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    水楊酸鈉誘發(fā)大鼠聽皮層中GABARAP表達(dá)的改變

    2021-09-01 01:25:54左健李婷李雅蘭1肖倩文1葛佳麗1王采集14喬月華
    中華耳科學(xué)雜志 2021年4期
    關(guān)鍵詞:水楊酸鈉皮層抑制率

    左健李婷李雅蘭1,肖倩文1,葛佳麗1, 王采集1,,3,4喬月華

    1徐州醫(yī)科大學(xué)(江蘇221004)

    2徐州醫(yī)科大學(xué)形態(tài)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心(江蘇221004)

    3江蘇省人工聽覺工程實(shí)驗(yàn)室(江蘇221004)

    4徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院(江蘇221002)

    5淮安市淮安醫(yī)院(江蘇223200)

    耳鳴是指在沒有相應(yīng)外界聲源情況下對(duì)聲音的主觀感知[1]。耳鳴發(fā)病率很高,嚴(yán)重的會(huì)引起患者焦慮和抑郁,這些負(fù)面情緒又會(huì)加重對(duì)耳鳴的感知,形成惡性循環(huán)[2,3]。耳鳴病因復(fù)雜,機(jī)制不清,目前尚無有效的耳鳴治療方法[4]。水楊酸已成為制備耳鳴模型最廣泛的藥物[5]。聽皮層是聽覺通路上的最高級(jí)中樞,水楊酸誘發(fā)耳鳴并伴有聽力損失,而這種聽覺剝奪會(huì)引起聽皮層的興奮性增加和/或抑制作用減弱,導(dǎo)致聽皮層神經(jīng)自發(fā)放電活動(dòng)增加及神經(jīng)重塑,聽皮層神經(jīng)元異常興奮[6-9]。

    GABAA受體是大腦中樞中主要的抑制性受體[10]。五聚體通道可以由許多可能的亞基組成,但腦中最常見的組合由α1,β2和γ2亞基組成[11]。神經(jīng)元中抑制性突觸的可塑性涉及調(diào)節(jié)亞細(xì)胞區(qū)室和質(zhì)膜之間的GABAA受體運(yùn)輸[12,13]。GABAA受體相 關(guān) 蛋 白(GABAA receptor-associated protein,GABARAP)可以在運(yùn)輸過程中提供GABAA受體和細(xì)胞骨架之間的聯(lián)系,通過GABARAP與GABAA受體γ2亞基的胞內(nèi)環(huán)結(jié)合并且與含γ2亞基GABAA受體免疫沉淀,同時(shí)與微管蛋白免疫沉淀相互作用[14-16],從而將GABAA受體轉(zhuǎn)運(yùn)至胞膜上。盡管文獻(xiàn)表明GABARAP參與神經(jīng)元中GABAA受體的轉(zhuǎn)運(yùn),但GABARAP在耳鳴中的作用尚不清楚。因此,本研究采用長(zhǎng)期注射水楊酸鈉建立大鼠耳鳴模型后,檢測(cè)聽皮層中GABARAP表達(dá)的變化,初步探討在耳鳴中的可能機(jī)制,為耳鳴機(jī)制研究提供新的思路。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    選擇成年雄性Sprague Dawley大鼠126只(徐醫(yī)大動(dòng)物中心提供),清潔級(jí),體重250-300g,大鼠無強(qiáng)聲暴露、耳毒性藥物等使用史,隨機(jī)分組。本實(shí)驗(yàn)過程符合徐醫(yī)大動(dòng)物中心動(dòng)物管理?xiàng)l例規(guī)定。

    1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

    水楊酸鈉(美國(guó)Sigma公司s3007),GABARAP引物(生工生物工程有限公司),GAPDH引物(生工生物工程有限公司),BCA檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司P0010),兔多克隆抗GABARAP抗體(美國(guó)Novus公司NBP1-71771),鼠單克隆抗GAPDH抗體(美國(guó)Proteintech公司60004-1-ig)。

    1.2 方法

    1.2.1 動(dòng)物分組及模型制備

    耳鳴模型分組基于先前的研究[17,18]。隨機(jī)分為7組:對(duì)照注射、慢性注射7天組;對(duì)照注射、慢性注射14天組;停藥后恢復(fù)3天組、7天組及14天組(對(duì)照組200mg/kg生理鹽水腹腔注射,于上午8時(shí)和下午4時(shí)各注射一次,按天數(shù)注射;實(shí)驗(yàn)組200mg/kg水楊酸鈉腹腔注射,操作同上)。所有動(dòng)物分別造模成功后于的第二天上午8時(shí)處死。

    1.2.2 驚跳反射抑制(Pre-Pulse Inhibition,PPI)

    耳鳴檢測(cè)參照以往研究[19]。隔音屏蔽室中檢測(cè)不同組別大鼠前脈沖驚跳刺激的PPI值來進(jìn)行比較。所用PPI程序:在給予驚跳反射刺激(ASR)前,發(fā)放三種不同強(qiáng)度的前脈沖驚跳刺激75 dB SPL、80dB SPL和 85dB SPL(分別為 PPI2,PPI4和PPI8)。每次實(shí)驗(yàn),將大鼠置于65dB SPL白色背景噪聲中適應(yīng),先為大鼠隨機(jī)分配10次115dB SPL脈沖刺激,然后通過揚(yáng)聲器30次隨機(jī)聲刺激(10次115dB SPL脈沖刺激、10次沒有前聲的驚跳反射刺激和10次前脈沖驚跳反射刺激)。根據(jù)公式PPI%=1-(ASR-PPI)/ASR×100%來計(jì)算前脈沖抑制率。

    1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

    每組6只大鼠用3%戊巴比妥那(30mg/kg)麻醉后,斷頭取腦迅速分離出聽皮層。采用Trizol法提取總RNA,根據(jù)PCR試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。上海生工設(shè)計(jì)合成引物,引物序列為5’to 3’:GABARAP 上 游 TTGTCAACAATGTCATTC‐CACC, 下 游 TCTCTTTGTAGAATGGAACCCC;GAPDH上游 AGACAGCCGCATCTTCTTGT,下游CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT。PCR反應(yīng)體系:EvaGreen 2x qPCR MasterMix 5μL,PCR Forward Primer(10μM)0.5μL,PCR Reverse Primer(10μM)0.5μL,DNA 模板 1μL,dH20 3μL,總體積 10.0μL。各基因表達(dá)變化采用比較閾值法即計(jì)算2—△△CT。

    1.2.4 Western Blot

    每組6只大鼠麻醉后,斷頭取腦迅速分離出聽皮層。提蛋白,測(cè)蛋白濃度,電泳完后轉(zhuǎn)膜。封閉,4℃孵育多克隆抗GABARAP(1:1000)和鼠單克隆抗GAPDH(1:5000)搖床過夜。洗滌條帶,孵二抗,洗滌條帶,掃描條帶。選用GAPDH作為內(nèi)參,并用Image J軟件分析。

    1.2.5 免疫熒光

    每組6只麻醉后,4%多聚甲醛灌注固定。脫水包埋。冰凍切片16μm。抗原修復(fù),漂洗,封閉,一抗孵育過夜。次日漂洗,孵二抗,再漂洗。加一滴免洗DAPI,封片,正置熒光顯微鏡下觀察拍照。每組計(jì)數(shù)18張腦片單位面積平均熒光強(qiáng)度,取其平均值。

    1.2.6 統(tǒng)計(jì)

    數(shù)據(jù)處理使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。兩組間均數(shù)差異性比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間均數(shù)差異性比較使用單因素方差分析(Dunnett事后檢驗(yàn))。均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差用于表示計(jì)量資料,P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 水楊酸鈉成功誘導(dǎo)大鼠耳鳴樣行為

    不同組別大鼠的PPI值()(圖1、表1)。與對(duì)照組比較,慢性注射7天組,PPI2、PPI4和PPI8均顯著升高(t=-7.033,P=0.002;t=-4.769,P=0.009;t=-4.881,P=0.008,P<0.05)。慢性注射14天組和停藥后恢復(fù)3天組較對(duì)照組,PPI2、PPI4和PPI8均顯著升高(F=8.516,P=0.046,P=0.009;F=9.742,P=0.046,P=0.000;F=2.667,P=0.027,P=0.006,P<0.05);停藥后恢復(fù)7天組、14天組與對(duì)照組比較,PPI2、PPI4和PPI8無顯著差異(F=8.516,P=0.551,P=0.171;F=9.742,P=0.591,P=0.058;F=2.667,P=0.317,P=0.073,P>0.05)。前脈沖抑制率越大,驚跳反射被抑制就越小。耳鳴填補(bǔ)前脈沖刺激,從而減小前抑制作用。

    圖1 水楊酸鈉對(duì)前脈沖抑制率的影響。A:慢性注射7天組大鼠的PPI抑制率;B:慢性注射14天組、停藥后恢復(fù)3天組、7天組及14天組大鼠的PPI抑制率;數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示;前脈沖刺激:PPI2:75dB SPL;PPI4:80dB SPL;PPI8:85dB SPL(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)Fig.1 Effect of sodium salicylate on pre-pulse inhibition.A:The PPI inhibition rate of rats in SS7d;B:The PPI inhibition rate of rats in SS14d,HF3d,HF7d and HF14d(Values are ex‐pressed as mean±SD;pre-pulse stimulation:PPI 2,75dB SPL;PPI4,80dB SPL;PPI8,85dB SPL(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,respectively)

    表1 行為測(cè)量:不同組別間PPI值比較Table 1 Behavioral testing:Comparisons of PPI values among seven groups

    2.2 GABARAP在聽皮層中mRNA的表達(dá)

    慢性注射7天組與對(duì)照組相比,GABARAP mRNA表達(dá)無顯著差異(t=-0.376,P=0.732,P>0.05);慢性注射14天組、停藥后恢復(fù)3天組、7天組和14天組與對(duì)照組的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.017,P=0.999,P=0.848,P=0.902,P=0.133,P>0.05)。(圖2)。

    圖2 各組大鼠聽皮層中GABARAP mRNA的表達(dá)。A:SS7d組 GABARAP mRNA 表達(dá)無明顯變化(P>0.05)(n=6);B:SS14d、HF3d、HF7d、HF14d組與NS14d組比較,GABARAP mRNA表達(dá)沒有差異性(P>0.05)(n=6)。Fig.2 GABARAP mRNA expression in the auditory cortex of each group of rats..A:No significant change in GAB‐ARAP mRNA expression in SS7d(P>0.05)(n=6);B:There was no difference in GABARAP mRNA expression between SS14d,HF3d,HF7d,HF14d and NS14d(P>0.05)(n=6).

    2.3 GABARAP在聽皮層中蛋白的表達(dá)

    慢性注射7天組與對(duì)照組相比,GABARAP蛋白表達(dá)升高(t=-2.403,P=0.037,P<0.05);慢性注射14天組與對(duì)照組相比,GABARAP蛋白表達(dá)明顯升高(F=6.891,P=0.000,P<0.001),停藥后恢復(fù)3天組、7天組和14天組與對(duì)照組比較,GABARAP蛋白表達(dá)的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.891,P=0.089,P=0.431,P=0.133,P>0.05)(圖3)。

    圖3 各組大鼠聽皮層中GABARAP蛋白的表達(dá)A:慢性注射7天組GABARAP蛋白表達(dá)升高(*P<0.05)(n=6);B:慢性注射14天組GABARAP蛋白表達(dá)明顯升高(***P<0.001)(n=6);停藥后恢復(fù)3天組、7天組和14天組,GABARAP蛋白表達(dá)無明顯變化(P>0.05)(n=6)。Fig.3 GABARAP protein expression in the auditory cortex of each group of rats.A:The expression of GABARAP pro‐tein increased in SS7d(*P<0.05)(n=6);B:The expression of GABARAP protein was significantly higher in SS14d(***P<0.001)(n=6);There was no significant change in the expres‐sion of GABARAP protein in HF3d,HF7d and HF14d(P>0.05)(n=6)

    2.4 GABARAP在聽皮層中熒光的表達(dá)

    慢性注射7天組與對(duì)照組相比,GABARAP熒光表達(dá)升高(t=-3.315,P=0.008,P<0.05);慢性注射14天組與對(duì)照組相比,GABARAP熒光表達(dá)明顯升高(F=8.616,P=0.000,P<0.001),停藥后恢復(fù)3天組、7天組和14天組與對(duì)照組比較,GABARAP熒光表達(dá)的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.616,P=0.367,P=0.412,P=0.679,P>0.05)(圖4)。

    圖4 各組大鼠聽皮層中GABARAP熒光的表達(dá).。A:慢性注射7天組GABARAP平均熒光強(qiáng)度升高(*P<0.05)。B:慢性注射14天組GABARAP平均熒光強(qiáng)度明顯升高(***P<0.001)。停藥后恢復(fù)3天組、7天組和14天組與對(duì)照組比較,GABARAP平均熒光強(qiáng)度的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=6),標(biāo)尺50μm,標(biāo)記的標(biāo)尺20μm。Fig.4 GABARAP fluorescence expression in the auditory cortex of each group of rats.A:The average fluorescence in‐tensity of GABARAP increased in SS7d(*P<0.05).B:The av‐erage fluorescence intensity of GABARAP was significantly increased in SS14d(***P<0.001).There was no significant dif‐ference in the mean fluorescence intensity of GABARAP be‐tween HF3d,HF7d and HF14d(P>0.05).The data were ex‐pressed as mean ± SD(n=6),and the scale was 50μm,the scale of marked ruler was 20μm.

    3 討論

    大劑量的水楊酸會(huì)引起人和動(dòng)物強(qiáng)烈的耳鳴感。而PPI抑制率升高是動(dòng)物耳鳴的表現(xiàn)[19]。PPI檢測(cè)反映了高級(jí)認(rèn)知中樞對(duì)聽覺信息快速處理過程的調(diào)節(jié)[20]。與對(duì)照組相比,水楊酸鈉連續(xù)注射7天、14天組及停藥后恢復(fù)3天組大鼠的PPI抑制率顯著升高,這說明大鼠感知到了耳鳴。而停藥后恢復(fù)7天、14天組后大鼠PPI抑制率無明顯變化,表明耳鳴消失。Eggermont等人也指出,攝入大量的水楊酸會(huì)引起耳鳴和聽力下降,但是在停藥后這些癥狀會(huì)逐漸消失[21]。這與本研究一致,注射大劑量水楊酸鈉后,大鼠出現(xiàn)耳鳴,停藥恢復(fù)后大鼠耳鳴慢慢消失。

    大腦中抑制性神經(jīng)傳遞主要由通過GABAA受體介導(dǎo)作用的[22]。突觸后膜中GABAA受體的數(shù)量直接控制GABA能突觸傳遞的功效[23]。GABAA受體的運(yùn)輸是調(diào)節(jié)抑制性突觸可塑性途徑的重要組成部分[24]。GABAA受體相關(guān)蛋白(GABARAP)對(duì)含有γ2亞基的GABAA受體的影響主要有兩個(gè)方面:(1)調(diào)節(jié)離子通道的特性,可能是通過促進(jìn)受體的聚集;(2)可能通過增加受體的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸來調(diào)節(jié)細(xì)胞表面表達(dá)[25]。過表達(dá)GABARAP將會(huì)增加細(xì)胞膜表面GABAA受體的表達(dá)水平,相反,干擾GABARAP與GABAAR的γ2亞基絲氨酸磷酸化位點(diǎn)結(jié)合,則會(huì)導(dǎo)致GABAA受體表達(dá)水平的降低[24,26]。聽皮層過度興奮是耳鳴的感知基礎(chǔ),在本實(shí)驗(yàn)中,長(zhǎng)期注射水楊酸鈉誘導(dǎo)的耳鳴大鼠聽皮層中GABARAP的mRNA表達(dá)沒有變化,可能水楊酸鈉并不影響GABARAP的轉(zhuǎn)錄水平。而水楊酸鈉慢性注射7天、14天組,耳鳴大鼠聽皮層中GAB‐ARAP的蛋白和熒光表達(dá)都顯著升高;停藥后恢復(fù)3天、7天及14天組,GABARAP的蛋白和熒光表達(dá)無顯著差異。這表明,在水楊酸誘導(dǎo)的耳鳴大鼠聽皮層中,GABARAP表達(dá)增高,間接導(dǎo)致細(xì)胞膜表面的GABAA受體的表達(dá)水平升高。水楊酸鈉誘發(fā)耳鳴會(huì)伴隨聽皮層的興奮活動(dòng)增加,這可能會(huì)導(dǎo)致抑制性受體GABAA受體的反饋性升高,來彌補(bǔ)興奮性受體的興奮毒作用,并隨著耳鳴的恢復(fù)GABAA受體逐漸恢復(fù)正常。GABARAP也與gephyrin相互作用,gephyrin與微管結(jié)合,并且已知是將甘氨酸和GABAA受體錨定在質(zhì)膜上的重要成分[27,28]。GABARAP不僅運(yùn)輸GABAA受體,而且運(yùn)輸GABAA受體功能所需的其他蛋白質(zhì),例如gephy‐rin[25]。在長(zhǎng)期水楊酸鈉應(yīng)用的耳鳴大鼠聽皮層中,GABARAP的表達(dá)增加也可能是其他運(yùn)輸GABAA受體功能的蛋白質(zhì)數(shù)量升高導(dǎo)致的。

    總之,長(zhǎng)期水楊酸鈉應(yīng)用導(dǎo)致大鼠耳鳴,這與聽皮層中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GABARAP表達(dá)增多有關(guān)。然而,在水楊酸鈉誘導(dǎo)的動(dòng)物耳鳴中,GABARAP運(yùn)輸GABAA受體的確切信號(hào)通路過程還需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)。

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