2型糖尿病腎病患者血漿腸源性內(nèi)毒素水平變化及其意義

楊帆，陳燁，鄧梅，秦勝花，陸思顏，李金燕

桂林市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣西桂林541000

糖尿病腎病是糖尿病的慢性并發(fā)癥之一，是一種較為常見的疾病，也是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因，發(fā)病機(jī)制目前仍然不清楚，嚴(yán)重影響糖尿病患者的生存質(zhì)量［1］。糖尿病的高血糖狀態(tài)是糖尿病腎病的始動因素，糖脂代謝紊亂及腎臟血流動力學(xué)異常是糖尿病腎病的兩大病理生理基礎(chǔ)［2］。糖尿病腎病的治療主要包括血糖、血脂的控制以及腎臟血流動力學(xué)的改善，然而即使血糖、血脂、血壓控制達(dá)標(biāo)，仍不能完全阻止糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展，提示還有其他因素參與了糖尿病腎病的發(fā)展過程。近年來，研究者通過對腸道微生物與2型糖尿病的宏基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者的腸道微生物譜發(fā)生了改變，這導(dǎo)致了血漿LPS水平升高，并且激活炎癥因子，誘導(dǎo)一系列炎癥反應(yīng)［3-4］。因此，LPS能否通過炎癥途徑影響糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展需要探討。如果兩者存在相關(guān)性，那么調(diào)節(jié)腸道菌群、降低血漿LPS水平，或者阻斷LPS與免疫細(xì)胞表面受體的結(jié)合，極有可能可以早期干預(yù)糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。本研究觀察了2型糖尿病腎病血漿腸源性內(nèi)毒素（LPS）水平變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年1—12月桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治的2型糖尿病患者108例，男60例，女48例；年齡（57.13±9.95）歲；病程6（2～10）年；BMI（23.96±2.83）kg/m2；有吸煙史60.8%，飲酒史53.5%。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有研究對象均符合由世界衛(wèi)生組織（WHO，1999年）糖尿病專家委員會提出的2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①1型糖尿病、妊娠期間的糖尿病及特殊類型糖尿??；②合并糖尿病急性并發(fā)癥，如糖尿病高滲高血糖綜合征、糖尿病酮癥酸中毒或并發(fā)各種感染、應(yīng)激狀態(tài)；③甲亢、Cushing綜合征等內(nèi)分泌疾?。虎芨哐獕翰?、心肺功能不全、肝膽系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、風(fēng)濕免疫疾病、惡性腫瘤；⑤合并原發(fā)性及其他繼發(fā)性腎臟疾病，如診斷明確的腎小球腎炎、腎盂腎炎、IgA腎病、腎病綜合征、高血壓腎病等；⑥合并急性胃腸炎、慢性炎性腸病，如克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎等；⑦出現(xiàn)活動性尿沉渣（紅細(xì)胞、白細(xì)胞或細(xì)胞管型等）；⑧泌尿系超聲發(fā)現(xiàn)尿路梗阻、腎盂腎炎、結(jié)石等；⑨采樣前2周內(nèi)服用抗生素或益生菌等微生物制劑。以尿微量白蛋白/肌酐（ACR）為標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為糖尿病腎?。ˋCR>30μg/mg，34例）和糖尿病 組（ACR<30μg/mg，74例）。另選健康體檢人群32例作對照（健康對照組），男16例，女16例；年齡（52.38±6.75）歲；BMI（23.20±1.88）kg/m2；有吸煙史（每天至少吸1支煙并持續(xù)6個月或以上）8例（25%），飲酒史（長期飲酒達(dá)6個月以上或近1周大量飲酒達(dá)500 mL以上）10例（31.2%）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①無糖尿病、高血壓病、內(nèi)分泌疾病、風(fēng)濕免疫疾病、腎臟疾病、血脂異常、感染性疾??；②無急性胃腸炎、慢性炎性腸病，如克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎等；③采樣前2周內(nèi)未服用抗生素或益生菌等微生物制劑。本研究已獲得桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者簽署紙質(zhì)知情同意書。

1.2 觀察指標(biāo)及觀察方法 ①血漿LPS：所有研究對象空腹8 h，使用肝素作為抗凝劑的采血管采集靜脈血2 mL，30 min以1 000×g速度離心15 min，用移液器吸出上層血漿，裝于凍存管中，編號，將標(biāo)本放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，避免反?fù)凍融。使用人脂多糖/內(nèi)毒素（LPS）ELISA檢測試劑盒檢測血漿LPS水平，試劑盒反應(yīng)終止后5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，OD值為橫坐標(biāo)，使用Curve Expert軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品的OD值取兩孔的平均值，根據(jù)樣品的OD值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的濃度。②研究對象均空腹8 h，采集空腹靜脈血，比濁法檢測血清FPG、TC、TG、LDL-C、HDL-C、Scr、Cys-C，離子交換高效液相色譜法檢測全血HbA1C，免疫層析法檢測血漿hs-CRP。采用中國eGFR課題協(xié)作組推出的公 式 計(jì) 算eGFR=169×（Scr/88.4）-0.608×Cys-c-0.63×（Age）-0.157×0.83（if female）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，兩組比較選用T檢驗(yàn)，多組比較選用方差分析；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（QL~QU）表示，比較選用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較選用χ2檢驗(yàn)。兩個變量之間關(guān)系符合正態(tài)分布，用Pearson相關(guān)系數(shù)描述，不符合正態(tài)分布，用Spearman相關(guān)系數(shù)描述。使用二元Logistic回歸進(jìn)行糖尿病腎病的影響因素分析，首先采用單因素Logistic回歸對變量進(jìn)行初篩，再用多因素Logistic回歸調(diào)整混雜因素的影響。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血漿LPS、hs-CRP及血清TC、HDL-C、LDL-C水平和eGFR比較 血漿LPS及血清TC、HDL-C、LDL-C、hs-CRP水平和eGFR比較見表1。

2.2 各組血清FPG、TG及全血HbA1C水平比較 血清FPG、TG及全血HbA1C水平比較見表2。

表2 各組血清FPG、TG、HbA 1C水平比較［M（QL~QU）］

2.3 血漿LPS與年齡、性別、吸煙、飲酒、家族史、病 程、BMI、FPG、TC、TG、LDL-C、HDL-C、HbA1C、eGFR、hs-CRP等研究指標(biāo)的相關(guān)性 血漿LPS水平與年齡、病程、hs-CRP呈正相關(guān)（r=0.216、0.267、0.501，P均<0.05），與eGFR呈負(fù)相關(guān)（r=-0.318，P<0.05），與性別、吸煙、飲酒、BMI、FPG、TG、TC、HDL-C、LDL-C、HbA1C均無相關(guān)性（P均>0.05）。

表1各組血漿LPS、hs-CRP及血清TC、HDL-C、LDL-C水平和eGFR比較（±s）

表1各組血漿LPS、hs-CRP及血清TC、HDL-C、LDL-C水平和eGFR比較（±s）

注：與健康對照組比較，*P<0.05；與糖尿病組比較，△P<0.05。

組別糖尿病腎病組糖尿病組健康對照組n 34 74 32 LPS（pg/ml）1.97±0.21*△1.75±0.21*1.62±0.18 hs-CRP（mg/L）5.39±1.75△2.06±1.18-TC（mmol/L）4.51±0.85 4.35±1.01 4.47±0.53 HDL-C（mmol/L）1.00±0.23*1.05±0.27*1.51±0.30 LDL-C（mmol/L）2.89±0.64 2.71±0.81 1.60±0.40 eGFR［mL/（min·1.73 m2）］77.50±39.69*△97.50±27.57*104.93±14.60

2.4 2型糖尿病腎病發(fā)病影響因素和危險(xiǎn)因素 為了初步篩選2型糖尿病腎病的影響因素，將患者各指標(biāo)分別帶入二元Logistic回歸進(jìn)行單因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示病程、eGFR、hs-CRP、LPS與2型糖尿病腎病發(fā)病有關(guān)（P均<0.05）。將單因素分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的指標(biāo)為自變量，使用多因素二元Logistic回歸分析評價(jià)2型糖尿病腎病發(fā)病的危險(xiǎn)因素，納入的變量包括病程、eGFR、hs-CRP、LPS，結(jié)果顯示LPS、hs-CRP是2型糖尿病腎病發(fā)病的危險(xiǎn)因素（P均<0.05）。詳見表3、4。

表3 2型糖尿病腎病發(fā)病單因素Logistic回歸分析結(jié)果

表4 2型糖尿病腎病發(fā)病單因素Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病的慢性并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎臟病的主要原因之一。研究［5-8］表明，我國2型糖尿病患者患糖尿病腎病的比例為10%～40%。糖尿病導(dǎo)致的慢性腎臟病所占的比例也逐漸增高，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。以往我們對糖尿病腎病的治療主要包括血糖、血脂的控制以及腎臟血流動力學(xué)的改善，然而即使患者的血糖、血脂、血壓控制達(dá)標(biāo)，仍不能完全阻止糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展，提示除了上述兩點(diǎn)因素外，還有其他因素參與糖尿病腎病的發(fā)展過程。近年我們通過深入的研究，發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展還與氧化應(yīng)激、慢性炎癥、腎單位細(xì)胞內(nèi)信號通路的激活等因素相關(guān)［9-12］。目前研究表明，2型糖尿病患者的腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致了血漿LPS水平升高，并且激活炎癥因子，誘導(dǎo)一系列炎癥反應(yīng)［4］。因此，我們猜想血漿LPS是否可以介導(dǎo)腎臟的慢性炎癥反應(yīng)，促進(jìn)糖尿病患者的腎臟病變？本研究通過分析2型糖尿病腎病患者血漿LPS水平變化，以探索早期干預(yù)糖尿病腎病的治療靶點(diǎn)。

脂多糖，又稱內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁成分，也是由微生物群釋放的。脂多糖由脂質(zhì)A（疏水區(qū)）和O抗原核心區(qū)（親水區(qū)）組成，是一種兩親性分子。脂多糖影響促炎細(xì)胞因子的分泌，被認(rèn)為是胰島素抵抗的觸發(fā)因素［13］。本研究顯示，2型糖尿病患者血漿LPS水平較健康對照組高。分析原因，可能由于腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致革蘭氏陰性桿菌比例增多以及腸道通透性增加，增多的內(nèi)毒素通過通透性增加的腸壁進(jìn)入血液循環(huán)。升高的血漿LPS水平使得糖尿病患者體內(nèi)的炎癥反應(yīng)可能更加嚴(yán)重，且可能與2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。這與目前所認(rèn)為的代謝性內(nèi)毒素血癥增加了2型糖尿病的患病風(fēng)險(xiǎn)的觀點(diǎn)一致［14］。體外研究發(fā)現(xiàn)，LPS干預(yù)的2型糖尿病腎病患者的單核細(xì)胞TLR4、NF-κB P65蛋白表達(dá)和IL-6水平明顯高于健康對照組［15］。TLR4的表達(dá)與糖尿病腎病密切相關(guān)，TLR4可以導(dǎo)致NF-κB的核轉(zhuǎn)位及相應(yīng)免疫細(xì)胞的激活而發(fā)生轉(zhuǎn)錄，釋放促炎癥細(xì)胞因子，導(dǎo)致細(xì)胞增殖和凋亡，加重糖尿病腎病的發(fā)展，而LPS在人體內(nèi)可以與CD14結(jié)合，作為TLR4的配體［16］。由此可見，LPS可以加重糖尿病患者腎臟的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)浸潤的炎癥細(xì)胞釋放炎癥因子，導(dǎo)致腎損傷。本研究還顯示，2型糖尿病腎病患者h(yuǎn)s-CRP水平較2型糖尿病患者高。作為臨床上常用的一種炎癥標(biāo)志物，hs-CRP的水平不僅可以獨(dú)立預(yù)測糖尿病、代謝綜合征的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，且與2型糖尿病腎病的發(fā)生有關(guān)。本研究結(jié)果與已知研究結(jié)果基本一致。本文結(jié)果顯示，2型糖尿病腎病患者血漿LPS水平高于2型糖尿病患者，而且與hs-CRP呈正相關(guān)，因此LPS也可能能夠預(yù)測糖尿病腎病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。本文結(jié)果還表明，LPS還與年齡、病程呈正相關(guān)，可能是由于血漿LPS水平主要受腸道菌群的影響，而年齡大、病程長的患者體內(nèi)有害菌比例更高導(dǎo)致。最后通過多因素二元Logistic回歸分析，顯示LPS、hs-CRP可能是2型糖尿病腎病的危險(xiǎn)因素，提示導(dǎo)致糖尿病腎病患者產(chǎn)生慢性炎癥反應(yīng)的因素是多樣性的，而LPS極有可能是主要因素之一。

總之，2型糖尿病腎病患者血漿LPS水平升高，其與糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，有可能為早期干預(yù)糖尿病腎病提供治療靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)腸道菌群、降低血漿LPS水平或者阻斷LPS與免疫細(xì)胞表面受體的結(jié)合極有可能可以早期干預(yù)糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展，LPS有可能為早期干預(yù)糖尿病腎病提供治療靶點(diǎn)。本研究仍存在有不足之處，血漿LPS水平與糖尿病腎病的相關(guān)性研究為病例對照研究，需要進(jìn)一步進(jìn)行前瞻性隊(duì)列研究來進(jìn)一步確認(rèn)兩者的因果關(guān)系。其次，2型糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展極其復(fù)雜，尤其是在人體內(nèi)，它涉及多種危險(xiǎn)因素和遺傳背景，而這是一項(xiàng)涉及單一因素的臨床研究，故存在一定的局限性。此外，如果條件允許，我們還需要進(jìn)一步研究患者糞便中的的腸道菌群與LPS水平，與血漿LPS水平進(jìn)行對比，以排除潛在感染因素對實(shí)驗(yàn)的影響。