BAP1、FOXO3和ITPR2基因表達(dá)變化與葡萄膜黑色素瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后關(guān)聯(lián)分析

李洋 馮宇 劉月明 魏文斌

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院 北京同仁眼科中心 眼內(nèi)腫瘤診治研究北京市重點實驗室 北京市眼科學(xué)與視覺科學(xué)重點實驗室 100730

葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma，UM)是成年人眼內(nèi)常見的原發(fā)性惡性腫瘤，其起源于葡萄膜中的黑色素細(xì)胞，約占全身黑色素瘤的5%[1-2]。UM多發(fā)于淺膚色白人，除種族因素外，UM的危險因素還包括脈絡(luò)膜痣、眼(皮膚)黑色素細(xì)胞增多癥[3-6]。盡管紫外線輻射是皮膚黑色素瘤的重要危險因素，但其是否促使UM的發(fā)生仍存在爭議[7]。UM的常見遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位為肝臟，近一半的UM患者最終發(fā)展為肝轉(zhuǎn)移[8-9]。當(dāng)前，對于轉(zhuǎn)移性UM尚缺少明確有效的治療策略，發(fā)生轉(zhuǎn)移后患者中位生存時間不足1年[10]。既往研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤大小、睫狀體侵犯、眼外擴散等影像學(xué)表現(xiàn)和組織學(xué)上皮細(xì)胞型、有絲分裂核像、血管袢為預(yù)后不良的標(biāo)志[11-12]；染色體拷貝數(shù)變異水平上3號染色體短臂丟失以及8號染色體長臂擴增者的預(yù)后較差[13]。近年來，分子遺傳學(xué)研究表明GNAQ和GNA11基因突變是促進(jìn)細(xì)胞增生的早期事件[10]；SF3B1基因突變具有中等轉(zhuǎn)移風(fēng)險，與晚期轉(zhuǎn)移有關(guān)[14]；EIF1AX基因突變患者預(yù)后較好，具有較長的無轉(zhuǎn)移生存期[10]。此外，Onken等[13]通過對轉(zhuǎn)移/非轉(zhuǎn)移UM基因表達(dá)譜的差異分析篩選出12個差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)，并根據(jù)上述基因表達(dá)譜將腫瘤分為惡性程度低、不易轉(zhuǎn)移的1型和惡性程度高、易轉(zhuǎn)移的2型，相較基于腫瘤臨床特征的預(yù)后評估更加準(zhǔn)確、可靠。UM的發(fā)生和發(fā)展與基因突變和基因表達(dá)異常密切相關(guān)，而目前UM的臨床分期仍以腫瘤大小和腫瘤所在區(qū)域為主要依據(jù)，且UM轉(zhuǎn)移的診斷也主要依靠肝功能和影像學(xué)檢測結(jié)果。因此，亟需鑒定出UM轉(zhuǎn)移性相關(guān)的分子標(biāo)志物，在UM微轉(zhuǎn)移灶的潛伏期進(jìn)行有效干預(yù)。此外，盡管既往研究已鑒定出UM影像學(xué)、組織學(xué)、染色體拷貝數(shù)變異水平上的預(yù)后指標(biāo)，但目前仍缺乏分子遺傳學(xué)水平的深入研究。本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫對80個轉(zhuǎn)移/非轉(zhuǎn)移UM樣本的基因突變、DEGs進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選并尋找新的UM預(yù)后指標(biāo)，以期為探討其發(fā)生和轉(zhuǎn)移機制、提高患者遠(yuǎn)期預(yù)后提供參考。

1 材料與方法

1.1 UM樣本基因突變數(shù)據(jù)來源

本研究基于美國國家癌癥研究所(NCI)和國家人類基因組研究所(NHGRI)共同建立的腫瘤基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA，https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)，對該共享基因組圖譜中2007—2019年全部80例UM樣本的基因突變信息Maf文件和基因表達(dá)矩陣數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析?；颊咧心?5例，占56.2%，女35例，占43.8%；年齡的中位數(shù)為60歲；白人55例，占68.8%，未知人種者25例，占31.2%；轉(zhuǎn)移患者18例，非轉(zhuǎn)移患者62例；病理分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期及未知分期者分別有0、39、36、4、1例，分別占0.0%、48.8%、45.0%、5.0%和1.2%；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者26例，占32.5%，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者54例，占67.5%；進(jìn)行、未進(jìn)行、未知是否進(jìn)行放射治療者分別有3、76和1例，分別占3.8%、95.0%和1.2%；進(jìn)行化學(xué)治療者4例，占5.0%，未進(jìn)行化學(xué)治療者76例，占95.0%；死亡病例23例，占28.8%，存活病例57例，占71.2%。

1.2 方法

1.2.1UM樣本基因突變分析 采用R軟件中的maftools函數(shù)包分析UM樣本中的基因突變種類、變異類型、單核苷酸變異(single nucleotide variants，SNV)類型和基因突變比例并作圖。每兆堿基的平均突變數(shù)，即樣本總突變位點個數(shù)/外顯子區(qū)域長度(40 Mb)，定義為每個患者的腫瘤突變負(fù)荷(tumor mutation burden，TMB)數(shù)值。

1.2.2轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性UM間DEGs分析 采用R軟件中的edgeR軟件包分析源自轉(zhuǎn)錄組的DEGs。首先去除表達(dá)矩陣平均測序個數(shù)小于10的基因(測序個數(shù)小于10，其峰度較低，研究價值較低)。以腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移的臨床信息為依據(jù)，將樣本分為轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組，并以錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)<0.05和|log2FC|>1作為閾值篩選DEGs。

1.2.3DEG功能富集分析 采用在線數(shù)據(jù)庫KOBAS工具對篩選出的DEGs進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析。以經(jīng)過“BH”法校正過的P值<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選顯著富集的KEGG通路。

1.2.4UM預(yù)后與相關(guān)因素分析 采用R軟件中的survival包及survminer包進(jìn)行生存分析。采用survival包進(jìn)行Cox回歸模型的建立，探討性別、TMB、GNAQ、GNA11、BAP1、SF3B1、EIF1AX基因突變及FOXO3、ITPR2和BAP1的差異表達(dá)量對生存時間的影響，并繪制森林圖。以P<0.10為閾值篩選預(yù)后相關(guān)因素，并采用survminer軟件包繪制生存曲線。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用R軟件(v3.6.3)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料數(shù)據(jù)經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗證實不符合正態(tài)分布，以M(Q1，Q3)表示。采用Kaplan-Meier方法估計2個組的整體生存率，采用Log-rank檢驗比較2個組間生存率差異的顯著性；采用Wilcoxon秩和檢驗比較2個組基因表達(dá)差異。P<0.10為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性UM樣本中基因突變率

轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組UM均以錯義突變?yōu)橹?，突變類型為SNV，基因突變形式以C>T居多(圖1)。UM基因突變負(fù)荷低，僅個別樣本中存在相對較高的基因突變負(fù)荷。進(jìn)一步對突變率前10位的基因分析發(fā)現(xiàn)，2個組樣本的突變基因不完全相同：在非轉(zhuǎn)移組UM樣本中，GNAQ、GNA11、BAP1、SF3B1和EIF1AX基因具有較高的突變率；在轉(zhuǎn)移組UM樣本中，GNA11、PLCB4、SF3B1、BAP1和ARHGDLA基因具有較高突變率，GNA11和PLCB4基因的突變率分別高達(dá)67%和33%。

2.2 轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性UM樣本間基因表達(dá)差異

在轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性UM樣本間進(jìn)行DEGs分析，以FDR<0.05和|log2FC|>1作為閾值篩選出562個DEGs。與非轉(zhuǎn)移性UM樣本相比，轉(zhuǎn)移性UM樣本中218個基因顯著下調(diào)，344個基因顯著上調(diào)(圖2)。

表1 閾值篩選后的功能富集分析以及對應(yīng)的基因Table 1 Screening of candidate genes related to cancer and eye disease by functional enrichment analysisKEGG通路數(shù)據(jù)庫編號基因名稱玻璃體視網(wǎng)膜變性KEGG DISEASEH00805ENSG00000139219(COL2A1)癌癥相關(guān)蛋白多糖KEGG PATHWAYhsa05205ENSG00000123104(ITPR2)PI3K-Akt信號通路KEGG PATHWAYhsa04151ENSG00000118689(FOXO3) 注:KEGG:京都基因與基因組百科全書 Note:KEGG:Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes

2.3 DEG功能通路富集分析

KEGG通路功能富集分析結(jié)果顯示，其中3條與眼部疾病和癌癥相關(guān)的通路顯著富集，分別為玻璃體視網(wǎng)膜變性、癌癥相關(guān)蛋白多糖和PI3K-Akt信號通路。進(jìn)一步篩選出此3條通路對應(yīng)的基因，分別為ENSG00000139219(COL2A1)、ENSG00000123104(ITPR2)和ENSG00000118689(FOXO3)(表1)。

2.4 轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性UM樣本中FOXO3、ITPR2和BAP1基因表達(dá)差異

2個組突變率較高的基因(GNAQ、GNA11、BAP1、SF3B1、EIF1AX)、與癌癥和眼部疾病相關(guān)的基因(FOXO3、ITPR2、COL2A1)表達(dá)差異如圖3，4所示。2個組GNAQ、GNA11、SF3B1、EIF1AX和COL2A1基因表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-1.613、-0.092、-1.648、-1.636、-0.259，均P>0.10)；與非轉(zhuǎn)移組比較，轉(zhuǎn)移組BAP1和FOXO3表達(dá)量顯著下調(diào)，ITPR2表達(dá)量顯著上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-1.786、-1.982、-3.065，均P<0.10)(表2)。

表2 2個組UM樣本中的基因表達(dá)量比較[M(Q1,Q3)]Table 2 Comparison of gene expression levels between the two groups of UM samples[M(Q1,Q3)]組別樣本量BAP1基因SF3B1基因EIF1AX基因GNAQ基因轉(zhuǎn)移組182982.50(1251.50,5637.00)9587.00(5306.00,15143.75)2383.50(1361.00,3280.00)4332.50(2306.50,5313.75)非轉(zhuǎn)移組625225.00(2281.25,8784.00)6107.50(2820.25,13118.50)1400.50(589.00,3041.75)3275.50(1656.50,4766.75)Z值-1.786-1.648-1.636-1.613P值0.0740.0990.1020.107組別樣本量GNA11基因COL2A1基因FOXO3基因ITPR2基因轉(zhuǎn)移組184815.00(4014.75,6665.50)295.50(23.50,403.50)1223.00(914.75,2706.25)2201.50(570.75,4814.00)非轉(zhuǎn)移組625431.00(4049.50,6429.00)105.00(33.75,535.50)2293.50(1254.25,3693.75)474.00(153.00,1437.75)Z值-0.092-0.259-1.982-3.065P值0.9270.7950.0480.002 注:(Wilcoxon秩和檢驗) 數(shù)據(jù)來源于TCGA數(shù)據(jù)庫 UM:葡萄膜黑色素瘤 Note:(Wilcoxon rank sum test) The data came from TCGA database UM:uveal melanoma

2.5 BAP1、FOXO3和ITPR2基因與UM患者生存率的關(guān)聯(lián)分析

Cox模型單因素分析顯示，BAP1基因突變、FOXO3基因表達(dá)下調(diào)和ITPR2基因表達(dá)上調(diào)與不良預(yù)后顯著相關(guān)(均P<0.10)(表3)。此外，對BAP1基因是否突變、FOXO3、ITPR2基因不同表達(dá)水平和不同TMB的UM患者組分別進(jìn)行生存分析，得出BAP1基因未發(fā)生突變組和FOXO3基因高表達(dá)組的生存率較高(P=0.076、0.004)，ITPR2基因高表達(dá)組的生存率較低(P=0.006)(圖5)。

表3 UM患者性別、基因突變和表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系Table 3 Association between sex,gene mutations or gene expression levels and prognosis of UM patients影響因素回歸系數(shù)1回歸系數(shù)295%下限95%上限P值性別1.7430.5740.6434.7190.27GNAQ_var1.6660.6000.3597.7330.51GNA11_var1.1600.8620.2176.2100.86BAP1_var2.6450.3780.8807.9540.08SF3B1_var5.6500.1770.61651.8150.13EIF1AX_var2.5900.3860.24727.1360.43TMB2.9330.3410.9868.7210.05CO02A1_exp0.7851.2740.2772.2260.65FOXO3_exp0.1715.8440.0450.6440.01ITPR2_exp6.2070.1611.63323.5980.01 注:UM:葡萄膜黑色素瘤;_var:基因突變有/無;_exp:表達(dá)量高/低;TMB:腫瘤突變負(fù)荷 Note:UM:uveal melanoma;_var:with or without gene mutation;_exp:with high or low expression level;TMB:tumor mutation burden

3 討論

本研究對TCGA數(shù)據(jù)庫中80例UM患者的基因突變和基因表達(dá)情況進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示UM基因突變以錯義突變?yōu)橹?，主要變異類型為SNV，其中以C>T為主要形式。通過DEGs及KEGG通路富集分析，在轉(zhuǎn)移性UM樣本相對于非轉(zhuǎn)移性UM樣本的218個下調(diào)基因和344個上調(diào)基因中，鑒定出3個與眼部疾病和癌癥相關(guān)的基因，即BAP1、FOXO3和ITPR2基因。生存分析結(jié)果顯示，BAP1基因突變、FOXO3基因表達(dá)下調(diào)和ITPR2基因表達(dá)上調(diào)與較差預(yù)后相關(guān)，表明這3個基因能夠作為UM潛在的生物標(biāo)志物，對患者的預(yù)后情況預(yù)測具有臨床指導(dǎo)意義。

通過對基因突變信息的統(tǒng)計分析，本研究鑒定出突變頻率最高的基因中，GNAQ和GNA11基因均已被證明在人UM組織中存在突變[14]，符合先前的研究結(jié)果，二者的高突變率與UM的發(fā)生緊密相關(guān)。但在本研究中，GNAQ和GNA11基因在轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組之間的表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。除了GNAQ和GNA11外，BAP1基因也在UM樣本中顯示出較高的突變率。BAP1是位于3號染色體3p21的核去泛素化水解酶，通過從蛋白質(zhì)中去除泛素起到信號調(diào)節(jié)的作用，參與細(xì)胞增生、細(xì)胞發(fā)育和DNA損傷修復(fù)等生物過程[15-18]。BAP1基因突變首先在乳腺癌和肺癌細(xì)胞系中被發(fā)現(xiàn)[19]，并存在于其他幾種癌癥中，如腦膜瘤、間皮瘤和腎細(xì)胞癌等[20-22]。種系BAP1基因突變個體患UM和皮膚黑色素瘤的風(fēng)險顯著上升[23-24]，而體細(xì)胞BAP1基因突變未見于BAP1基因野生型UM進(jìn)展過程中，表明體細(xì)胞BAP1基因突變是UM發(fā)生的早期事件，而非在轉(zhuǎn)移過程中獲得[25-27]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BAP1基因在轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)量較非轉(zhuǎn)移組顯著下調(diào)，生存分析表明BAP1基因突變是影響UM預(yù)后不良的因素。亦有研究表明，敲除BAP1基因可使UM細(xì)胞系失去典型的黑色素細(xì)胞形態(tài)，且基因表達(dá)譜向預(yù)后不良的2型轉(zhuǎn)化[25,28]。盡管有很多研究探索BAP1蛋白的功能，但BAP1基因突變?nèi)绾未龠M(jìn)UM的轉(zhuǎn)移尚不清楚。有研究表明，BAP1的缺失抑制同源介導(dǎo)的DNA修復(fù)，迫使細(xì)胞依賴于更容易出錯的非同源末端連接[29]。此外，一些與BAP1相互作用的蛋白，如叉頭轉(zhuǎn)錄因子FOXK1、FOXK2和多梳家族蛋白ASXL1、ASXL2，已被證明參與到轉(zhuǎn)錄等相關(guān)過程的調(diào)控[30-31]，因此BAP1的缺失會影響下游的級聯(lián)過程。正是由于這些潛在的相關(guān)蛋白和復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，BAP1在UM轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用并未被闡明，因此對BAP1及其相互作用蛋白的進(jìn)一步研究有助于開發(fā)針對UM中BAP1缺失的治療方法。

本研究對轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組的DEGs進(jìn)行功能富集分析，篩選出了與眼部疾病和癌癥通路相關(guān)的基因FOXO3和ITPR2，其中FOXO3基因在轉(zhuǎn)移組的表達(dá)量明顯下調(diào)，ITPR2基因在轉(zhuǎn)移組的表達(dá)量明顯上調(diào)。FOXO3是FOXO家族轉(zhuǎn)錄因子的重要成員，是Akt激酶活性的主要下游靶點，通過激活或抑制多個靶基因的表達(dá)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增生、分化、DNA修復(fù)和凋亡等過程[32]。Akt磷酸化FOXO3使其在細(xì)胞質(zhì)中保留，防止其細(xì)胞核中的細(xì)胞調(diào)節(jié)作用，而Akt失活導(dǎo)致FOXO3a去磷酸化，并促使其從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移。已有研究表明，F(xiàn)OXO3受IGF-1R/PI3K/Akt通路調(diào)控，并與橫紋肌肉瘤、肝細(xì)胞癌、乳腺癌等腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[33-34]。此外，F(xiàn)OXO3還可以通過上調(diào)Bim和CDKN1B，抑制cyclin D1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，發(fā)揮抑制細(xì)胞增生的作用[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO3表達(dá)下調(diào)與UM遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，生存分析顯示FOXO3下調(diào)為UM預(yù)后不良的因素，可能的機制如下：IGF-1受體在UM中過度表達(dá)并持續(xù)激活，F(xiàn)OXO3受IGF-1R/PI3K/Akt通路激活后磷酸化，轉(zhuǎn)移出細(xì)胞核失去調(diào)節(jié)能力，從而使UM細(xì)胞的侵襲和遷移能力增強[36-37]；相反，抑制PI3K/Akt通路可增強FOXO3活性[9]。FOXO3參與了IGF-1誘導(dǎo)的UM細(xì)胞增生，因此該通路相關(guān)蛋白可能成為抑制UM遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的潛在治療靶點。

ITPR2蛋白是IP3受體的成員，是鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運活性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，在細(xì)胞周期和增生中起關(guān)鍵作用[38-39]。在肝癌干細(xì)胞中，ITPR2作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子通道蛋白，通過調(diào)控細(xì)胞鈣信號，增強肝癌干細(xì)胞的自我更新能力[40]。此外，有研究報道ITPR2可作為細(xì)胞遺傳學(xué)正常型急性髓細(xì)胞白血病不良預(yù)后的新型生物標(biāo)志物[39]。然而，尚未有研究探索ITPR2蛋白的表達(dá)與UM之間的聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn)ITPR2基因在轉(zhuǎn)移性UM中表達(dá)顯著上調(diào)，生存分析顯示ITPR2的表達(dá)增加與不良預(yù)后相關(guān)，這為未來探討鈣信號參與調(diào)控UM增生、轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制提供了新的思路。

本研究通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中UM樣本的基因突變信息的統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，BAP1基因在轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組突變率均較高，BAP1基因的突變是影響UM預(yù)后不良的因素，這與之前的研究結(jié)果相符合，但BAP1是如何影響UM的轉(zhuǎn)移性還需要進(jìn)一步研究。此外，本研究通過篩選轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組的DEGs，也闡釋了FOXO3基因表達(dá)下調(diào)和ITPR2基因表達(dá)上調(diào)與轉(zhuǎn)移性UM有很強的相關(guān)性，其中FOXO3與UM的關(guān)系報道較少，據(jù)目前報道僅有1篇研究顯示FOXO3a的過度表達(dá)減弱了UM的基底侵襲和遷移[9]，這與本研究中發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移性UM中FOXO3基因表達(dá)顯著下調(diào)這一結(jié)果可以相互驗證和補充。對于ITPR2，本研究表明了其與UM之間的關(guān)聯(lián)，在轉(zhuǎn)移性UM中ITPR2的表達(dá)顯著上調(diào)。本研究也統(tǒng)計了數(shù)據(jù)庫中這80例患者的預(yù)后信息，數(shù)據(jù)分析結(jié)果也能夠支持這3個基因?qū)D(zhuǎn)移性UM的影響。本研究從突變、表達(dá)和臨床等多個維度闡述了這3個基因?qū)D(zhuǎn)移性UM的重要影響。在后續(xù)研究上，會進(jìn)行相關(guān)的生物學(xué)驗證，建立UM關(guān)鍵基因突變或敲除動物模型，在體內(nèi)驗證這些基因?qū)M轉(zhuǎn)移的確切意義。

綜上所述，本研究通過對80例UM基因樣本的分析發(fā)現(xiàn)，BAP1基因突變、FOXO3基因表達(dá)下調(diào)和ITPR2基因表達(dá)上調(diào)與UM遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，可作為UM患者轉(zhuǎn)移預(yù)測和預(yù)后的潛在重要標(biāo)志，有助于UM轉(zhuǎn)移的早期監(jiān)測和治療，對提高患者的遠(yuǎn)期生存率具有重要意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突