加壓毛細(xì)管電色譜法分析果蔬汁飲品中8種農(nóng)藥殘留

朱麗君

（蘭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程系，甘肅 蘭州 730070）

果蔬汁飲品是人們?nèi)粘Ｉ钪兄匾娘嬈罚饕且运?、蔬菜為原料制成[1]。由于很多水果和蔬菜在種植過程中易受到蟲害的干擾，所以要進(jìn)行農(nóng)藥噴灑進(jìn)行除害，最常用的幾種農(nóng)藥包括甲萘威、莠去津以及有機(jī)磷類，也會(huì)出現(xiàn)一些禁用農(nóng)藥的使用[2-4]。所以水果和蔬菜中的農(nóng)藥殘留一直是食品安全的監(jiān)控重點(diǎn)，由水果和蔬菜制作而成的果蔬汁飲品也有必要進(jìn)行此類農(nóng)藥殘留的監(jiān)控，以此來保障人民群眾的食品安全[5-6]。

目前農(nóng)藥殘留的測(cè)定常用的是氣相色譜法，但是有部分農(nóng)藥的化學(xué)性質(zhì)具有熱不穩(wěn)定性或者強(qiáng)極性，用此法分析有一定的難度[7-9]。高效液相色譜法也是分析農(nóng)藥殘留的方法之一，主要分析一些不易氣化的農(nóng)藥組分，具有可靠性高、檢測(cè)速度快的優(yōu)點(diǎn)，但由于其柱效沒有氣相色譜高，因此在分離復(fù)雜組分時(shí)很難達(dá)到滿意的結(jié)果[10-12]。加壓毛細(xì)管電色譜（pressurized capillary electrochromatography，pCEC）是結(jié)合了高效液相色譜與毛細(xì)管電泳兩者優(yōu)點(diǎn)的一種技術(shù)，具有高柱效、高選擇性、高分離度、快速分離的特點(diǎn)[13-15]。本研究嘗試將pCEC雙重分離機(jī)理與二極管陣列檢測(cè)器（diode array detector，DAD）的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合，開發(fā)果蔬汁飲品中樂果、敵敵畏、克百威、甲萘威、莠去津、甲基對(duì)硫磷、馬拉硫磷、百菌清共8種農(nóng)藥組分的分析檢測(cè)新方法，并對(duì)前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，為快速檢測(cè)和監(jiān)管果蔬汁飲品中多種農(nóng)藥殘留提供技術(shù)保障和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

果汁樣品：市售；樂果（純度99.9%）、敵敵畏（純度99.2%）、克百威（純度99.6%）、甲萘威（純度99.9%）、莠去津（純度99.9%）、甲基對(duì)硫磷（純度99.8%）、馬拉硫磷（純度99.9%）、百菌清（純度99.9%）標(biāo)準(zhǔn)品：國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。甲醇、乙腈（均為色譜純）：德國(guó)Merck公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2100型加壓毛細(xì)管電色譜系統(tǒng)、U3000型二極管陣列檢測(cè)器：美國(guó)賽默飛公司。

1.3 方法

1.3.1 加壓毛細(xì)管電色譜法檢測(cè)條件

參考相關(guān)文獻(xiàn)[16-17]中相關(guān)的前處理?xiàng)l件，采用親水作用毛細(xì)管電色譜柱進(jìn)行8種農(nóng)藥組分的分離，色譜條件如下：EP-100-20/45-1.8-C18色譜柱（45 cm×20 cm）；流速0.06 mL/min；電壓-9 kV（色譜柱末端）；進(jìn)樣量2 nL；分流比1∶450；柱溫30 ℃；流動(dòng)相為乙腈∶5 mmol/L Tris-HCl（66∶34，V/V）。

1.3.2 色譜條件優(yōu)化

（1）流動(dòng)相體系中有機(jī)相、添加劑的種類及濃度、pH值對(duì)目標(biāo)組分分離的影響

本實(shí)驗(yàn)分別比較流動(dòng)相體系中有機(jī)相的種類（甲醇、乙腈）、添加劑的種類及濃度（乙腈∶Tris-HCl緩沖體系、乙腈-磷酸鹽緩沖體系）以及不同pH值對(duì)8種農(nóng)藥組分分離情況的影響。

（2）電壓強(qiáng)度對(duì)目標(biāo)組分分離的影響

電壓是加壓毛細(xì)管電色譜分離的主要?jiǎng)恿χ籟18-19]，施加不同的電壓強(qiáng)度對(duì)目標(biāo)組分的分離能力和分離速度會(huì)產(chǎn)生不同影響，試驗(yàn)分別施加0、-3 kV、-6 kV、-9 kV負(fù)向電壓，考察8種農(nóng)藥組分在不同電壓強(qiáng)度下的分離情況。

（3）檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

影響二極管陣列檢測(cè)器靈敏度的關(guān)鍵參數(shù)一般是特征波長(zhǎng)的選擇，較佳的特征波長(zhǎng)會(huì)降低雜質(zhì)峰對(duì)目標(biāo)的影響，減少干擾，一般建立適當(dāng)?shù)亩O管陣列檢測(cè)方法時(shí)，需對(duì)這此參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別準(zhǔn)確稱取樂果、敵敵畏、克百威、甲萘威、莠去津、甲基對(duì)硫磷、馬拉硫磷、百菌清標(biāo)準(zhǔn)品0.100 g，分別用甲醇定容于100 mL容量瓶中，搖勻，即制備得1.0 mg/mL的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于4 ℃冰箱避光保存，備用。以各農(nóng)藥組分標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，各出峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 樣品前處理方法的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)利用快速、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、高效、可靠、安全（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe，QuEChERS）凈化技術(shù)對(duì)果蔬汁樣品進(jìn)行前處理，由于針對(duì)多組分農(nóng)藥的特異性，需進(jìn)行提取溶劑和凈化劑的優(yōu)化，才能最大程度提高目標(biāo)組分的回收率。提取溶劑分別為甲醇、乙腈以及含1.0%氨水的乙腈共3種，凈化劑分別為C18、強(qiáng)陰離子交換劑（strong anion exchange，SAX）、石墨化炭黑（graphitized carbonblack，GCB）、N-丙基硅烷（N-propylsilane，PSA）共4種。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相中有機(jī)相對(duì)目標(biāo)組分色譜行為的影響

在流動(dòng)相體系有機(jī)相（甲醇、乙腈）的選擇中，發(fā)現(xiàn)乙腈作為有機(jī)相時(shí)，可以縮短各目標(biāo)組分的出峰時(shí)間。同時(shí)隨著流動(dòng)相中乙腈所占比例的升高，各目標(biāo)組分的保留時(shí)間進(jìn)一步縮短，這主要是由于增加乙腈在流動(dòng)相中所占的體積分?jǐn)?shù)，使得電滲流作用增大，從而縮短了分析時(shí)間，但是隨著乙腈比例的增加，各目標(biāo)組分之間的分離度隨之下降。當(dāng)乙腈在流動(dòng)相中的比例達(dá)到66%時(shí)，各目標(biāo)組分的峰形較好，各組分之間均達(dá)到基線分離。

2.1.2 流動(dòng)相中添加劑的種類及濃度對(duì)目標(biāo)組分色譜行為的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種流動(dòng)相體系中乙腈-磷酸鹽緩沖體系含有的PO43-對(duì)體系的電滲流影響較大。在相同電壓強(qiáng)度下，乙腈-磷酸鹽緩沖體系比乙腈∶Tris-HCl緩沖體系更容易使柱子干涸，產(chǎn)生氣泡，因此選擇乙腈∶Tris-HCl體系作為流動(dòng)相。在乙腈∶Tris-HCl緩沖體系中，當(dāng)Tris-HCl的濃度從5 mmol/L增加到10 mmol/L時(shí)，各目標(biāo)組分的出峰時(shí)間延長(zhǎng)，這是由于電滲流隨著電解質(zhì)濃度的增加而降低，且隨著緩沖液溶液濃度的增加，電滲流的焦耳熱效應(yīng)也增大。相比之下，Tris-HCl在體系中的濃度為5 mmol/L時(shí)保留時(shí)間和分離度均較好。因此，選擇Tris-HCl緩沖溶液的濃度為5 mmol/L。

2.1.3 流動(dòng)相pH值對(duì)目標(biāo)組分色譜行為的影響

本研究中8種農(nóng)藥組分在中性或者弱酸性溶液中化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定，在堿性溶液中易水解。所以試驗(yàn)分別比較了Tris-HCl緩沖溶液pH值為5.0、6.0、7.0時(shí)，對(duì)8種農(nóng)藥組分的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Tris-HCl緩沖溶液的pH值為5.0或者6.0時(shí)，8種農(nóng)藥組分的出峰時(shí)間均比pH值7.0時(shí)延后。因此，選擇pH值7.0的緩沖液體系。

2.2 電壓強(qiáng)度的選擇

本實(shí)驗(yàn)中，在上述條件下8種農(nóng)藥的分離情況良好，因此實(shí)驗(yàn)僅考察pCEC施加電壓對(duì)樣品分離速度的影響，分別考察了分別施加為0、-3 kV、-6 kV、-9 kV負(fù)向電壓時(shí)，8種農(nóng)藥的分離速度情況，結(jié)果見圖1。

圖1 電壓強(qiáng)度對(duì)分離速度的影響Fig.1 Effect of voltage intensity on separation speed

由圖1可知，隨著負(fù)向電壓升高，在電滲流的推動(dòng)下8種農(nóng)藥的分離速度明顯加快，同時(shí)色譜峰形變窄；當(dāng)施加電壓為-9 kV時(shí)，樣品分離時(shí)間加快到16 min左右，甲基對(duì)硫磷、馬拉硫磷和百菌清的保留時(shí)間明顯提前，并且8種農(nóng)藥組分完全分離。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

pCEC實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)器采用的是二極管陣列檢測(cè)器，由于8種農(nóng)藥組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，需對(duì)各組分的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，根據(jù)各個(gè)組分的全波長(zhǎng)掃描選擇較合適的吸收波長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：除甲基對(duì)硫磷在波長(zhǎng)280 nm處有最大吸收外，其他7種農(nóng)藥組分的最大吸收波長(zhǎng)均在波長(zhǎng)220 nm左右。當(dāng)波長(zhǎng)設(shè)置為220 nm時(shí)，結(jié)果表明甲基對(duì)硫磷有吸收值，且吸收值較大。因此，選擇220 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

在最優(yōu)條件下，配制一系列不同濃度的8種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加壓毛細(xì)管電色譜分析，并繪制校準(zhǔn)曲線。取最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品混合液，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察色譜保留時(shí)間及峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），以信噪比（S/N）=10計(jì)算定量限（limit of quantitation，LOQ），以S/N=3計(jì)算檢出限（limit of detection，LOD），結(jié)果見表1。由表1可知，各農(nóng)藥組分標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2均＞0.99，表明8種目標(biāo)組分在一定質(zhì)量濃度范圍均具有良好的線性關(guān)系，檢出限（LOD）為0.03～3.70 μg/mL，定量限（LOQ）為0.1～11.2 μg/mL。

表1 8種組分的線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table1 Linear range,standard curve,correlation coefficient,detection limit and quantification limit of 8 components

2.5 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.5.1 提取溶劑的選擇

參考相關(guān)文獻(xiàn)[20-21]，農(nóng)藥組分的提取溶劑一般采用乙腈、甲醇兩種。本實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇、乙腈以及含1.0%氨水的乙腈3種提取溶劑對(duì)各農(nóng)藥組分回收率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 提取溶劑對(duì)各農(nóng)藥組分回收率的影響Fig.2 Effect of extraction solvent on the recovery of pesticide components

由圖2可知，乙腈比較甲醇而言，在果蔬汁基質(zhì)樣品中各農(nóng)藥組分的回收率要高，但總體上回收率仍較低。但是在乙腈中添加1.0%氨水后，8種農(nóng)藥組分回收率均有所提升，加標(biāo)回收率達(dá)80%以上。因此，選擇含1.0%氨水的乙腈作為提取溶劑。

2.5.2 凈化劑的優(yōu)化

由于果蔬汁飲品中含有色素、有機(jī)酸、脂肪等物質(zhì)，會(huì)對(duì)農(nóng)藥組分的測(cè)定產(chǎn)生干擾，所以本實(shí)驗(yàn)考察了C18、SAX、GCB、PSA共4種凈化劑對(duì)果蔬汁飲品中各農(nóng)藥組分回收率的影響。結(jié)果見圖3。由圖3可知，以GCB作為凈化劑時(shí)，各農(nóng)藥組分回收率可達(dá)90%以上。因此，選擇GCB作為凈化劑。

圖3 各農(nóng)藥組分經(jīng)不同凈化劑處理后的回收率比較Fig.3 Comparison of recoveries of pesticide components treated with different detergents

2.6 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

在果蔬汁樣品中分別添加低、中、高3種不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，3次平行測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 方法的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 Results of standard addition recovery rate tests of method

續(xù)表

由表2可知，8種農(nóng)藥的3個(gè)水平的加標(biāo)回收率為84.4%～107%，表明本實(shí)驗(yàn)所建立的方法準(zhǔn)確度高，能夠滿足檢測(cè)實(shí)際樣品需要。

2.7 精密度實(shí)驗(yàn)

本方法的精密度通過對(duì)低、中、高3種不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)5次的測(cè)定進(jìn)行評(píng)價(jià)，測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 方法的精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table3 Precision tests results of method

續(xù)表

由表3可知，8種農(nóng)藥的精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.0%～6.3%，表明本實(shí)驗(yàn)所建立的方法具有良好的精密度。

2.8 實(shí)際樣品測(cè)定

按照上述實(shí)驗(yàn)方法，分別測(cè)定在市場(chǎng)隨機(jī)抽取的20份果汁樣品，結(jié)果均未檢出8種目標(biāo)農(nóng)藥。這說明樣品中目標(biāo)農(nóng)藥殘留濃度均低于檢出限或者不含有，整體情況良好。本實(shí)驗(yàn)對(duì)20份果汁樣品進(jìn)行加標(biāo)后處理再測(cè)定，由圖4可知，在較復(fù)雜基質(zhì)存在的條件下，使用該方法處理樣品仍能得到較好的結(jié)果。

圖4 加標(biāo)樣品與未檢出樣品經(jīng)富集處理后的色譜圖Fig.4 Chromatograms of spiked and undetected samples after enrichment

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用加壓毛細(xì)管電色譜-二極管陣列聯(lián)用法，通過對(duì)流動(dòng)相中有機(jī)相的組成、流動(dòng)相添加劑種類及濃度、流動(dòng)相的pH值、電壓強(qiáng)度和檢測(cè)波長(zhǎng)的優(yōu)化，以及樣品提取溶劑、凈化劑的比較，建立了同時(shí)分離檢測(cè)果蔬汁飲品中樂果、敵敵畏、克百威、甲萘威、莠去津、甲基對(duì)硫磷、馬拉硫磷和百菌清8種農(nóng)藥組分的親水作用電色譜法。結(jié)果表明，采用EP-100-20/45-1.8-C18親水作用毛細(xì)管電色譜柱，選擇pH值7.0的乙腈∶5 mmol/L Tris-HCl（66∶34，V/V）作為流動(dòng)相，電壓強(qiáng)度為-9 kV，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm的條件下，8種農(nóng)藥組分在一定質(zhì)量濃度范圍（樂果4～100 μg/mL、敵敵畏10～200μg/mL、克百威2～50μg/mL、甲萘威0.2～50μg/mL、莠去津0.1～20 μg/mL、甲基對(duì)硫磷4～100 μg/mL、馬拉硫磷12～120 μg/mL、百菌清3～65 μg/mL）內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線均具有良好的線性關(guān)系。樣品以1.0%氨水的乙腈提取并經(jīng)GCB凈化后，3個(gè)水平的加標(biāo)回收率能達(dá)到84.4%～107%，精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0%～6.3%，所建立的方法具有可靠的準(zhǔn)確度和精密度，能準(zhǔn)確快速有效地檢測(cè)果蔬汁飲品中的8種農(nóng)藥組分的含量，可為果蔬汁飲品中多種農(nóng)藥組分的分析和監(jiān)控提供技術(shù)支持。