杧果SC-SSR分子標(biāo)記反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

覃昱茗 張宇 黃國弟 莫永龍 羅世杏 榮濤

摘 要：采用正交設(shè)計(jì)方法，對(duì)影響PCR反應(yīng)體系的5個(gè)因素（Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物和模板DNA）進(jìn)行了優(yōu)化，建立了適用于杧果的SC-SSR-PCR反應(yīng)體系。結(jié)果表明，總反應(yīng)體系25 μL中，包含模板DNA用量100 ng·mL-1、Mg2+濃度2.00 mmol·L-1、引物濃度0.40 μmol·L-1、Taq DNA 聚合酶濃度1.00 U、dNTPs濃度0.15 mmol·L-1。利用優(yōu)化的杧果SC-SSR-PCR反應(yīng)體系對(duì)10對(duì)SC-SSR引物進(jìn)行驗(yàn)證，均能擴(kuò)增出清晰、明亮、特異的電泳條帶。因此，優(yōu)化的杧果SC-SSR-PCR反應(yīng)體系適用于杧果種質(zhì)鑒定和親緣關(guān)系分析。

關(guān)鍵詞：杧果 SC-SSR 正交設(shè)計(jì) 體系優(yōu)化

中圖分類號(hào)：S667.7 ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

杧果（Mangifera indica L.）為漆樹科重要常綠經(jīng)濟(jì)果樹，原產(chǎn)印度，其果實(shí)風(fēng)味極佳[1]。國內(nèi)海南、廣東、廣西、福建、云南、貴州、四川均有栽培[2-3]。起始密碼子-微衛(wèi)星擴(kuò)增多態(tài)性（start codon simple sequence repeat，SC-SSR）標(biāo)記是郭大龍等結(jié)合SCoT和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)開發(fā)出來的一種既能將標(biāo)記位點(diǎn)與表達(dá)序列緊密聯(lián)系，又具有相對(duì)較高多態(tài)性的新型分子標(biāo)記[4]。目前，SC-SSR標(biāo)記已應(yīng)用于獼猴桃遺傳多態(tài)性分析及其指紋圖譜構(gòu)建，但在其他物種中的應(yīng)用研究在國內(nèi)并不多[5]。

由于杧果高度異花授粉，種子高度雜合，且生產(chǎn)交易中往往存在同物異名和異物同名等問題，給杧果育種工作帶來了諸多阻礙[6-8]。SC-SSR分子標(biāo)記在種質(zhì)鑒定方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但在杧果中尚未有報(bào)道?；谶@些問題，本研究較全面地建立并優(yōu)化杧果的SC-SSR反應(yīng)體系，為其在杧果種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、遺傳多樣性分析等領(lǐng)域的應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

5份杧果材料（表1）采集自廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院果樹種質(zhì)資源圃。所用的10條SCoT引物和10條ISSR引物（表2）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA marker購買于北京天根生化科技有限公司。

實(shí)驗(yàn)儀器：凝膠成像系統(tǒng)（Bio-rad Geldoc XRt）、三恒電泳儀（HAD-JY600C）、Eppendorf離心機(jī)5810R、超微量分光光度計(jì)、Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler PCR儀。

1.2 基因組DNA提取及質(zhì)量檢測(cè)

選取健康無病蟲侵害以及機(jī)械損傷的杧果綠色嫩葉，放入冰盒中迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，采用植物DNA提取試劑盒（DNA secure plant Kit，天根生化科技北京有限公司）獲取芒果基因組DNA，通過測(cè)定230 nm、260 nm和280 nm波長(zhǎng)下的OD值和瓊脂糖凝膠電泳成像檢測(cè)DNA的純度和濃度，保存于-30℃冰箱以備后續(xù)研究。

1.3 正交試驗(yàn)確定SC-SSR-PCR反應(yīng)體系

參考杧果CDDP-PCR反應(yīng)體系研究的方法[7]，設(shè)計(jì)5因素4水平的L16（45）正交優(yōu)化試驗(yàn)方案（表3）。5因素分別為：Mg2+濃度、Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物和模板DNA。該試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案共產(chǎn)生16個(gè)處理，每個(gè)處理做3次重復(fù)，各處理總體系均為25 μL。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳的擴(kuò)增結(jié)果對(duì)每個(gè)處理結(jié)果進(jìn)行打分，打分范圍1-16，打分標(biāo)準(zhǔn)為條帶清晰度、整齊度、明亮度、豐富性、特異性[9]。打分結(jié)果用SPSS ?10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 SC-SSR-PCR優(yōu)化體系的確認(rèn)與驗(yàn)證

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min;前2個(gè)循環(huán)：95 ℃變性1 min，40 ℃退火1 min，72 ℃延伸100 s;后28個(gè)循環(huán)：95 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸100 s;最后72 ℃延伸8 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%質(zhì)量濃度的瓊脂糖凝膠中電泳，并在凝膠成像儀內(nèi)拍照，分析圖片。根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果確定SC-SSR-PCR的最佳反應(yīng)體系，隨機(jī)選用10個(gè)組合對(duì)5份杧果材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而進(jìn)一步確證最優(yōu)的杧果SC-SSR-PCR擴(kuò)增體系。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

以ISSR引物807和SCoT引物SC8作為組合引物為例，進(jìn)行16個(gè)處理的SC-SSR-PCR擴(kuò)增，結(jié)果差別較大。處理1肉眼可見的擴(kuò)增條帶只有一條，處理11、12、14擴(kuò)增出的條帶數(shù)量多、亮度高且條帶整齊，擴(kuò)增效果較為理想;其余處理也可以擴(kuò)增出多條條帶，但整齊度和亮度遠(yuǎn)不及處理11、12、14所得結(jié)果。

2.2 5個(gè)因素對(duì)SC-SSR-PCR反應(yīng)的影響分析

依據(jù)表3的評(píng)分結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，最終得到各因素的平均值和極差值，結(jié)果見表4。其中極差R值是反映某一因素對(duì)該反應(yīng)體系構(gòu)建影響的強(qiáng)弱，R越大代表該因素對(duì)PCR結(jié)果影響越大。由表4可知，該反應(yīng)體系中5因素對(duì)PCR結(jié)果影響強(qiáng)弱的最終排序是模板DNA>Mg2+>引物>Taq DNA 聚合酶>dNTPs。通過差異顯著性分析表明，模板DNA與其他的4個(gè)因素存在顯著差異;Mg2 +和引物之間差異不顯著，Taq DNA 聚合酶和dNTPs之間差異不顯著。

表5結(jié)合表3數(shù)據(jù)分析可知，DNA模板用量為100 ng和135 ng時(shí)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無顯著差異，但與65 ng、30 ng用量相比存在顯著差異;Mg2+濃度為1.50 mmol·L-1和2.0 mmol·L-1時(shí)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無顯著差異，但與1.0 mmol·L-1、2.5 mmol·L-1濃度相比存在顯著差異;引物濃度為0.60 μmol·L-1和1.00 μmol·L-1時(shí)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無顯著差異，但引物濃度為0.4 μmol·L-1、0.80 μmol·L-1時(shí)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果存在顯著差異;Taq DNA聚合酶用量為0.25 U和1.00 U時(shí)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無顯著差異，但與0.50 U、0.75 U用量相對(duì)比存在顯著差異;dNTPs濃度僅為0.10 mmol·L-1時(shí)，與其它3個(gè)濃度水平存在差異顯著，而其它3個(gè)濃度水平之間差異不顯著。

T1～T4，每一因素同一水平下的打分總和;不同的小寫字母表示總分的差異顯著（P<0.05） ，T1～T4分別與表3中的（1）～（4）對(duì)應(yīng)。

2.3 SC-SSR-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定性驗(yàn)證

根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的優(yōu)化結(jié)果，選用10對(duì)SC-SSR標(biāo)記引物（表2，每行引物一一對(duì)應(yīng)）分別對(duì)5份杧果材料進(jìn)行SC-SSR擴(kuò)增，以驗(yàn)證該體系在不同引物組合下的穩(wěn)定性。由圖2可知，10對(duì)SC-SSR引物均可以擴(kuò)增出清晰明亮的瓊脂糖凝膠電泳條帶，只是不同的SC-SSR引物擴(kuò)增出的共有性和特異性條帶數(shù)量有所不同，其中共有性條帶表現(xiàn)了杧果種內(nèi)的穩(wěn)定遺傳性，特異性條帶體現(xiàn)了品種間的遺傳差異，表明該優(yōu)化體系以及引物適用于杧果SC-SSR-PCR分析。

3 結(jié)論與討論

與單因素多水平逐級(jí)優(yōu)化法相比，正交優(yōu)化分析法將反應(yīng)體系內(nèi)不同因素之間的相互影響考慮入內(nèi)，大大降低了只針對(duì)某一因素確定最佳濃度或用量的片面性[10-16]。正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)除了考慮到各因素之間的綜合效應(yīng)，同時(shí)兼具省時(shí)、省力的特點(diǎn)優(yōu)勢(shì)[17-18]。

房志超對(duì)杧果ISSR反應(yīng)體系的建立進(jìn)行了優(yōu)化，運(yùn)用L16（45）正交設(shè)計(jì)對(duì)杧果ISSR反應(yīng)的模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物和Taq DNA聚合酶在4個(gè)水平上進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，總反應(yīng)體系25 μL，結(jié)果發(fā)現(xiàn)影響杧果ISSR-PCR反應(yīng)的因素從大到小依次為：模板Mg2+>引物>Taq DNA 聚合酶>dNTPs>DNA[19];而表4結(jié)果顯示影響杧果SC-SSR-PCR反應(yīng)的因素從大到小依次為：模板DNA>Mg2 +>引物>Taq DNA 聚合酶>dNTPs;這有可能是因?yàn)镾C-SSR是基于雙引物開發(fā)出的分子標(biāo)記技術(shù)，雙引物需要更精準(zhǔn)地與模板DNA進(jìn)行錨定，需要的模板DNA用量顯得尤為重要，而ISSR標(biāo)記是隨機(jī)分子標(biāo)記，較少的模板DNA用量進(jìn)行PCR擴(kuò)增即可表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性條帶，因而造成了各影響因素的重要性不盡相同。目前在杧果中尚未發(fā)現(xiàn)SCoT反應(yīng)體系建立優(yōu)化的相關(guān)報(bào)道，但是在其它多年生木本果樹中已出現(xiàn)相關(guān)研究報(bào)道。在荔枝中，5個(gè)因素對(duì)PCR反應(yīng)體系的影響由大倒小依次為：dNTPs>Mg2 +>模板DNA>引物>Taq DNA 聚合酶[20];在榴蓮蜜中，各因素在不同水平的變化對(duì)PCR反應(yīng)體系的影響為：dNTPs>引物>Mg2 +>Taq DNA 聚合酶>模板DNA[21]。上述研究表明，在荔枝和榴蓮蜜中進(jìn)行SCoT反應(yīng)體系建立與優(yōu)化，dNTPs都是對(duì)SCoT反應(yīng)體系建立影響最大的因素，這很有可能是因?yàn)樵谶M(jìn)行SCoT-PCR擴(kuò)增時(shí)，需要經(jīng)過更為復(fù)雜地反應(yīng)擴(kuò)增程序，模板DNA需要不斷的進(jìn)行雙螺旋結(jié)構(gòu)的分解、復(fù)制過程，需要大量的堿基原材料才能完成完善上述PCR擴(kuò)增，需要dNTPs提供PCR反應(yīng)進(jìn)行的大量原材料，因此dNTPs成為影響SCoT反應(yīng)體系建立與優(yōu)化最重要的因素。

依據(jù)筆者研究結(jié)果分析得出較為理想的SC-SSR-PCR反應(yīng)體系的建立可以選擇模板DNA的用量為100 ng或135 ng，表5顯示100 ng和135 ng模板DNA用量對(duì)SC-SSR-PCR反應(yīng)體系的建立結(jié)果影響無顯著差異，本著節(jié)約原則，可選用100 ng模板DNA用量;由正交試驗(yàn)L16（45）設(shè)計(jì)以及PCR凝膠電泳分析得出較為理想的SC-SSR-PCR反應(yīng)體系的建立可以選擇Mg2 +濃度2.00 mmol·L-1或2.50 mmol·L-1，但表5顯示2.00 mmol·L-1和2.50 mmol·L-1Mg2 +濃度對(duì)SC-SSR- PCR反應(yīng)體系的建立結(jié)果影響有顯著差異，因此Mg2+ 濃度選擇待定;依據(jù)Mg2 +濃度選擇的分析原理，SC-SSR-PCR反應(yīng)體系的建立可以選擇引物濃度為0.40 μmol·L-1或0.60 μmol·L-1，但表5顯示0.40 μmol·L-1和0.60 μmol·L-1引物濃度對(duì)SC-SSR-PCR反應(yīng)體系的建立結(jié)果影響有顯著差異，因此引物濃度選擇待定;Taq DNA聚合酶用量也采用同樣的分析原則，較為理想的SC-SSR-PCR反應(yīng)體系的建立可以選擇Taq DNA聚合酶用量0.50 U或0.75 U或1.00 U，但表5顯示0.50 U、0.75 U和1.00 U Taq DNA聚合酶用量對(duì)SC-SSR-PCR反應(yīng)體系的建立結(jié)果影響有顯著差異，因此Taq DNA聚合酶用量選擇待定;SC-SSR-PCR反應(yīng)體系的建立可以選擇dNTPs濃度0.10 mmol·L-1或0.15 mmol·L-1或0.20 mmol·L-1，但表5顯示0.15 mmol·L-1和0.20 mmol·L-1dNTPs濃度對(duì)SC-SSR-PCR反應(yīng)體系的建立結(jié)果影響無顯著差異，而0.10 mmol·L-1dNTPs濃度與0.15 mmol·L-1和0.20 mmol·L-1 dNTPs濃度對(duì)SC-SSR-PCR反應(yīng)體系的建立結(jié)果影響有顯著差異，本著節(jié)約原則dNTPs濃度在0.10 mmol·L-1和0.15 mmol·L-1之間做選擇。上述分析可以明確模板DNA用量為100 ng，凝膠電泳顯示處理11、12和14可以擴(kuò)增出清晰、層次分明的條帶，而只有處理12的模板DNA用量確定為100 ng，由此做出模板DNA用量100 ng·mL-1、Mg2+濃度2.00 mmol·L-1、引物濃度0.40 μmol·L-1、Taq DNA 聚合酶濃度1.00 U、dNTPs濃度0.15mmol·L-1的各組分濃度組合選擇。

依據(jù)上述分析，可以判斷反應(yīng)體系內(nèi)5因素對(duì)PCR結(jié)果影響強(qiáng)弱的最終排序是：模板DNA>Mg2+>引物>Taq DNA 聚合酶>dNTPs。正交反應(yīng)體系各因素的最佳濃度或用量組合是：模板DNA用量100 ng·mL-1、Mg2 +濃度2.00 mmol·L-1、引物濃度0.40 μmol·L-1、Taq DNA 聚合酶濃度1.00 U、dNTPs濃度0.15 mmol·L-1。10對(duì)SC-SSR引物均能擴(kuò)增出條帶整潔、主次分明、特異豐富的凝膠電泳結(jié)果，表明SC-SSR引物以及反應(yīng)體系適用于杧果的親緣關(guān)系分析。

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