豚鼠耳蝸在不同中間液中掃描電鏡制樣效果的比較研究

曹鋐 崔穎

錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

掃描電鏡能夠將耳蝸的表面的結構放大幾千至上萬倍，并且其具有景深長，離體感強等特點。因此能夠根據樣本表面的三維結構對樣本進行綜合分析。但是由于其鏡筒內部是高真空的環(huán)境，水分在真空環(huán)境下揮發(fā)由于表面張力的緣故，會引起樣本收縮，破壞樣本微細結構，因此樣本在進行觀察之前要將樣本進行脫水干燥處理[1]。

由于耳蝸樣本中含有大量的水分，其無法與液態(tài)的CO2進行置換，因此要將耳蝸中的水分置換成能夠與液態(tài)CO2互溶的中間液體。醋酸異戊酯由于其與液態(tài)二氧化碳良好的相溶性，被廣泛的作為臨界點干燥法的中間液使用[2-4]。但其操作繁瑣，易揮發(fā)，對眼及上呼吸道粘膜有刺激性。為提高實驗效率，簡化實驗流程，減少醋酸異戊酯因揮發(fā)對空氣環(huán)境的污染，保護了實驗人員的安全，本文擬在常規(guī)豚鼠耳蝸掃描電鏡樣本制備方法的基礎上進探索新的中間液，并且利用掃描電鏡進行觀察對比兩種中間液的置換效果，旨在建立一種安全、有效、無污染的樣本制備方法，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：豚鼠6只，體重200-250g，2月齡，雌雄不限，購自維通利華動物飼養(yǎng)中心。耳廓反射良好。實驗豚鼠左耳為醋酸異戊酯組（對照組，con‐trol group），右耳為無水乙醇組（實驗組，experi‐mental group）。

實驗試劑：1%戊巴比妥鈉溶液，2.5%戊二醛溶液，0.1M PB溶液，1%四氧化鋨溶液，10%EDTA溶液，50%酒精溶液，75%酒精溶液，90%酒精溶液，無水乙醇，醋酸異戊酯，銀導電膠。

實驗設備：解剖顯微鏡，臨界點干燥儀，離子濺射儀，場發(fā)射掃描電鏡。

實驗器械：2ml無菌注射器，眼科剪，咬骨剪，游絲鑷，組織剪，6cm玻璃皿，3ml移液管，15ml離心管，樣品臺。

1.2 方法

1.2.1 耳蝸取材固定

1%戊巴比妥鈉腹腔注射至豚鼠于深度麻醉，迅速斷頭取出雙側耳蝸。用咬骨剪打開聽泡，暴露耳蝸耳蝸圓窗，前庭窗。將其置于盛有2.5%的戊二醛溶液的玻璃皿中，于解剖顯微鏡下用游絲鑷將蝸尖挑破，并且將圓窗膜、前庭膜刺破。用移液管吸取2.5%的戊二醛固定液從蝸尖處緩慢注入，觀察前庭窗、圓窗處有淋巴液流出，重復3-4次，使固定液充滿耳蝸內部腔隙。將固定好的耳蝸置于4℃于24小時。

1.2.2 脫鈣

將固定好的耳蝸置于10%EDTA溶液進行脫鈣處理5-7天。

1.2.3 解剖內耳組織顯露觀察面

將脫鈣后的耳蝸置于盛有0.1M PB溶液的培養(yǎng)皿中，在解剖顯微鏡下用游絲鑷先將耳蝸的骨質去除，充分暴露膜迷路。游絲鑷自頂轉至底轉沿基底膜外側輕輕劃開，將螺旋韌帶血管紋與基底膜分離。將前庭膜、蓋膜依次撕掉，只保留基底膜于蝸軸上。

1.2.4 內耳組織處理

分別經四氧化鋨固定2h和單寧酸浸泡1h后，期間分別將耳蝸置于0.1M的磷酸緩沖中清洗1h。最后將耳蝸置于50%,70%,90%,100%不同濃度的乙醇溶液中進行梯度脫水處理,每個梯度脫水1h。

1.2.5 中間液處理

實驗組直接將耳蝸浸沒于無水乙醇中，啟動臨界點干燥儀，進行干燥處理；

對照組將耳蝸置于醋酸異戊酯中，室溫條件下靜置1小時。用醋酸異戊酯將耳蝸組織中的無水乙醇置換出來。啟動臨界點干燥儀，進行干燥處理。

1.2.6 離子濺射儀噴金處理

將兩組樣本分別用銀導電膠固定到銅制樣品臺上，待其干燥后置于離子濺射儀上進行噴金處理。

1.2.7 場發(fā)射掃描電鏡觀察及圖像采集

將耳蝸標本置于場發(fā)射掃描電鏡SU8200中，在1500×,2000×，6000×，8000×,12000×,15000×下觀察耳蝸不同位置的內毛細胞（inner hair cells,IHC）纖毛、外毛細胞（outer hair cells,OHC）纖毛、表皮板，及微絨毛的狀態(tài)，并采集圖像。

2 結果

實驗組同對照組相比較減少了醋酸異戊酯置換無水乙醇的步驟，相對節(jié)省了1個小時的實驗時間。

實驗組與對照組在不同放大倍數的情況下觀察耳蝸不同位置的內毛細胞纖毛，外毛細胞纖毛，表皮板，及微絨毛的狀態(tài)比較，二者成像質量上并未差異（圖1和圖2）。

圖1 實驗組（A—C）分別是正常豚鼠耳蝸的底圈，中圈，頂圈。AB圖顯示出完整的IHC和OHC纖毛整齊排列，C圖顯示底圈的第三排外毛細胞纖毛排列較凌亂，第一二排排列整齊。A1，B1，C1是底轉，中轉，頂轉的IHC局部放大圖，可見該處纖毛排列完整，未見內主細胞表皮板（IPH）和內緣細胞（BC）因表面張力導致細胞表面斷裂。A2，B2，C2是底轉，中轉，頂轉的OHC局部放大圖，可見該處纖毛排列完整，未見Deiter細胞指突因表面張力導致細胞表面斷裂。Fig.1 A-C:was the basal turn,the middle turn and the apex turn of the normal guinea pig cochleae in experimental group.Panel A and B showed the complete and orderly arranged cilia of the inner hair cells(IHC)and outer hair cells(OHC).Panel C showed that the cilia in the third row of outer hair cells in the basal turn were arranged in disorder,while the first and second rows were arranged in order.Panel A1,B1 and C1 were the local enlarged view of the IHC cilia,which were complete and orderly arranged,and there were no surface frac‐ture of IPH and BC which may have caused by surface ten‐sion of the cells.Panel A2,B2 and C2 were the local enlarged view of the OHC cilia,which were complete and orderly ar‐ranged,and there were no surface fracture of Deiter cells’phalangeal process which may have caused by surface tension.

圖2 對照組（A—C）分別是正常豚鼠耳蝸的底圈，中圈，頂圈。ABC圖顯示出完整的IHC和OHC纖毛整齊排列。A1，B1，C1是底轉，中轉，頂轉的IHC局部放大圖，可見該處纖毛排列完整，內毛細胞表皮板（IPH）和內緣細胞（BC）結構完整。A2，B2，C2是底轉，中轉，頂轉的OHC局部放大圖，可見該處纖毛排列完整，未見Deiter細胞指突結構完整。圖1和圖2成像效果未見明顯差異，均保留了良好的形態(tài)結構。Fig.2 A-C:was the basal turn,the middle turn and the apex turn of the normal guinea pig cochleae in control group.Panel A,B and C showed the complete and orderly arranged cilia of the inner hair cells(IHC)and outer hair cells(OHC).Panel A1,B1 and C1 were the local enlarged view of the IHC cilia,which were complete and orderly arranged,and showed the intact structure of IPH and BC.Panel A2,B2 and C2 were the local enlarged view of the OHC cilia,which were complete and orderly arranged,and showed the intact structure of Deit‐er cells’phalangeal process.These results showed the good morphological structure retained,and the imaging effects had no significant differences.

3 討論

耳蝸是動物體內重要的聽覺感受器官，由基底膜，血管紋，螺旋韌帶，螺旋神經節(jié)等結構組成?；啄ふ駝訒r毛細胞的纖毛和蓋膜之間發(fā)生剪切運動，導致纖毛彎曲，從而產生毛細胞的生物電變化，此時聲音傳遞由機械信號轉換為電信號的傳遞，由此可見毛細胞纖毛在聲音傳遞過程中承擔著舉足輕重的作用[4-6]。正常生理條件下外毛細胞的纖毛呈V字狀整齊排列，內毛細胞纖毛呈一字狀排列，當遭遇到外界物理因素或者化學因素造成纖毛大量的倒伏，斷裂，凋亡。比如強烈脈沖噪聲或者長時間的白噪聲或化療藥物均能對毛細胞纖毛造成不可逆損傷。纖毛固定在毛細胞頂端的表皮板上，每個內毛細胞的纖毛為30-60根，外毛細胞的纖毛為20-400根，因此要深入研究纖毛的物理狀態(tài)，常規(guī)的光學顯微鏡分辨率能力不能達到[9-12]。因此根據掃描電鏡景深長，離體感強等特點。用掃描電鏡對樣本表面的三維結構進行綜合分析。

由于動物組織含有大量的水分，直接置于掃描電鏡的真空環(huán)境中，水分大量揮發(fā)，樣本會因表面張力而造成損傷無法對樣本進行準確分析研究。常用的組織干燥方法有臨界點干燥法，莰烯干燥法，叔丁醇干燥法，乙腈干燥法，冷凍干燥法，對位二氯苯干燥法等[3]。液體CO2臨界點干燥法是耳蝸掃描樣本制備過程中不可或缺的方法，根據玻爾茲曼因子等溫線可以得到液態(tài)的CO2在密閉環(huán)境中達到31.1℃，72.3atm的大氣壓下能夠發(fā)生氣液面消失[7,8]（圖3）。

圖3 CO2實驗實測的等溫線[7]圖示為p-Vm圖，當溫度低于臨界溫度Tc時，CO2氣液相變等溫線的直線段，隨著溫度升高，其直線段逐漸縮短。當溫度到達臨界溫度Tc時，飽和CO2液體和飽和CO2氣體界面消失，此為臨界狀態(tài)，臨界壓力為72.3atm，臨界溫度為31.1℃。當溫度大于48.1℃時，等溫線為相對均勻的曲線。Fig.3 The measured isotherm of CO2experiment.Fig shows the P-VM diagram.When the temperature is lower than the critical temperature Tc,the straight line segment of the CO2 gas-liquid phase variable isotherm gradually shrinks as the temperature rises.When the temperature reaches the critical temperature Tc,the interface between saturated CO2liquid and saturated CO2gas disappears.This is the critical state.The critical pressure is 72.3 ATM and the critical temperature is 31.1℃.When the temperature is greater than 48.1℃,the isotherm is a relatively uniform curve.

醋酸異戊酯由于其與液態(tài)二氧化碳良好的相溶性，被廣泛的作為臨界點干燥法的中間液使用。

在研究喉下腔粘膜假復層纖毛柱狀上皮細胞，小腸絨毛,支氣管絨毛等含水豐富的組織器官中，經過戊二醛，四氧化鋨的雙固定，酒精脫水，醋酸異戊酯作為中間液置換酒精，經過臨界點干燥儀干燥，離子濺射儀噴金處理后于掃描電鏡觀察，均未發(fā)生因表面張力導致的樣本的損壞，并且完整的保存了樣本的自然面貌[13]。耳蝸器官含水量較上述器官較少，因此醋酸異戊酯在耳科掃描電鏡制樣的應用效果較好，應用范圍更為廣泛，比如能夠詳細的反應因槍炮脈沖造成耳蝸毛細胞纖毛的斷裂、倒伏、散亂、脫落，氨基糖苷類藥物造成毛細胞變性，纖毛的凋亡缺失[4]。

但是由于操作過程中會因環(huán)境溫度較低的情況下在排氣管出發(fā)生冷凝返流到樣品室影響干燥效果，并且由于醋酸異戊酯蒸汽對眼及呼吸道粘膜有刺激性，會造成實驗人員麻醉，咳嗽，胸悶，惡心，頭痛，耳鳴，皮炎濕疹等危害[14]。與此同時當對含有大量脂質物質的樣本進行干燥時，因醋酸異戊酯能溶解脂質物質，因此與要避免使用醋酸異戊酯的使用。

本實驗通過用無水乙醇代替醋酸異戊酯作為中間液，通過掃描電鏡觀察耳蝸的超微結構未發(fā)現因表面張力變化導致的組織斷裂，成像效果同使用醋酸異戊酯組一樣，完整的還原了組織的結構。并且該實驗方法的改進，減少了實驗步驟，縮短了實驗時間，減避免了因醋酸異戊酯而造成的環(huán)境污染，保護了實驗人員的健康。