糖基化在囊膜病毒感染中的作用機(jī)制

武佳琪，黃金海

（天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300072）

糖基化是最復(fù)雜的蛋白質(zhì)翻譯后修飾過(guò)程之一，影響蛋白質(zhì)折疊、穩(wěn)定性、半衰期、蛋白質(zhì)間相互作用和信號(hào)傳導(dǎo)運(yùn)輸?shù)壬飳W(xué)過(guò)程［1］。附著的碳水化合物部分通過(guò)天冬酰胺（N-連接）側(cè)鏈的氮原子與肽或通過(guò)絲氨酸或蘇氨酸的氧原子（O-連接）連接至肽骨架N-X-S/T（X≠P）［2］，在不同糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，單糖殘基順序添加到目的蛋白上形成完整的糖鏈（圖1）。部分病毒蛋白可以受到糖基化的修飾，糖基化在囊膜病毒結(jié)構(gòu)蛋白的修飾中起重要作用［3］。病毒的糖蛋白可以介導(dǎo)其對(duì)宿主細(xì)胞的識(shí)別，結(jié)合以及入侵的整個(gè)感染過(guò)程，還可以幫助病毒逃避免疫系統(tǒng)的清除［4］。被感染的細(xì)胞也可以通過(guò)對(duì)病毒表面糖蛋白的識(shí)別而誘發(fā)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生細(xì)胞因子和抗體來(lái)殺滅病毒［5］。另外，宿主細(xì)胞上同樣存在可以被糖基化修飾的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)在病毒侵入中也發(fā)揮重要作用。本文就糖基化修飾在囊膜病毒感染及免疫中的作用機(jī)制進(jìn)行綜述，以期為抗病毒藥物和疫苗研制提供一定的理論基礎(chǔ)。

圖1 糖蛋白代表性的N-糖連接和O-糖連接類(lèi)型

1 糖基化修飾與囊膜病毒感染

糖基化是蛋白質(zhì)和脂質(zhì)中常見(jiàn)的修飾，大多數(shù)糖基化反應(yīng)發(fā)生在高爾基體上［6］。盡管初始單糖靶向糖蛋白或糖脂的轉(zhuǎn)移是在ER或ER膜上進(jìn)行的，但隨后添加不同糖基構(gòu)成成熟聚糖是在高爾基體中發(fā)生的［7］。高爾基體膜上布滿了糖基轉(zhuǎn)移酶、糖苷酶和核苷酸糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其排列順序通常是從順式高爾基體到反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)（TGN），這樣每種酶活性都可以作用于通路上較早產(chǎn)生的特定底物上［8］。例如介導(dǎo)糖鏈末端唾液酸化修飾［9］的唾液酸轉(zhuǎn)移酶（Sialyltransferase，ST）家族［10］，它們可以定位于高爾基體上進(jìn)行糖蛋白的特征修飾，賦予其識(shí)別功能。唾液酸轉(zhuǎn)移酶（ST）包含4種酶類(lèi)（表1）可以特異性地將底物CMP-Neu5Ac（唾液酸胞苷單磷酸酯）上的唾液酸殘基轉(zhuǎn)移至新的糖基受體上。感染初期，病毒必須先借助宿主細(xì)胞表面的受體或附著因子來(lái)附著細(xì)胞。除了可以將病毒粘附到目標(biāo)細(xì)胞外，這些感染初期的相互作用通常是決定病毒組織特異性和宿主范圍的關(guān)鍵。在此過(guò)程中，唾液酸被廣泛使用，作為大量病毒的初始連接受體［11］。唾液酸在蛋白和脂類(lèi)糖基化修飾中多以末端糖的形式存在，在病毒感染初期附著和侵染過(guò)程中發(fā)揮重要作用［12］。

表1 參與糖蛋白唾液酸化的唾液酸轉(zhuǎn)移酶類(lèi)型

1.1 免疫逃避作用

宿主細(xì)胞為了抵抗外來(lái)病原體所采取的重要手段之一是產(chǎn)生中和抗體［13］。相應(yīng)地，一些囊膜病毒為了逃避中和抗體的免疫作用，會(huì)采取許多方式來(lái)阻斷或降低中和抗體的特異性，其中最常用的方式是利用自身囊膜上的糖蛋白所連接的寡糖遮蔽對(duì)應(yīng)的抗原表位，從而逃避抗體的中和作用［14］。例如豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV是一種有囊膜的RNA病毒，感染該病毒會(huì)導(dǎo)致豬的肺部癥狀和仔豬死亡，嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)的發(fā)展。而PRRSV的結(jié)構(gòu)蛋白GP5臨近中和表位，對(duì)該表位的糖基化修飾會(huì)導(dǎo)致中和抗體產(chǎn)生受阻［15］。

1.2 病毒粒子裝配

糖基化位點(diǎn)的添加或缺失還會(huì)改變病毒蛋白的折疊和結(jié)構(gòu)，從而影響病毒的組裝和增殖。使用糖苷酶抑制劑阻斷蛋白質(zhì)的糖基化修飾，會(huì)導(dǎo)致該蛋白錯(cuò)誤折疊，無(wú)法發(fā)揮其正常功能［16］。如E1和E2蛋白屬于HCV包膜表面的糖蛋白，當(dāng)這兩種蛋白的糖基化被抑制后，蛋白質(zhì)無(wú)法正常轉(zhuǎn)運(yùn)并分泌。L、M和S蛋白屬于HBV包膜表面的糖蛋白，當(dāng)這些蛋白的糖基化被抑制后，會(huì)導(dǎo)致病毒包膜的形成受阻［17］。

2 病毒蛋白糖基化

許多病毒具有嵌合著糖蛋白的脂質(zhì)層，包裹在病毒表面［18］，其中的糖蛋白受到糖基化修飾，并對(duì)病毒起保護(hù)性抗原的作用［19］。病毒蛋白一般具有糖基化類(lèi)型各不相同的糖蛋白，經(jīng)過(guò)糖基化修飾的病毒蛋白在許多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，比如識(shí)別宿主細(xì)胞，促進(jìn)膜融合，使病毒進(jìn)入細(xì)胞以及介導(dǎo)病毒的免疫逃逸現(xiàn)象［20］。PRRSV在粘附和侵染PAM的過(guò)程中都對(duì)病毒囊膜表面的唾液酸具有依賴(lài)性［21］。存在其他類(lèi)型的病毒與之相反是通過(guò)識(shí)別宿主細(xì)胞表面的唾液酸介導(dǎo)粘附的，例如一些輪狀病毒、冠狀病毒、腺病毒、JC病毒、呼吸道腸道病毒和鼠腦脊髓炎病毒等［22］。

2.1 識(shí)別宿主細(xì)胞表面受體

在病毒侵入細(xì)胞的過(guò)程中，識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞表面受體是必不可少的環(huán)節(jié)，這個(gè)過(guò)程可以通過(guò)病毒囊膜表面蛋白的糖基化修飾介導(dǎo)。之前的研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV感染細(xì)胞是通過(guò)細(xì)胞表面受體識(shí)別病毒表面的唾液酸進(jìn)行的，用于識(shí)別的唾液酸殘基并非位于宿主細(xì)胞膜上［23］。移除PRRSV非唾液酸的N端結(jié)合聚糖對(duì)感染無(wú)明顯影響，而移除PRRSV的N-糖苷鍵后可以降低PRRSV感染。研究表明，PRRSV囊膜表面的唾液酸與豬肺泡巨噬細(xì)胞上的唾液酸黏附素（pSn）有相互作用關(guān)系，而pSn可以通過(guò)其唾液酸依賴(lài)性介導(dǎo)PRRSV粘附［24］。PRRSV病毒入侵是通過(guò)囊膜上的多聚體與宿主細(xì)胞膜上的CD163受體結(jié)合來(lái)進(jìn)行的［25］。PRRSV有4種功能性糖蛋白，分別為GP2a、GP3、GP4和GP5［26］。之前有研究表明，病毒侵入是通過(guò)PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白GP2和GP4結(jié)合細(xì)胞表面CD163受體所介導(dǎo)的［27］。GP2可以與其他2個(gè)糖蛋白GP3和GP4結(jié)合，形成多聚體復(fù)合物并結(jié)合宿主表面受體，在病毒增殖中發(fā)揮重要的作用［28］。

2.2 細(xì)胞膜融合

融合蛋白是一種位于病毒表面的糖蛋白，它可以介導(dǎo)病毒被膜和靶細(xì)胞質(zhì)膜的融合過(guò)程，從而幫助病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞［29］。許多病毒表面都有對(duì)應(yīng)的融合蛋白來(lái)介導(dǎo)膜融合。如副粘病毒的F蛋白（fusionprotein）有多個(gè)糖基化位點(diǎn)，而其中有4個(gè)位點(diǎn)（85、366、471、191）受到了糖基化修飾，去除前3個(gè)位點(diǎn)會(huì)降低病毒的膜融合活性［30］，導(dǎo)致膜融合受阻。表明糖基化修飾可以調(diào)節(jié)病毒的細(xì)胞膜融合活性［31］。

3 宿主蛋白糖基化

對(duì)于宿主細(xì)胞來(lái)說(shuō)，宿主蛋白糖基化對(duì)自身的抗病毒功能至關(guān)重要。一些糖基化修飾可以抑制病毒的增殖和侵入，而一些糖基化修飾反而會(huì)促進(jìn)病毒的侵染［32］。病毒被膜上的受體可以介導(dǎo)它與宿主細(xì)胞糖蛋白的識(shí)別作用，例如流感病毒表面具有唾液酸受體［33］，宿主細(xì)胞膜的糖鏈上帶有唾液酸殘基，它們可以特異性結(jié)合流感病毒［34］，并協(xié)助病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。

3.1 先天免疫與適應(yīng)性免疫

在病毒侵染細(xì)胞的過(guò)程中，巨噬細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子來(lái)增強(qiáng)吞噬功能以及介導(dǎo)炎癥反應(yīng)來(lái)發(fā)揮抗病毒作用［35］。白細(xì)胞介素、干擾素等均為炎癥相關(guān)細(xì)胞因子，其中一些細(xì)胞因子對(duì)炎癥反應(yīng)起促進(jìn)作用，主要包括TNF-α、IL-1β等［36］。這些炎性因子大部分都是糖基化修飾的對(duì)象，在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，這些糖蛋白上的糖基被有序添加，延伸出糖鏈，并獲得相應(yīng)的生物學(xué)功能，在巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫中發(fā)揮作用［37］。IL-1β、IL6等在病原體入侵后可以促發(fā)炎癥反應(yīng)，抵抗病毒增殖［38］。

病毒入侵細(xì)胞后會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量免疫分子來(lái)發(fā)揮抗病毒作用［39］。而在免疫過(guò)程中釋放的許多免疫分子為糖蛋白，可以受到糖基化修飾，如免疫球蛋白G（IgG）。IgG可分為識(shí)別抗原類(lèi)型的Fab和結(jié)合效應(yīng)分子及細(xì)胞的Fc兩部分［40］。IgG具有典型的炎癥效應(yīng)功能，例如抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性（ADCC）［41］，但是IgG在臨床上也經(jīng)常被用來(lái)發(fā)揮抗炎作用［42］。Fc聚糖的唾液酸化可激發(fā)IgG的抗炎活性，一旦其第297位的糖基化位點(diǎn)受到唾液酸轉(zhuǎn)移酶的修飾獲得唾液酸殘基，自身反應(yīng)性IgG便會(huì)由引起免疫性疾病的分子轉(zhuǎn)化為抑制炎癥反應(yīng)的蛋白［43］。唾液酸化IgG Fc結(jié)合Ⅱ型FcgR，增加抑制性FcgRIIB在炎癥效應(yīng)中的表達(dá)［44］。通過(guò)選擇性地對(duì)在炎癥部位沉積的IgG進(jìn)行唾液化，可以減輕自身抗體介導(dǎo)的炎癥，并不影響血液循環(huán)系統(tǒng)中的IgG和循環(huán)中其他糖蛋白蛋白質(zhì)的唾液酸化［45］。因此，體內(nèi)唾液酸化可以幫助抑制病毒感染中適應(yīng)性免疫所引起的自身免疫疾病。

3.2 細(xì)胞噬性

細(xì)胞表面受體的糖基化修飾，對(duì)于病毒特異性靶向的宿主細(xì)胞類(lèi)型有決定作用。不同病毒受體識(shí)別的半乳糖和唾液酸連接的形式有差別，而這種不同的連接形式通常因?yàn)槲锓N差異而有所區(qū)別。比如SAα2，3Gal型半乳糖唾液酸連接形式通常表現(xiàn)在禽類(lèi)胃腸道上皮細(xì)胞上，而與之相對(duì)應(yīng)，SAα2，3Gal型連接是禽流感病毒優(yōu)先結(jié)合的對(duì)象。再比如SAα2，6Gal型半乳糖唾液酸連接形式通常表現(xiàn)在人呼吸道上皮細(xì)胞上，而與之相對(duì)應(yīng)，人源的流感病毒更傾向于結(jié)合SAα2，6Gal型連接［46］。流感病毒具有不同的亞型，但都具有由HA1和HA2兩部分構(gòu)成的血凝素（HA）抗原表位，該表位可以通過(guò)結(jié)合靶細(xì)胞上的唾液酸實(shí)現(xiàn)病毒的入侵過(guò)程［47］。流感病毒識(shí)別的宿主細(xì)胞糖鏈類(lèi)型，可以隨著病毒糖蛋白上氨基酸殘基的改變而發(fā)生變化［48］。例如將H3型流感病毒表面血凝素（HA）的非結(jié)合位點(diǎn)的205位的絲氨酸殘基改變?yōu)槔野彼釟埢《局荒茏R(shí)別SAα2，6Gal型唾液酸，即使該位點(diǎn)距離受體結(jié)合位點(diǎn)更遠(yuǎn)［49］。

PRRSV基于宿主細(xì)胞表面的特異性受體類(lèi)型而對(duì)某些巨噬細(xì)胞亞群具有特異性，豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）為PRRSV穩(wěn)定增長(zhǎng)的細(xì)胞系之一［50］。目前已知在PAM上有3種PRRSV的特異性受體，分別是唾液酸黏附素、硫酸乙酰肝素和CD163［51］。細(xì)胞表面特異性受體的糖基化修飾，對(duì)于病毒的識(shí)別與靶向有特殊意義［52］。CD163是一種Ⅰ型跨膜蛋白，可受到糖基化的修飾［53］。CD163的跨膜區(qū)序列較保守，在病毒識(shí)別與細(xì)胞分化過(guò)程中扮演重要角色。硫酸乙酰肝素是一種高度硫酸化的線性多糖，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面以及細(xì)胞外基質(zhì)中普遍存在并調(diào)節(jié)相應(yīng)信號(hào)分子［54］。唾液酸黏附素和硫酸乙酰肝素分別介導(dǎo)PRRSV的粘附和入侵，是PRRSV特定靶向于PAM細(xì)胞的重要條件［55］。

4 總結(jié)與展望

糖基化修飾在囊膜病毒生物學(xué)中的作用非常廣泛，介導(dǎo)其入侵、裝配、釋放等細(xì)胞感染過(guò)程。關(guān)于在病毒感染中糖基化修飾的研究不僅能夠深入發(fā)掘病毒的致病機(jī)理，也可以為疾病的治療提供依據(jù)。同時(shí)，靶向于糖鏈的抗病毒藥物具有不干擾宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸正常生成的優(yōu)勢(shì)，在抗病毒藥物和疫苗的研制中具有較高的研究?jī)r(jià)值。本文主要闡述了糖基化對(duì)不同類(lèi)型糖蛋白的修飾以及在病毒感染細(xì)胞過(guò)程中的機(jī)制與功能，以期能為今后的抗病毒研究提供思路。然而，關(guān)于病毒糖基化的具體修飾過(guò)程和調(diào)控機(jī)制尚不明確，還需要進(jìn)一步的探究。當(dāng)前隨著技術(shù)方法的不斷成熟，越來(lái)越多對(duì)糖基化修飾有調(diào)控作用的糖基轉(zhuǎn)移酶等相關(guān)酶類(lèi)已被鑒定，為后續(xù)的研究提供了可供參考的資源和策略。