植物生長調(diào)節(jié)劑對萱草不定芽誘導(dǎo)增殖的影響

李黎 曲彥婷 韓輝 唐煥偉 陳菲 熊燕

摘 要：為解決金娃娃萱草（Hemerocallis fulva）不定芽誘導(dǎo)過程中誘導(dǎo)率和增殖率較低的問題，采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，通過不定芽誘導(dǎo)及繼代增殖培養(yǎng)方法，利用顯著性分析，篩選出適宜的植物生長調(diào)節(jié)劑的種類及質(zhì)量濃度，確定金娃娃萱草的最佳培養(yǎng)方案。結(jié)果表明：最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.3 mg/L，誘導(dǎo)率最高可達98.7%，最佳不定芽增殖培養(yǎng)基為：MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.5 mg/L，增殖系數(shù)最高可達9.0。由此可知，適宜的植物生長調(diào)節(jié)劑的種類及濃度可以顯著提高萱草不定芽的誘導(dǎo)率和增殖系數(shù)。

關(guān)鍵詞：金娃娃萱草;不定芽;組織培養(yǎng);繼代增殖;植物生長調(diào)節(jié)劑

中圖分類號：S682.1??? 文獻標識碼：A?? 文章編號：1006-8023（2021）04-0022-05

Effects of Plant Growth Regulators on Adventitious Bud Induction and

Proliferation of? Hemerocallis fulva

LI Li1， QU Yanting1*， HAN Hui1， TANG Huanwei2， CHEN Fei1， XIONG Yan1

（1. Institute of Natural Resources and Ecology. HAS， National and Local Joint Laboratory of Wetland and Ecological

Conservation， Harbin 150040， China; 2. Heilongjiang Academy of Sciences， Harbin 150040， China）

Abstract：In order to solve the problem of low induction rate and proliferation rate during adventitious bud induction of Hemerocallis fulva， species and concentrations of plant growth regulators and the best culture scheme were determined by using plant tissue culture technology， adventitious bud induction， multiplication of subculture， and significance analysis. The results showed that the best adventitious bud induction medium was MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.3 mg/L， and the highest induction rate was 98.7%. The best adventitious bud proliferation medium was MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.5 mg/L， the highest proliferation coefficient was 9.0. In conclusion， the type and concentration of appropriate plant growth regulators can significantly increase the adventitious bud induction rate and proliferation coefficient of Hemerocallis.

Keywords：Hemerocallis fulva; adventitious bud; tissue culture; subculture multiplication; plant growth regulator

收稿日期：2021-02-02

基金項目：黑龍江省科學(xué)院科研基金項目（KY2020ZR05）

第一作者簡介：李黎，碩士，高級工程師。研究方向為園林植物育種。E-mail： LiLi-16688@126.com

*通信作者：曲彥婷，博士，研究員。研究方向為園林植物育種。E-mail： 290971992@qq.com

引文格式：李黎，曲彥婷，韓輝，等.植物生長調(diào)節(jié)劑對萱草不定芽誘導(dǎo)增殖的影響[J].森林工程，2021，37（4）：22-26.

LI L， QU Y T， HAN H， et al. Effects of pant growth regulators on adventitious bud induction and proliferation of Hemerocallis fulva[J]. Forest engineering，2021，37（4）：22-26.

0 引言

金娃娃萱草（Hemerocallis fulva）為百合科萱草屬多年生宿根草本植物，株高30 cm左右，是多倍體雜種中選育出的矮型優(yōu)良品種，是大花萱草中唯一一個多季開花品種[1-2]。金娃娃萱草花朵大、花色艷麗、花期長、觀賞性強、適應(yīng)性強、耐寒和耐旱，適宜在公園和廣場等綠地叢植，也可用做園林造景材料在庭院、道路和花海中建植，是城市綠化、美化中極具推廣應(yīng)用潛力的宿根花卉品種[3-6]。

萱草屬植物的繁殖方式有分株繁殖、莖芽扦插繁殖和種子繁殖等，但整體繁殖系數(shù)小，繁殖速度較慢，經(jīng)過多代繁殖還會造成品種退化，影響觀賞效果，其中最常用的分株繁殖易對母株造成損傷，產(chǎn)生病菌感染[7-8]。組織培養(yǎng)可以縮短育種時間，提高繁殖系數(shù)，保持種苗的優(yōu)良性狀，有利于種苗的規(guī)模化生產(chǎn)[9-11]。早在20世紀70年代國外最早進行了萱草屬植物的組織培養(yǎng)研究，國內(nèi)對萱草屬植物組織培養(yǎng)的研究起步稍晚。國內(nèi)相關(guān)專家[12-15]以萱草不同部位作為外植體進行組織培養(yǎng)，得出不同外植體培養(yǎng)效果各有差異。也有專家[16-17]分別以短縮莖、分蘗莖段作為外植體可以直接誘導(dǎo)出不定芽。對萱草屬植物的組織培養(yǎng)研究，主要集中在對外植體類型的選擇上，并且一般都是通過愈傷組織途徑，隨著繼代次數(shù)的增加，染色體會出現(xiàn)變異，影響無性系后代的性狀和分生能力，而利用外植體直接誘導(dǎo)不定芽可以建立穩(wěn)定的組織培養(yǎng)體系，而目前關(guān)于金娃娃萱草直接誘導(dǎo)不定芽的報道極少，且分化率和增殖率都比較低。植物生長調(diào)節(jié)劑是除基本培養(yǎng)基外另一種影響增殖過程的重要因素，通過施用不同的植物生長調(diào)節(jié)劑或單純改變生長調(diào)節(jié)劑的質(zhì)量濃度就可以使組培快繁過程的分化率和增殖系數(shù)大大增加[18-25]。本研究采用外植體直接誘導(dǎo)不定芽，對消毒方法、植物生長調(diào)節(jié)劑的種類、質(zhì)量濃度等開展研究，確定金娃娃萱草的最佳組織培養(yǎng)方案，為金娃娃萱草的工廠化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗材料采自黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所試驗地，引自遼寧省鞍山市臺安縣。試驗地位于哈爾濱市，屬中緯度溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年平均氣溫3～4 ℃，7月氣溫較高，平均為23 ℃，1月氣溫較低，最低達-45.4 ℃，年平均降水量為625 mm。選擇生長健壯無病蟲害，株高在30 cm左右的植株作為母株，每個處理選取90份材料用于初代接種，外植體取材時期為4月中下旬，此時期外植體的污染率最低，成活率高，最佳取材部位為幼芽。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌材料的獲得

以金娃娃萱草的幼芽作為外植體，將采集的外植體放入清水中浸泡，加入少量洗衣粉攪拌2～3 min，然后放入流水下沖洗4～6 h，于超凈工作臺上用75%酒精表面消毒30 s，用無菌水沖洗3～4次，浸泡于滅菌劑中消毒，用無菌水沖洗6～7次，接種于培養(yǎng)基上，采用2因素正交試驗設(shè)計，每個處理接種30瓶，每瓶接種1個外植體，重復(fù)3次，30 d后對外植體的污染率、死亡率進行統(tǒng)計，篩選滅菌劑的種類和消毒時間。

1.2.2 不定芽的誘導(dǎo)

將外植體接種在分別添加了不同質(zhì)量濃度植物生長調(diào)節(jié)劑6-芐基氨基腺嘌呤（6-BA） 1.0、2.0、3.0 mg/L和萘乙酸（NAA） 0.1、0.2、0.3 mg/L的培養(yǎng)基中，采用2因素3水平正交設(shè)計，每一處理3次重復(fù)，每次接種30瓶，30 d后統(tǒng)計各處理的芽誘導(dǎo)率。

誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出的不定芽數(shù)/（接種外植體數(shù)-污染外植體數(shù)）×100% 。

1.2.3 不定芽繼代增殖培養(yǎng)

在初代培養(yǎng)基礎(chǔ)上繼續(xù)篩選植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA和NAA的質(zhì)量濃度，采用2因素3水平正交設(shè)計，每一處理3次重復(fù)，每次接種30瓶，觀測芽生長情況及產(chǎn)生叢生芽數(shù)，篩選出植物生長調(diào)節(jié)劑的最佳質(zhì)量濃度，計算增殖系數(shù)。

增殖系數(shù)=增殖苗數(shù)/接種苗數(shù)。

1.2.4 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室內(nèi)白天溫度為（23±2） ℃，夜間不低于18 ℃，光照時間為12～14 h/d，光照強度為2 000 lx。

1.2.5 繼代培養(yǎng)周期

設(shè)置不同繼代培養(yǎng)周期，分別為15、20、25、30 d，接種到增殖培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，每個處理接種10瓶，每瓶接種3個芽，重復(fù)3次，30 d 后觀察并統(tǒng)計增殖系數(shù)及生長狀況，比較不同繼代周期對金娃娃萱草增殖效果的影響。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒方法的選擇

植物材料的表面滅菌劑有很多種，經(jīng)常使用的有氯化汞、次氯酸鈉等，現(xiàn)在多采用2種或2種以上的組合滅菌劑來處理外植體，在使用滅菌劑消毒之前，用75%酒精做短暫滅菌，一般為10～30 s，再用滅菌劑做進一步處理。從表1可以看出，在相同的消毒時間下，氯化汞處理要比次氯酸鈉處理的污染率低，說明氯化汞的消毒效果好。雖然采用消毒方法4獲得的污染率最低，但是隨著消毒時間的增加死亡率會隨著上升，因此根據(jù)污染率和死亡率2個因素考慮，金娃娃萱草外植體采用組合滅菌劑（75%酒精30 s+0.1% HgCl2 10 min）滅菌效果最佳，污染率為10%。

2.2 植物生長調(diào)節(jié)劑對不定芽誘導(dǎo)的影響

金娃娃萱草外植體接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，不定芽5～7 d后開始萌發(fā)，出現(xiàn)綠色的突起并逐漸伸長長高（圖1）。植物生長調(diào)節(jié)劑不同組合對誘導(dǎo)分化的影響不同，誘導(dǎo)率的差異顯著。從表2可以看出，金娃娃萱草在處理3上，即：MS+6-BA1.0 mg/L+ NAA0.3 mg/L（MS為基本培養(yǎng)基），其誘導(dǎo)率可達到98.7%，與其他處理間差異極顯著（P<0.01）。因此MS附加植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的6-BA和質(zhì)量濃度為0.3 mg/L的NAA組合是外植體直接分化為不定芽的最佳植物生長調(diào)節(jié)劑組合。

2.3 植物生長調(diào)節(jié)劑對不定芽增殖培養(yǎng)的影響

將誘導(dǎo)出來的不定芽轉(zhuǎn)入不定芽增殖培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng)，10 d左右產(chǎn)生新的腋芽，增殖系數(shù)可達1.8～9.0。從表3可以看出，植物生長調(diào)節(jié)劑不同組合對不定芽增殖系數(shù)的影響有較大差異，2種植物生長調(diào)節(jié)劑的交互作用對金娃娃萱草繼代增殖培養(yǎng)的影響達到了極顯著水平（P<0.01），

3個6-BA水平間差異極顯著（P<0.01），3個NAA水平間差異極顯著（P<0.01）。因此得出繼代增殖的最佳培養(yǎng)基為：MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.5 mg/L，即試驗的L6處理，不定芽增殖系數(shù)最大，增殖系數(shù)可達到9.0。

2.4 繼代培養(yǎng)周期對繼代增殖的影響

隨著繼代培養(yǎng)天數(shù)的增加，增殖系數(shù)也隨之增長，繼代周期為20、25 d時，組培苗生長健壯，長勢最好，增殖系數(shù)分別為7.8和9.0（圖2），25 d時為最大增殖系數(shù)，苗高達到最高值（表4），培養(yǎng)周期到30 d時，由于培養(yǎng)基中的養(yǎng)分消耗殆盡，植株生長緩慢，基本停止生長，葉片逐漸變黃，繼代后增殖能力降低。因此，金娃娃萱草組培苗繼代25 d是最佳的生長、增殖時期，苗高平均可達5 cm，增殖系數(shù)達到最大，因此25 d繼代一次較為適宜。

3 討論與結(jié)論

在植物組織培養(yǎng)中，為了有效地促進不定芽的誘導(dǎo)和增殖，采用植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和質(zhì)量濃度往往不同，常以生長素和細胞分裂素按照一定比例混合使用。誘導(dǎo)率和增殖率的差異，關(guān)鍵在于植物生長調(diào)節(jié)劑種類和質(zhì)量濃度的篩選。在本研究中，選用了6-BA和NAA 2種植物生長調(diào)節(jié)劑，在初代培養(yǎng)階段，低質(zhì)量濃度的生長素和細胞分裂素組合更有利于不定芽的誘導(dǎo)、形成，在繼代培養(yǎng)階段，高濃度的生長素和細胞分裂素組合更有利于不定芽的增殖。

本研究以金娃娃萱草幼芽作為外植體，研究外植體直接誘導(dǎo)不定芽的植物生長調(diào)節(jié)劑種類和質(zhì)量濃度組合。通過試驗發(fā)現(xiàn)，最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.3 mg/L，誘導(dǎo)率最高可達98.7%，最佳不定芽增殖培養(yǎng)基為：MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.5 mg/L，增殖系數(shù)最高可達9.0，25 d繼代一次較為適宜。在植物組織培養(yǎng)中根據(jù)培養(yǎng)物以及培養(yǎng)要求的不同，適時、適量使用適宜的植物生長調(diào)節(jié)劑可以有效地促進組培苗的生長、發(fā)育，有利于形成優(yōu)質(zhì)的組培苗，提高組培苗的誘導(dǎo)率和分化率。

【參 考 文 獻】

[1]孫波，黃毅恒.金娃娃萱草的繁殖栽培及園林應(yīng)用[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2016，50（16）：161.

SUN B， HUANG Y H. Propagation， cultivation and landscape application of Hemerocallis fulva[J]. Modern Agricultural Science and Technology， 2016， 50（16）：161.

[2]胡金萍，趙震虎，金鵬.大花萱草-金娃娃在黑龍江省的栽培及繁育技術(shù)的研究[J].黑龍江科技信息，2011，25（15）：204.

HU J P， ZHAO Z H， JIN P. Study on cultivation and breeding techniques of Hemerocallis fulva and Golden Doll in Heilongjiang province[J]. Heilongjiang Science and Technology Information， 2011， 25（15）：204.

[3]李靜，陳豐鴿，楊國閣.“金娃娃”萱草的應(yīng)用及栽培技術(shù)[J].河南農(nóng)業(yè)，2008，32（19）：14.

LI J， CHEN F G， YANG G G. Application and cultivation techniques of Hemerocallis fulva[J]. Agriculture of Henan， 2008， 32（19）：14.

[4]孫徐骉，武榮花.萱草屬植物研究進展[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，45（4），45：7-11.

SUN X B， WU R H. Recent advances in Hemerocallis[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences， 2016， 45（4）： 7-11.

[5]中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].北京：科學(xué)出版社，1979.

Editorial Board of Flora of China， Chinese Academy of Sciences. Flora of China[M]. Beijing： Science Press， 1979.

[6]張世杰，張志國.萱草屬植物的起源、分布、分類及應(yīng)用[J].園林，2018，38（5）：5-9.

ZHANG S J， ZHANG Z G. Origin， distribution， classification and application of Hemerocallis[J]. Landscape Architecture， 2018， 38（5）： 5-9.

[7]褚煥寧.萱草屬植物快繁體系構(gòu)建及雜種胚拯救研究[D].太谷：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

CHU H N. Construction of rapid propagation system and rescue of hybrid embryo on Hemerocallis spp.[D]. Taigu： Shanxi Agricultural University， 2017.

[8]王榮梅.萱草屬植物組培快繁體系優(yōu)化及單倍體培養(yǎng)研究[D].太谷：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019.

WANG R M. Optimization of tissue culture and rapid propagation system of Hemerocallis spp. and haploid culture study[D]. Taigu： Shanxi Agricultural University， 2019.

[9]宋雪蓮.5個新品種多倍體萱草離體快繁技術(shù)的研究[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

SONG X L. Research on rapid propagation technique of Hemerocallis hybrida polyploid of 5 new species[D]. Changchun： Jilin Agricultural University， 2011.

[10]李雯，王秀華.幾種榆屬植物組織培養(yǎng)研究進展[J].森林工程，2013，29（2），29：41-43.

LI W， WANG X H. The research progress of tissue culture of some genus Ulmus species[J]. Forest Engineering， 2013， 29（2）： 41-43.

[11]張琳， 程亞男， 張欣， 等. 兩種植物生長調(diào)節(jié)劑對木槿插穗生根的影響[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2021， 45（3）： 123-129.

ZHANG L， CHENG Y N， ZHANG X， et al. Effects of two plant growth regulators on rooting of Hibiscus syriacus cuttings[J]. Journal of Nanjing Forestry University （Natural Science Edition）， 2021， 45（3）： 123-129.

[12]楊麗莉，王德平，張曉，等.以子房為外植體的‘金娃娃萱草組織培養(yǎng)技術(shù)的研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2012，28（25）：184-190.

YANG L L， WANG D P， ZHANG X， et al. Study on tissue culture technique in Hemerocallis hybridus Stella Doro Using ovary as explants[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2012， 28（25）： 184-190.

[13]姜鳳英，欒紹武，吳志剛，等.多倍體萱草“金娃娃”的離體培養(yǎng)研究[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，62（1）：51-52.

JIANG F Y， LUAN S W， WU Z G， et al. In vitro culture of polyploid Hemerocallis fulva[J]. Liaoning Agricultural Sciences， 2007， 62（1）： 51-52.

[14]解有利，陳蘭芬，石進朝.大花萱草組織培養(yǎng)研究[J].北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院學(xué)報，2007，21（5）：25-27.

XIE Y L， CHEN L F， SHI J C. Study on tissue culture of Hemerocallis fulva[J]. Journal of Beijing Agricultural Vocation College， 2007， 21（5）： 25-27.

[15]李秀華，杜貞，武銀玉，等.大花萱草組培快繁體系的研究[J].植物研究，2009，29（6）：757-762.

LI X H， DU Z， WU Y Y， et al. Research on tissue culture regeneration of Hemerocallis middendorfii[J]. Bulletin of Botanical Research， 2009， 29（6）： 757-762.

[16]王榮梅，褚煥寧，王金耀，等.萱草屬植物短縮莖組織培養(yǎng)及植株再生[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2019，39（3）：23-28.

WANG R M， CHU H N， WANG J Y， et al. Tissue culture and plant regeneration with dwarf stem of Hemerocallis plants[J]. Journal of Shanxi Agricultural University （Natural Science Edition）， 2019， 39（3）： 23-28.

[17]陳曦，劉志洋.6種多倍體大花萱草組織培養(yǎng)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（1）：106-110.

CHEN X， LIU Z Y. Study on tissue cultivation in six polyploid Hemerocallis hybrida[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences， 2020， 48（1）： 106-110.

[18]羅倩，董運常，嚴過房，等.植物生長調(diào)節(jié)劑在園林植物生產(chǎn)及抗逆性上的應(yīng)用研究[J].安徽農(nóng)學(xué)通報，2017，23（16）：122-124.

LUO Q， DONG Y C， YAN G F， et al. Research and application of plant growth regulators on the production techniques and resistance of garden plants[J]. Anhui Agricultural Science Bulletin， 2017， 23（16）：122-124.

[19]周宜君，周生闖，劉玉，等.植物生長調(diào)節(jié)劑對植物愈傷組織的誘導(dǎo)與分化的影響[J].中央民族大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2007，30（1）：23-28.

ZHOU Y J， ZHOU S C， LIU Y， et al. Influences of plant growth regulations on induction and differentiation of plant callus[J]. Journal of the Central University for Nationalities （Natural Sciences Edition）， 2007， 30（1）：23-28.

[20]馬秋月， 李倩中， 李淑順， 等. 元寶楓組織培養(yǎng)及快速繁殖技術(shù)研究[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2021， 45（2）： 220-224.

MA Q Y， LI Q Z， LI S S，et al. Study on tissue culture and rapid propagation of Acer truncatum Bunge[J]. Journal of Nanjing Forestry University （Natural Science Edition）， 2021， 45（2）： 220-224.

[21]李艷霞，劉忠玲，劉建明，等.樹莓品種“波拉納”組培繁殖體系建立[J].森林工程，2018，34（2）：26-29.

LI Y X， LIU Z L， LIU J M， et al. Establishment of tissue culture and propagation system for Raspberry （Rubusdaeus） Cultivar ‘Polana[J]. Forest Engineering， 2018， 34（2）：26-29.

[22]任雪羽，王曉紅，肖芬，等.木槿種子的多倍體誘導(dǎo)及鑒定研究[J].西部林業(yè)科學(xué)，2019，48（4）：119-125.

REN X Y， WANG X H， XIAO F， et al. Polyploidy Induction and Identification of Hibiscus syriacus[J]. Journal of West China Forestry Science， 2019， 48（4）：119-125.

[23]蔣華.巴西人參組培快繁體系的建立[J].西部林業(yè)科學(xué)，2021，50（1）：138-144.

JIANG H. Rapid propagation system of Pfaffia paniculate tissue culture[J]. Journal of West China Forestry Science， 2021， 50（1）：138-144.

[24]肖杰，薛歡，苑景淇，等.3個紫薇品種實生苗和扦插苗光合特性比較及光合效率評價[J].西部林業(yè)科學(xué)，2020，49（6）：85-93.

XIAO J， XUE H， YUAN J Q， et al. Comparison of photosynthetic characteristics and evaluation of photosynthetic efficiency of seedlings and cuttings of three Lagerstroemia indica cultivars[J]. Journal of West China Forestry Science， 2020， 49（6）：85-93.

[25]姚穎，劉忠玲，呂躍東.植物生長調(diào)節(jié)劑和扦插基質(zhì)對紫椴嫩枝扦插生根的影響[J].森林工程，2017，33（1）：12-15.

YAO Y， LIU Z L， LV Y D. Effect of plant growth regulators and cutting medium on rooting of the Tilia Amurensis by softwood cutting[J]. Forest Engineering， 2017， 33（1）：12-15.