HPLC 法測(cè)定水楊酸鈉注射液中水楊酸鈉的含量

陳向丹，王 峻，龔 波，董書香

（湖北省獸藥監(jiān)察所，湖北武漢430070）

水楊酸鈉（sodium salicylate）又名鄰羥基苯甲酸鈉，為白色或微顯淡紅色的細(xì)微鱗片，或白色粉末及球狀顆粒，用于風(fēng)濕癥等。水楊酸鈉注射液由水楊酸鈉加適宜的抗氧劑和金屬絡(luò)合物制成的滅菌水溶液。靜脈注射用于馬、牛、羊、豬、犬的風(fēng)濕癥，是1種解熱鎮(zhèn)痛藥。目前，查閱到水楊酸鈉相關(guān)分析研究?jī)?nèi)容均不涉及高效液相色譜法[1-6]，僅查閱到水楊酸鈉注射液的國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)。其含量測(cè)定采用雙相滴定法。該法操作煩瑣，且乙醚存在刺激性大、沸點(diǎn)低、易燃等不安全性。為了避免使用乙醚對(duì)人體產(chǎn)生的刺激麻醉作用及其危險(xiǎn)性，同時(shí)提高專屬性，本試驗(yàn)擬采用高效液相色譜法對(duì)水楊酸鈉含量進(jìn)行測(cè)定，為水楊酸鈉含量的測(cè)定提供可行的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀-紫外檢測(cè)器（Agilent1260 Infinity Ⅱ，OpenLAB CDS ChemiStation Edition（C.01.09[144]）色譜工作站軟件）、分析天平（梅特勒AE 240）、乙腈為色譜純、冰乙酸為優(yōu)級(jí)純、水（超純水）。

1.2 藥品

水楊酸鈉對(duì)照品（含量：99.0%，批號(hào)：Z05A6Y2161，北京盛世康普化工技術(shù)研究院）；空白制劑：四川某已獲獸藥GMP認(rèn)證企業(yè)提供；供試品：水楊酸鈉注射液（四川3個(gè)已獲獸藥GMP認(rèn)證企業(yè)生產(chǎn)，含量規(guī)格均為10%，批號(hào)分別為：170401、20170101、20170901）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

最終色譜條件為：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充柱，以水-乙腈-冰乙酸（197∶100∶3）為流動(dòng)相、流速1.0 mL/min、檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm、柱溫30 ℃、進(jìn)樣量10μL。

1.3.2 溶液的制備

對(duì)照品溶液：精密稱取水楊酸鈉對(duì)照品25 mg，置100 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

供試品溶液：精密量取水楊酸鈉注射液5 mL，置100 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述供試品溶液5 mL，置100 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性與范圍（見圖1）

精密稱取水楊酸鈉對(duì)照品100 mg，置100 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液（約1 g/L）。分別精密量取貯備液適量，用流動(dòng)相分別稀釋至濃度為25、50、100、250、500 mg/L 的溶液，各取10 μL 進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，以濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，峰面積（mAU·s）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖1 可知，回歸方程：y=22.481x+134.9，R=0.999 7?？梢?，在此色譜條件下水楊酸鈉在25~500 mg/L范圍內(nèi)線性良好。

圖1 水楊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of sodium salicylate

2.2 準(zhǔn)確度（見表1）

精密量取水楊酸鈉注射液制劑空白5 mL，置100 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述供試品空白溶液5 mL，置100 mL 量瓶中。水楊酸鈉對(duì)照品按照各主成分80%、100%、120%3 個(gè)水平各3 份分別進(jìn)行添加制備供試樣，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。由表1可知，水楊酸鈉平均回收率為99.76%，RSD為0.3%，表明該法符合試驗(yàn)分析要求、準(zhǔn)確度高。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests(n=9)

2.3 精密度

精密吸取對(duì)照品溶液（水楊酸鈉250 mg/L）10μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得水楊酸鈉峰面積平均值為5 953.1，RSD為0.1%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4 專屬性（見圖2）

在色譜條件下，分別取樣品空白制劑溶液、水楊酸鈉對(duì)照品溶液以及供試品溶液注入液相色譜儀。

由圖2 可知，色譜圖中水楊酸鈉峰與各雜質(zhì)峰分離效果好，含量測(cè)定不受其他雜質(zhì)峰的干擾。

2.5 溶液的穩(wěn)定性

取同一樣品溶液（批號(hào)20170901）（含水楊酸鈉250 mg/L），按色譜條件，在不同時(shí)間（0、2、4、6、8、10、12、24 h）分別進(jìn)樣10μL，記錄色譜峰面積，考察樣品的穩(wěn)定性，測(cè)得水楊酸鈉峰面積平均值為5 952.9，RSD 為0.1%，結(jié)果表明，樣品溶液在室溫下24 h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.6 耐用性

在本研究的色譜條件下，分別考察了Waters SymmetryShieldRP18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，4 μm）以及Waters Xbridge C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）3 種色譜柱。結(jié)果表明，3 種色譜柱均可使水楊酸鈉分離度及理論塔板數(shù)良好，在本研究流動(dòng)相下選擇溫度為25 ℃和35 ℃時(shí)，除出峰時(shí)間發(fā)生變化外，其余變化很小；將流動(dòng)相流速調(diào)整為0.9 mL/min 和1.1 mL/min 進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果表明，流動(dòng)相流速的微調(diào)也僅能影響出峰時(shí)間，對(duì)峰形和理論塔板數(shù)影響甚小。綜上所述，不同品牌的色譜柱、不同流動(dòng)相流速以及不同溫度，均能滿足試驗(yàn)需要，方法耐用性較好。

2.7 樣品測(cè)定（見表2）

分別取不同廠家不同批號(hào)的樣品，采用色譜條件進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算水楊酸鈉的含量，同時(shí)按原含量測(cè)定方法測(cè)定含量。由表2可知，原方法與修訂后的方法結(jié)果基本一致，高效液相色譜法可作為水楊酸鈉注射液中主藥的含量測(cè)定的參考方法。

圖2 高效液相色譜圖Fig.2 The high performance liquid chromatogram

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果Tab.2 Results of contents determination of samples(labelled amount/%,n=3)

3 討論

3.1 提取方法的考察

水楊酸鈉在水中易溶，在乙醇中溶解。分別采用水和流動(dòng)相溶解稀釋，均可較好溶解，但水溶解后相同條件采集的色譜圖中溶劑產(chǎn)生的色譜峰較大，故選擇流動(dòng)相溶解。

3.2 流動(dòng)相的選擇

查閱相關(guān)文獻(xiàn)，先后考察多種流動(dòng)相[7-12]。反相色譜系統(tǒng)的流動(dòng)相常用甲醇-水系統(tǒng)和乙腈-水系統(tǒng)，用紫外末端波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)宜選用已經(jīng)乙腈-水系統(tǒng)，減少鹽溶液對(duì)色譜系統(tǒng)的污染，提高色譜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，最終選用氟苯尼考及其制劑的含量測(cè)定方法的流動(dòng)相。選擇此色譜條件實(shí)現(xiàn)1種方法兩種應(yīng)用，能夠節(jié)約成本、提高效率，從某種程度上還能控制非法添加物。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

水楊酸鈉的光譜圖最大吸收波長(zhǎng)為230 nm 和296 nm。在本試驗(yàn)色譜條件下，在296 nm處水楊酸鈉、氟苯尼考及甲砜霉素的混合對(duì)照品中的氟苯尼考及甲砜霉素基本不出峰，而在此色譜條件下230 nm處水楊酸鈉、氟苯尼考及甲砜霉素3個(gè)成分均能分離良好，根據(jù)吸收大，干擾小的原則最終選擇230 nm。

4 結(jié)論

高效液相色譜法具有經(jīng)濟(jì)、快捷、所用試劑毒性小、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。該法操作簡(jiǎn)單、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度及重現(xiàn)性均較好，可作為水楊酸鈉注射液的含量測(cè)定的1種補(bǔ)充方法，可為水楊酸鈉注射液含量的測(cè)定提供參考。