物質(zhì)的韋恩圖Fig.7 Venn diagram of volatile substances in different soybean paste products

表7 不同豆醬成品中揮發(fā)性物質(zhì)的GC-MS分析結(jié)果Table7 GC-MS analysis results of volatile components in different soybean paste products

續(xù)表

續(xù)表

由表7可知，自然發(fā)酵豆醬、菌株DX-9發(fā)酵豆醬及菌株DZ-3發(fā)酵豆醬中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分別共檢測(cè)到73種、50種、64種，3種豆醬中共有揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)23種，主要揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)為烴類(lèi)、酯類(lèi)、醇類(lèi)、酮類(lèi)、醛類(lèi)、酸類(lèi)，這與其他豆醬揮發(fā)性物質(zhì)的研究結(jié)果一致[25，30]。其中自然發(fā)酵豆醬和菌株DZ-3發(fā)酵豆醬中有39種相同揮發(fā)物質(zhì)，自然發(fā)酵豆醬和菌株DX-9發(fā)酵豆醬中有32種相同揮發(fā)物質(zhì)。自然發(fā)酵豆醬的揮發(fā)性物質(zhì)中醇類(lèi)物質(zhì)的相對(duì)含量較多，其中1-辛烯-3-醇的相對(duì)含量為12.645%；菌株DZ-9發(fā)酵威寧豆醬中的揮發(fā)性物質(zhì)中酸類(lèi)物質(zhì)相對(duì)含量較多，如：2-甲基-丁酸（60.795%）、異丁酸（7.673%）、乙酸（7.210%）；菌株DZ-3發(fā)酵威寧豆醬中主要揮發(fā)性物質(zhì)為烴類(lèi)物質(zhì)，如：雙戊烯（33.765%）、β-月桂烯（9.351%）、γ-萜品烯（6.784%）、α-萜品烯（3.682%）。本研究中菌株DX-9發(fā)酵豆醬中特有酚類(lèi)物質(zhì)的都有醬香風(fēng)味，雖微量，但呈香作用明顯，這可能是菌株DX-9發(fā)酵豆醬比菌株DZ-3發(fā)酵豆醬感官評(píng)分高的主要原因。

2.6.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主成分分析結(jié)果

威寧豆醬的風(fēng)味由多種主要風(fēng)味物質(zhì)相互作用形成，選擇豆醬中6種含量較高的物質(zhì)（醇類(lèi)、酮類(lèi)、酸類(lèi)、酯類(lèi)、醛類(lèi)和烴類(lèi)物質(zhì)）作為主成分變量，以揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量為標(biāo)準(zhǔn)，利用SPSS25.0進(jìn)行主成分分析。揮發(fā)性物質(zhì)主成分累積方差貢獻(xiàn)率見(jiàn)表8，以特征值＞1確定主成分個(gè)數(shù)，威寧豆醬中揮發(fā)性物質(zhì)主成分個(gè)數(shù)為2。

表8 揮發(fā)性物質(zhì)主成分累積方差貢獻(xiàn)率Table8 Cumulative variance contribution rate of principal components of volatile substances

揮發(fā)性物質(zhì)主成分載荷距陣見(jiàn)表9。由表9可知，醛類(lèi)、醇類(lèi)、酮類(lèi)、酯類(lèi)4種物質(zhì)在主成分1上載荷較高；烴類(lèi)、酸類(lèi)、酯類(lèi)、酮類(lèi)4種物質(zhì)在主成分2上載荷較高。且由表8可知，主成分2的積累方差貢獻(xiàn)率比主成分1高，為100%，烴類(lèi)和酸類(lèi)物質(zhì)相關(guān)系數(shù)在主成分2上絕對(duì)值最高。因此，確定威寧豆醬的主要揮發(fā)性物質(zhì)為烴類(lèi)和酸類(lèi)物質(zhì)。

表9 揮發(fā)性物質(zhì)主成分載荷距陣Table9 Principal component loading matrix of volatile substances

3 結(jié)論

以自然發(fā)酵豆醬為對(duì)照，采用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）DX-9和異常威克漢姆酵母菌（Wickerhamomyces anomalus）DZ-3分別發(fā)酵制備威寧豆醬，以氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定菌株DX-9、DZ-3的最佳制曲條件為：接種量2%和3%，制曲溫度38 ℃和34 ℃、制曲時(shí)間12 d和18 d；豆醬中輔料食鹽、辣椒、五香粉的最適添加量分別為10%、5%、1.5%；菌株DX-9、DZ-3的最佳后發(fā)酵條件為：溫度40 ℃和36 ℃、時(shí)間均為90 d。采用GC-MS對(duì)發(fā)酵豆醬中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，自然發(fā)酵、菌株DX-9和DZ-3發(fā)酵豆醬中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分別有73種、50種和64種，共有物質(zhì)為23種。其中，自然發(fā)酵豆醬、菌株DX-9和DZ-3發(fā)酵豆醬中含量最多的物質(zhì)分別為醇類(lèi)（27.36%）、酸類(lèi)（75.68%）和烴類(lèi)（64.21%），通過(guò)主成分分析結(jié)果表明，威寧豆醬中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為烴類(lèi)和酸類(lèi)。純種發(fā)酵豆醬的安全性均高于自然發(fā)酵豆醬，純種發(fā)酵豆醬中菌株DX-9比DZ-3發(fā)酵豆醬品質(zhì)更佳，為最佳的威寧豆醬純種發(fā)酵菌株。本研究可為縮短威寧豆醬的生產(chǎn)周期、提高食用安全性、降低生產(chǎn)成本的目的，為威寧豆醬的工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。