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    中國漢族ADRP一家系RHO基因變異基因型及臨床表型分析

    2021-08-23 03:11:30張玉薇婁桂予楊科陽琳朱青雷博
    中華實驗眼科雜志 2021年8期
    關(guān)鍵詞:錯義證者家系

    張玉薇 婁桂予 楊科 陽琳 朱青 雷博

    1河南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳研究所 河南省遺傳性疾病功能基因重點實驗室,鄭州450003;2河南省人民醫(yī)院 河南省眼科研究所 河南省立眼科醫(yī)院,鄭州 450003

    視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa,RP)是一類常見的遺傳性眼病,全球患病率為1/7 000~1/3 000,其在中國的患病率約為1/4 000[1-2]。RP患者多在兒童和青少年時期發(fā)病,主要表現(xiàn)為夜盲、進行性視野缺損、視力下降和視網(wǎng)膜骨細胞樣色素沉著,其病理過程為視桿細胞首先出現(xiàn)進行性變性,進而視錐細胞受累,最終導(dǎo)致視桿和視錐細胞及色素上皮功能喪失[3]。RP的診斷主要依據(jù)眼底、視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram,ERG)和視野檢查,特殊情況可考慮光相干斷層掃描檢查。臨床上尚無控制RP進展及治療RP的有效方法,明確病因、植入前進行分子診斷、降低攜帶致病突變患兒的出生率是降低RP患病率的有效方法。RP具有高度遺傳異質(zhì)性,目前已鑒定的致病基因約有96個(https://sph.uth.edu/retnet/)。RP的遺傳方式有常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳和X染色體連鎖遺傳,少數(shù)患者可表現(xiàn)為雙基因遺傳及線粒體遺傳[4]。由于RP表現(xiàn)出高度的遺傳異質(zhì)性和臨床表型多樣性,鑒定RP患者的致病基因?qū)τ谡_的分類和診斷至關(guān)重要[5-6]。本研究擬對常染色體顯性遺傳視網(wǎng)膜色素變性(autosomal dominant retinitis pigmentosa,ADRP)一家系的致病基因和臨床表型進行分析。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    采用家系調(diào)查研究,收集2019年11月于河南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳研究所進行遺傳咨詢的來自河南省東部地區(qū)的漢族RP一家系,納入該家系4代20名成員,包括9例患者和11名表型正常者。本研究遵循《赫爾辛基宣言》,經(jīng)河南省人民醫(yī)院倫理委員會審核批準[批文號:HNEECKY-2019(15號)],所有受檢者均簽署知情同意書。

    1.2 方法

    1.2.1臨床檢查 采用標準對數(shù)視力表(i.Polatest,德國Carl Zeiss AG公司)測定視力,免擴瞳眼底照相機(VISUCAM-200,德國Carl Zeiss AG公司)檢查眼底,眼電生理診斷系統(tǒng)(RET1-Port 21 compact,德國羅蘭公司)檢查視網(wǎng)膜功能,視野分析儀(840,德國Carl Zeiss AG公司)檢查視野。

    1.2.2基因檢測 采集先證者及家系成員外周靜脈血各2 ml,置于EDTA抗凝管,混勻后按照DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)步驟提取DNA,Qubit?2.0(美國Life Technologies公司)對DNA定量。采用高通量測序儀(Ion Torrent PGM,美國ABI公司)進行基因檢測。

    1.2.2.1Ion AmpliSeq引物包建庫及靶向測序 采用Ion AmpliSeq Designer(https://www.ampliseq.com)設(shè)計覆蓋43個RP基因外顯子區(qū)域,包含1 187個擴增子的AmpliSeq引物包,并由美國Life Technologies公司合成。按照Ion AmpliSeq Library Kit 2.0建庫試劑盒(美國Life Technologies公司)流程對先證者進行靶向外顯子建庫,Qubit-dsDNA-HS試劑盒(美國Life Technologies公司)對制備的文庫進行定量檢測,高通量測序儀測序。采用Ion Torrent Suite v5.6系統(tǒng)進行Ion Torrent數(shù)據(jù)質(zhì)控、序列比對及單核苷酸變異(single nucleotide variations,SNVs)和插入缺失(inserts and deletions,indels)變異檢測。質(zhì)控數(shù)據(jù)顯示,靶向外顯子平均覆蓋度為99.94%,平均測序深度為300×。得到的SNVs和indels經(jīng)dbSNP 138數(shù)據(jù)庫過濾后,檢索HGMD、NCBI等數(shù)據(jù)庫匹配已報道的致病位點。對發(fā)現(xiàn)的可疑致病突變采用Sanger測序進行驗證。

    1.2.2.2PCR反應(yīng)及Sanger法測序 根據(jù)變異序列采用primer blast在線(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計引物,由上海生工生物有限公司合成。擴增含有變異的外顯子,對PCR片段進行純化和測序。序列數(shù)據(jù)文件采用SeqMan Pro軟件8.1.4版(DNASTAR)分析。

    1.2.3數(shù)據(jù)分析 采用在線軟件(http://www.mutationtaster.org/、http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/和https://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測變異位點蛋白功能及空間結(jié)構(gòu)。采用ClustalW2多重比對程序?qū)θ?Genbank:NP_000530.1)、牛(Genbank:NP_001014890.1)、家犬(Genbank:NP_001008277.1)、黑猩猩(Genbank:XP_516740.2)、貓(Genbank:NP_001009242.1)及小鼠(Genbank:NP_663358.1)視紫紅質(zhì)(rhodopsin,RHO)蛋白的氨基酸序列進行比較(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)。根據(jù)ACMG遺傳變異分類標準與指南判斷變異位點致病性[7]。

    2 結(jié)果

    2.1 家系患者臨床特點

    該家系4代共有9例RP患者,符合常染色體顯性遺傳方式(圖1)。先證者,男,26歲,自幼雙眼夜盲,視力右眼0.25,左眼0.5。雙眼視網(wǎng)膜有骨細胞樣色素沉著,視網(wǎng)膜血管變細,視盤顏色變淡(圖2);全視野ERG檢查結(jié)果顯示,暗適應(yīng)a波和b波峰值降低;明適應(yīng)a波和b波峰值重度降低;暗適應(yīng)震蕩電位重度下降;明適應(yīng)3 ERG a、b波均重度下降;明適應(yīng)30 Hz閃爍ERG右眼振幅中度下降,左眼振幅輕度下降(圖3)。家系成員患者的共同表現(xiàn)為7~10歲開始出現(xiàn)夜盲,約50歲時周邊視力完全喪失。

    2.2 靶向基因高通量測序

    該家系檢測到RHO基因(NM_000539.3)5號外顯子中的1個雜合錯義變異c.982delC(p.L328fs)。經(jīng)Mutation taster軟件預(yù)測,該變異導(dǎo)致編碼序列第328位氨基酸處的亮氨酸缺失并發(fā)生移碼,改變了包括第328位氨基酸以后的21個氨基酸,造成終止密碼子改變,使編碼區(qū)由348個氨基酸增加到358個氨基酸,預(yù)測變異可導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變(圖4)。

    2.3 RHO基因c.982delC變異Sanger測序驗證及致病性分析

    臨床診斷為RP的患者(Ⅱ1、Ⅲ1、Ⅲ3、Ⅲ5、Ⅲ8、Ⅳ1、Ⅳ2和Ⅳ5)均檢測到了c.982delC變異,無癥狀成員未檢測到該位點變異。RHO基因編碼RHO蛋白的多個同源序列比對分析表明,6個不同物種之間第328位亮氨酸殘基(p.L328)均保守(圖5)。根據(jù)ACMG遺傳變異分類標準與指南判斷:(1)缺失移碼變異屬于非常強的致病性證據(jù)(PVS1);(2)該變異在ExAC和千人基因組數(shù)據(jù)庫中均未被收錄,屬于中等致病性證據(jù)(PM2);(3)HGMD(CM973326)和Retina International數(shù)據(jù)庫(http://www.retina-international.org)曾報告RHO基因編碼第328氨基酸的堿基錯義致病變異,其中Leu(密碼子:GAG)被Pro取代,屬于中等致病性證據(jù)(PM5);(4)家系多個患者中檢測到此變異,變異與疾病在家系中共分離,屬于支持致病性證據(jù)(PP1);(5)Mutation taster軟件預(yù)測該缺失移碼變異偏向致病性,屬于支持致病性證據(jù)(PP3);(6)家系患病成員臨床表型符合RP,屬于支持致病性證據(jù)(PP4)。綜上,該變異具有1個非常強的致病性證據(jù)PVS1,2個中等致病證據(jù)PM2,3個支持致病證據(jù)PP1、PP3、PP4,屬于致病性變異。

    3 討論

    RP是常見的眼科遺傳病,在已發(fā)現(xiàn)的96個致病基因中,有30個基因表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳,基因檢測是對ADRP進行分子診斷的重要依據(jù)。二代測序技術(shù)是目前臨床上用于檢測基因變異的一種可行、省時的方法[8]。本研究采用引物包靶向擴增高通量測序的方法,與全外顯子測序相比,本方法適用于單種疾病,有較高的性價比,分析有針對性,且操作快捷、簡單。對于涉及幾十種基因的RP,靶向包測序的方法更加適用。

    本研究在該家系中檢測到了RHO基因c.982delC雜合變異。RHO基因編碼含有348個氨基酸的RHO蛋白,RHO是G蛋白偶聯(lián)受體超家族的成員之一,RHO蛋白C端第310~349位氨基酸可與11-順-視黃醛形成功能性發(fā)色。當(dāng)光子照射到RHO時,11-順-視黃醛異構(gòu)化,在視桿細胞中啟動光轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)[9],在將光能轉(zhuǎn)換為電能的光轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著關(guān)鍵作用。C端變異影響RHO在高爾基體的轉(zhuǎn)運,并損害光感受器外段的正常功能[10]。RHO蛋白C端的重要靶向序列VXPX-COOH也控制著視桿細胞外段的感光功能,其基序VXPX的缺失會導(dǎo)致RP[11-12]。該家系中RHO基因的c.982delC移碼變異改變了高度保守的氨基酸殘基328~349區(qū)域,其中包括VXPX基序,該變異很可能通過破壞RHO蛋白的正常光轉(zhuǎn)導(dǎo)功能而致病。

    RHO錯義變異是RP中較常見的變異類型,在中國人群中RHO變異占所有RP病例的1.30%~5.65%,占ADRP的8.11%~15.00%[13],而在高加索人群中,RHO變異占ADRP的16%~26%。在一項對200名西班牙RP先證者的研究中發(fā)現(xiàn),27個RHO變異中有25個是錯義變異[14]。在另外一項涉及中國248名RP先證者的研究中,檢出的錯義變異占RHO變異的87.5%(7/8)[15]。HGMD和Retina International數(shù)據(jù)庫曾收錄RHO基因編碼第328位氨基酸的堿基錯義變異,其中Leu(密碼子:GAG)被Pro取代。截至目前,RHO基因的c.982delC(p.L328fs)移碼變異未在大的家系中被報道。Sullivan等[16]在散發(fā)病例中檢測到該變異,但未對該變異的致病性進行詳細說明。另一項研究試圖用高通量細胞學(xué)方法來篩選RHO在細胞中的表達以分析該變異的致病性,但并未得到確切的結(jié)果[17]。本研究為首次在中國漢族RP家系中對該變異進行驗證。

    RHO變異導(dǎo)致的RP有一定的基因型和表型的相關(guān)性。RHO中的錯義變異與象限型RP相關(guān)[18]。RHO蛋白COOH末端序列的變異與早發(fā)性侵襲性RP相關(guān)[19]。本研究中RP家系的臨床表現(xiàn)與之前報道的相似,即患者青少年時期即出現(xiàn)夜盲,在50多歲時出現(xiàn)嚴重視力損害,包括中心視力喪失。本家系患病成員雖然攜帶有相同的致病突變位點,但由于個體差異,臨床表現(xiàn)也不盡相同,如視力、視野等。先證者的主要目的是進行遺傳咨詢,我們?yōu)樵撓茸C者找到了高度可疑的致病突變。以此為基礎(chǔ),本課題組正在構(gòu)建小鼠動物模型,以進一步探索該突變的致病機制。

    綜上所述,本研究通過對中國漢族ADRP一家系的研究證實了RHO基因c.982delC雜合變異的致病性,該突變在中國漢族家系中首次報道。本研究為指導(dǎo)該家系成員的優(yōu)生優(yōu)育提供了分子診斷依據(jù),并且該發(fā)現(xiàn)豐富了RP致病突變數(shù)據(jù)庫信息,為深入研究RP的致病機制提供了新的線索。

    利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

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