1例遺傳性凝血因子Ⅶ缺陷癥患者的家系表型及基因突變分析

唐蘭艷，周偉杰，羅美玲，向利群，林發(fā)全

1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，南寧530021；2廣西百色市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科

凝血因子Ⅶ（FⅦ）是一種維生素K依賴性絲氨酸蛋白酶，由肝臟合成，當(dāng)血管內(nèi)皮受損后，組織因子（TF）即被暴露，F(xiàn)Ⅶ與TF接觸后形成TF-FⅦ復(fù)合物，后者可直接激活FⅩ和FⅨ，進(jìn)而生成凝血酶，故FⅦ在外源性凝血途徑啟動(dòng)中扮演重要角色。遺傳性FⅦ缺陷癥是由編碼FⅦ基因發(fā)生突變而引起的一種罕見出血性疾?。?］，呈常染色體隱性遺傳，臨床出血癥狀通常分為大出血者、輕微出血者和無(wú)癥狀者。為了預(yù)防或治療遺傳性FⅦ缺陷癥患者出血及其并發(fā)癥，主要使用凝血因子替代物來(lái)糾正凝血缺陷，包括新鮮冰凍血漿、凝血酶原復(fù)合物（PCC）、血漿源性FⅦ濃縮液以及重組活化FⅦ等［1-3］。研究發(fā)現(xiàn)，遺傳性FⅦ缺陷癥患者的出血癥狀與FⅦ凝血活性（FⅦ：C）存在異質(zhì)性，單一雜合子多為無(wú)癥狀者，而純合子與復(fù)合雜合子的出血癥狀常較為嚴(yán)重［4］。2018年5月—2019年7月，本研究對(duì)1例遺傳性FⅦ缺陷癥家系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室表型及基因突變檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)先證者及其父母FⅦ：C均降低，尤以先證者FⅦ：C降低最為顯著，先證者妹妹FⅦ：C正常；先證者存在FⅦ基因第8外顯子p.Thr241Asn雜合錯(cuò)義突變與FⅦ基因第7內(nèi)含子c.681+1G>T雜合剪接位點(diǎn)突變，先證者父親攜帶p.Thr241Asn雜合錯(cuò)義突變，先證者母親攜帶c.681+1G>T雜合剪接位點(diǎn)突變，先證者妹妹為野生型，通過分析提示上述突變與先證者及其父母FⅦ：C降低有關(guān)。本研究為臨床醫(yī)師評(píng)估該類患者在手術(shù)期或手術(shù)后的出血風(fēng)險(xiǎn)，提前做好預(yù)防性治療，規(guī)避出血事件發(fā)生，提供了一些數(shù)據(jù)支持與參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 先證者，男性，9歲，因行包皮環(huán)切術(shù)就診于我院泌尿外科。術(shù)前凝血檢查發(fā)現(xiàn)其凝血酶原時(shí)間（PT）明顯增高，且能被正?；旌涎獫{完全糾正；國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）升高；凝血酶原活動(dòng)度（PTA）顯著降低；活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、凝血酶時(shí)間（TT）及纖維蛋白原（FIB）均正常。凝血因子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其FⅦ：C顯著降低，F(xiàn)Ⅶ抗原含量（FⅦ：Ag）及其他外源性凝血因子（Ⅱ、Ⅴ、Ⅹ）活性均正常。先證者無(wú)自發(fā)性皮膚黏膜出血或外傷后出血不止，無(wú)肝臟疾病、肺結(jié)核和腎炎等病史，未使用抗凝藥物，肝功能、腎功能檢查結(jié)果均正常。術(shù)前24 h對(duì)先證者予輸注600 IU的PCC進(jìn)行預(yù)防性治療（200 IU/8 h），檢測(cè)結(jié)果顯示PT為39.80 s，INR為3.32，PTA為19%。手術(shù)過程順利，出血量約30 mL，無(wú)需輸血。術(shù)后繼續(xù)輸注800 IU的PCC（200 IU/8 h），檢測(cè)結(jié)果顯示PT為27.80 s，INR為2.24，PTA為21%，先證者無(wú)繼發(fā)出血，恢復(fù)良好。先證者父母為非近親結(jié)婚，先證者有一妹妹，家系成員均無(wú)出血及血栓相關(guān)疾病史。先證者及其家系成員均已簽署知情同意書。

1.2 家系表型分析方法 采集先證者及其家系成員的枸櫞酸鈉抗凝血各1管，每管2 mL，在IL-ALC TOP700血凝分析儀（美國(guó)IL公司）上采用凝固法分別檢測(cè)PT、INR、PTA、APTT、TT、FIB、因子Ⅱ活性（FⅡ：C）、因子Ⅴ活性（FⅤ：C）、因子Ⅶ活性和因子Ⅹ活性（FⅩ：C）；采集先證者及其家系成員、20名健康人的枸櫞酸鈉抗凝血各1管，每管2 mL，根據(jù)《罕見遺傳性出血性疾病診斷與治療中國(guó)專家共識(shí)（2021年版）》［5］，PT糾正試驗(yàn)采用患者血漿與20人份健康人混合血漿按照1：1混合，即刻檢測(cè)該混合血漿PT，然后置于37℃水浴1、2 h分別檢測(cè)PT。采集先證者及其家系成員的不抗凝全血各1管，每管5 mL，使用酶聯(lián)免疫吸附法（中國(guó)江蘇晶美公司）檢測(cè)FⅦ：Ag；采集先證者及其家系成員的不抗凝全血各1管，每管5 mL，在HITACHI 7600-020型生化分析儀（日本日立公司）上采用酶法分別檢測(cè)肝功能與腎功能。所有試劑均為配套試劑，操作步驟均按照儀器的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。

1.3 FⅦ基因突變分析方法 采集先證者及其家系成員的EDTA抗凝血各1管，每管2 mL，使用吸附柱法提取人類基因組DNA。在illumina HiSeq2500和ABI 3730 DNA分析儀上分別進(jìn)行高通量測(cè)序及Sanger測(cè)序，由北京金準(zhǔn)基因科技有限公司完成檢測(cè)。高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)FⅦ基因外顯子及剪切位點(diǎn)突變后，采用Sanger測(cè)序驗(yàn)證突變位點(diǎn)，應(yīng)用Primer Premier 3.0軟件設(shè)計(jì)引物，F(xiàn)Ⅶ基因第7外顯子及側(cè)翼的正向引物：5′-TCCCTCACAAATCTCTGCATC-3′，反向引物：5′-GTGGGCTTGGGGCTGAC-3′；FⅦ基因第8外顯子及側(cè)翼的正向引物：5′-AGAGCAC?GTCTCGGCTAGAG-3′，反向引物：5′-AGCCCCT?GAGACACTTGAGA-3′，使用Chromas Lite 2.01軟件比對(duì)測(cè)序結(jié)果與NCBI基因庫(kù)公布的參考序列（NG_009262.1），確定突變位點(diǎn)。應(yīng)用ClustalX2.1軟件（http：//www.clustal.org/clustal2/）比對(duì)來(lái)自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)10個(gè)物種（包括人類、紅原雞、熱帶爪蟾、黑猩猩、獼猴、家犬、小家鼠、褐家鼠、牛和斑馬魚）FⅦ基因的氨基酸序列。應(yīng)用FATHMM（http：//fathmm.biocompute.org.uk/）、Mutation Assessor（http：//mutationassessor.org/r3/）、PolyPhen-2（http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）、PROVE?AN（http：//provean.jcvi.org/seq_submit.php）和SIFT（http：//provean.jcvi.org/protein_batch_submit.php？species=human）五個(gè)生物信息學(xué)軟件分別預(yù)測(cè)突變氨基酸是否有害或?qū)Ⅶ蛋白質(zhì)功能有無(wú)影響。將NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)公布的FⅦ蛋白參考序列（NP_000122.1）作為模板，應(yīng)用SWISS-MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）構(gòu)建野生型與突變型FⅦ蛋白模型，并使用PyMOL2.2.0軟件（https：//pymol.org/2/）分析野生型與突變型FⅦ蛋白構(gòu)象。

2 結(jié)果

2.1 家系表型分析結(jié)果 先證者PT顯著增高，為49.00 s；INR明顯增高，為3.86；PT延長(zhǎng)能被健康人混合血漿完全糾正；PTA明顯降低，為10%；FⅦ：C顯著下降，為0.60%；其余指標(biāo)均正常。先證者父親FⅦ：C輕度降低，為42.70%；其余指標(biāo)均正常。先證者母親FⅦ：C約降至正常值的一半，為29.70%；其余指標(biāo)均正常。先證者妹妹各項(xiàng)指標(biāo)均正常。詳見表1。

表1 家系部分凝血功能及凝血因子活性結(jié)果

2.2 基因突變分析結(jié)果 先證者及其父親FⅦ基因第8外顯子均發(fā)生c.722C>A雜合錯(cuò)義突變（圖1A），即ACC→AAC，導(dǎo)致第241位蘇氨酸（Thr）突變?yōu)樘於０罚ˋsn）；先證者母親及先證者妹妹為野生型（圖1B）。先證者及其母親FⅦ基因第7內(nèi)含子均發(fā)生c.681+1G>T雜合剪接位點(diǎn)突變（圖1C）；先證者父親及先證者妹妹為野生型（圖1D）。應(yīng)用ClustalX2.1軟件比對(duì)來(lái)自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)10個(gè)物種之間FⅦ基因的氨基酸序列，結(jié)果顯示Thr241殘基保守性較低（圖2）。五個(gè)生物信息學(xué)軟件分析結(jié)果均提示p.Thr241Asn突變?yōu)橛泻ν蛔兓蛴绊懙鞍踪|(zhì)功能。FⅦ蛋白建模結(jié)果顯示，發(fā)生p.Thr241Asn突變后，Thr241與Val249殘基形成的兩個(gè)氫鍵和Asn241與Val249殘基形成的氫鍵相似。Thr241殘基位于FⅦ蛋白的催化功能區(qū)，當(dāng)發(fā)生p.Thr241Asn突變后，Asn241引起Gly177～Pro189肽鏈出現(xiàn)明顯的折疊與空間構(gòu)象改變。由于c.681+1G>T剪接位點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致10個(gè)氨基酸殘基（Val218～Gln227）缺失［6］，與野生型FⅦ蛋白比較，c.681+1G>T突變型FⅦ蛋白Ser207～Gln227肽鏈縮短為Ser207～Lys217肽鏈，導(dǎo)致Cys219與Cys224之間形成的鏈內(nèi)二硫鍵丟失，引起Ser207～Lys217肽鏈、Gly156～Glu192肽鏈發(fā)生較大的折疊與空間構(gòu)象改變。與野生型FⅦ蛋白比較，p.Thr241Asn&c.681+1G>T復(fù)合雜合突變型FⅦ蛋白Ser207～Lys217肽鏈（圖3A）和Gly156～Glu192肽鏈（圖3B）均發(fā)生明顯的空間構(gòu)象變化，且該復(fù)合雜合突變導(dǎo)致Gly156～Glu192肽鏈構(gòu)象變化與單獨(dú)c.681+1G>T突變引起該段肽鏈改變存在一些空間差異。

圖1 FⅦ基因第8外顯子及第7內(nèi)含子測(cè)序結(jié)果

圖2 FⅦ基因Thr241殘基保守性分析結(jié)果

圖3 野生型與p.Thr241Asn&c.681+1G>T復(fù)合雜合突變型FⅦ蛋白建模結(jié)果

3 討論

FⅦ的編碼基因?yàn)镕Ⅶ，位于第13號(hào)染色體長(zhǎng)臂3區(qū)4帶（13q34），大約距離FⅩ基因上游2.8 kb，由9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子組成［7］。FⅦmRNA的選擇性剪接可生成含38或60個(gè)氨基酸的前導(dǎo)序列，分別由外顯子1和2編碼，而肝臟中90%的FⅦ轉(zhuǎn)錄本不存在外顯子2，故前導(dǎo)序列多數(shù)情況下為38個(gè)氨基酸。外顯子3和4編碼部分前肽及γ-羧基谷氨酸區(qū)，外顯子5和6編碼兩個(gè)表皮生長(zhǎng)因子樣（EGF-1和EGF-2）區(qū)，外顯子7、8和9編碼具有催化作用的絲氨酸蛋白酶區(qū)（即催化區(qū)），因此成熟的FⅦ由406個(gè)氨基酸組成，具有上述4個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域［8］。遺傳性FⅦ缺陷癥由FⅦ突變引起，在罕見遺傳性出血性疾病中最為常見，其患病率約為1/500 000［4-5，9］，而在一些近親結(jié)婚很頻繁的地區(qū)或部落，該病患病率可能更高［8，10］。根據(jù)FⅦ：C和FⅦ：Ag的質(zhì)量缺陷不同，遺傳性FⅦ缺陷癥分為兩種類型［11］：Ⅰ型為數(shù)量缺陷，即FⅦ凝血活性（FⅦ：C）和FⅦ抗原含量（FⅦ：Ag）兩者均降低；Ⅱ型為質(zhì)量缺陷，即FⅦ：C下降，而FⅦ：Ag正?；蚪咏＃ㄌ崾綟Ⅶ蛋白存在功能缺陷）。根據(jù)臨床表現(xiàn)不同，遺傳性FⅦ缺陷癥患者分為三類［12］：大出血者，即至少有一種腦出血、胃腸道出血或關(guān)節(jié)出血的患者；輕微出血者，即無(wú)大出血史，但出現(xiàn)月經(jīng)增多、臍帶殘端出血、齒齦出血、鼻出血、皮膚黏膜出血或皮膚瘀斑等的患者；無(wú)癥狀者，即證實(shí)是遺傳性FⅦ缺陷癥而無(wú)自發(fā)輕微或大出血的患者。

遺傳性FⅦ缺陷癥的出血癥狀可表現(xiàn)為從無(wú)癥狀到危及生命，嚴(yán)重程度存在明顯的個(gè)體差異。MARIANI等［13］發(fā)現(xiàn)，515例遺傳性FⅦ缺陷癥患者中39%為無(wú)癥狀者，61%有出血癥狀，其中常見癥狀是鼻衄（61%）、皮膚瘀斑（46%）、齒齦出血（30%）、術(shù)后出血（25%）和經(jīng)血過多（在有癥狀的女性患者中占57.5%）。此外，較常見的出血癥狀為肌肉血腫、關(guān)節(jié)出血、血尿、消化道出血和腦出血［5］。通常情況下，F(xiàn)Ⅶ：C<70%者存在FⅦ缺陷，F(xiàn)Ⅶ：C<30%者有出血癥狀［11］。國(guó)際血栓止血學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)根據(jù)FⅦ：C水平不同，將遺傳性FⅦ缺陷癥分為三類［14］：嚴(yán)重缺陷，即FⅦ：C<10%（患者自發(fā)性大出血風(fēng)險(xiǎn)最高）；中度缺陷，即10%～20%（患者具有輕微自發(fā)性或觸發(fā)性出血風(fēng)險(xiǎn)）；輕度缺陷，即20%～50%（患者通常表現(xiàn)為無(wú)癥狀）。盡管如此，F(xiàn)Ⅶ：C<1%的FⅦ缺陷癥患者也可表現(xiàn)為無(wú)出血傾向［15］，說明FⅦ：C水平與臨床出血表型存在異質(zhì)性，兩者之間相關(guān)性弱［15-17］。由于再生障礙性貧血、急性髓性或淋巴細(xì)胞白血病、骨髓纖維化和造血干細(xì)胞移植等患者可發(fā)生獲得性FⅦ缺陷［18-20］，或者患者存在維生素K缺陷、罕見抗凝物等［15］，都會(huì)造成FⅦ：C水平降低，因此臨床醫(yī)師在診斷遺傳性FⅦ缺陷癥時(shí)，需與上述因素進(jìn)行鑒別。本研究中先證者為無(wú)癥狀者，PT明顯延長(zhǎng)，INR明顯增高，PTA明顯降低，F(xiàn)Ⅶ：C顯著降低，而PT糾正試驗(yàn)、APTT、TT、FIB、FⅦ：Ag、血小板計(jì)數(shù)和肝功能均正常，與遺傳性FⅦ缺陷癥的篩選試驗(yàn)結(jié)果相符［5］。臨床醫(yī)師綜合評(píng)估了先證者在圍手術(shù)期的出血風(fēng)險(xiǎn)，認(rèn)為其發(fā)生出血事件的概率較大，故術(shù)前及術(shù)后均對(duì)先證者予輸注PCC進(jìn)行預(yù)防性治療，手術(shù)過程順利，無(wú)需輸血，術(shù)后也無(wú)繼發(fā)出血，恢復(fù)良好。另外，先證者父親及母親FⅦ：C均輕度降低，但臨床上都無(wú)出血癥狀，其他檢測(cè)結(jié)果均正常，說明血液狀態(tài)良好，無(wú)需特殊處理。

FⅦ突變將導(dǎo)致遺傳性FⅦ缺陷癥，目前通用突變數(shù)據(jù)庫(kù)（UMD）共收錄了FⅦ突變800余種［21］，其中大部分為錯(cuò)義突變，約占78%，其余為剪切位點(diǎn)突變、小缺失、無(wú)義突變等，且以第8外顯子發(fā)生突變居多［7，17］。本研究中先證者及其父親FⅦ第8外顯子均存在c.722C>A雜合錯(cuò)義突變，導(dǎo)致p.Thr241 Asn，先證者母親及先證者妹妹均為野生型；還發(fā)現(xiàn)先證者及其母親FⅦ第7內(nèi)含子均發(fā)生c.681+1G>T剪接位點(diǎn)突變，先證者父親及先證者妹妹均為野生型。根據(jù)孟德爾遺傳學(xué)推測(cè)p.Thr241Asn突變來(lái)自先證者父親，c.681+1G>T突變來(lái)自先證者母親。對(duì)于p.Thr241Asn突變，國(guó)內(nèi)外已報(bào)道三個(gè)家系共四例遺傳性FⅦ缺陷癥患者［4，7，22］。本研究中，同源物種氨基酸多序列比對(duì)分析提示Thr241殘基保守性不高，我們得知紅原雞、小家鼠、褐家鼠及斑馬魚在第241位置的氨基酸分別為Ser、Val、Val和Val，并非Thr，由此推測(cè)單獨(dú)發(fā)生p.Thr241Asn突變對(duì)FⅦ蛋白的分泌及穩(wěn)定性影響較?。?］，該推論在先證者及其父親FⅦ：Ag含量正常中得到了證實(shí)。通過五個(gè)生物信息學(xué)軟件分析我們發(fā)現(xiàn)，p.Thr241Asn的預(yù)測(cè)結(jié)果較為一致，均顯示該錯(cuò)義突變可能為有害突變或影響FⅦ蛋白功能，說明p.Thr241Asn為致病性突變。FⅦ蛋白建模結(jié)果顯示，Thr241殘基位于絲氨酸蛋白酶區(qū)（即催化區(qū)），處于催化活性中心，發(fā)生p.Thr241Asn突變后，由于Thr和Asn均屬于極性、中性氨基酸，引起側(cè)鏈及極性的變化較小，因此野生型Thr241殘基、突變型Asn241殘基分別與Val249殘基形成的氫鍵相似。將野生型與p.Thr241Asn突變型FⅦ蛋白模型進(jìn)行比對(duì)，我們發(fā)現(xiàn)后者Gly177～Pro189肽鏈發(fā)生了明顯的折疊以及空間構(gòu)象的改變，這種改變可能是導(dǎo)致先證者及其父親FⅦ：C降低的主要原因。c.681+1G>T剪接位點(diǎn)雜合突變首次在一名馬來(lái)西亞籍遺傳性FⅦ缺陷癥患者中被報(bào)道［7］，該患者具有輕度出血癥狀，F(xiàn)Ⅶ：C為45%。CAVALLARI等報(bào)道了4例無(wú)血緣關(guān)系的泰國(guó)籍遺傳性FⅦ缺陷癥患者，其中兩例是c.681+1G>T純合子，臨床癥狀分別為胃腸道、顱內(nèi)出血；第三例是c.681+1G>T與W424X復(fù)合雜合子，有顱內(nèi)出血史；第四例是c.681+1G>T與C389G復(fù)合雜合子，癥狀為輕度出血［6］，該研究發(fā)現(xiàn)c.681+1G>T激活第7外顯子一個(gè)隱蔽供體剪接位點(diǎn)，導(dǎo)致一個(gè)編碼缺失10個(gè)氨基酸殘基（Val218～Gln227）的FⅦ變異體；還發(fā)現(xiàn)c.681+1G>T純合子雖僅分泌極少量具有功能的FⅦ蛋白，卻足以啟動(dòng)凝血，推測(cè)該FⅦ變異體與其分泌、活化和催化功能是兼容的。本研究通過FⅦ蛋白建模分析發(fā)現(xiàn)，c.681+1G>T突變型和p.Thr241Asn&c.681+1G>T復(fù)合雜合突變型FⅦ蛋白Ser207～Gln227肽鏈均縮短為Ser207～Lys217肽鏈，造成Cys219與Cys224之間形成的鏈內(nèi)二硫鍵丟失，導(dǎo)致Ser207～Lys217肽鏈、Gly156～Glu192肽鏈均發(fā)生明顯的折疊與空間構(gòu)象改變，但該兩種突變型FⅦ蛋白Gly156～Glu192肽鏈的空間構(gòu)象改變存在一些差異，可能是導(dǎo)致先證者與其母親FⅦ：C水平相差較大的根本原因。

總之，先證者及其父母FⅦ：C均降低，尤以先證者FⅦ：C降低最為顯著；先證者發(fā)生FⅦ基因第8外顯子p.Thr241Asn雜合錯(cuò)義突變與FⅦ基因第7內(nèi)含子c.681+1G>T雜合剪接位點(diǎn)突變，先證者父親攜帶p.Thr241Asn雜合錯(cuò)義突變，先證者母親攜帶c.681+1G>T雜合剪接位點(diǎn)突變。