極低頻電磁場(chǎng)輻射干擾后小鼠成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的生物信息學(xué)分析

朱茂林 朱煌

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院眼科 200092

極低頻電磁場(chǎng)(extremely low frequency electro-magnetic fields，ELF-EMFs)輻射是一種頻率低于300 Hz的非電離輻射，各類電力傳輸系統(tǒng)、日常使用的各種電子設(shè)備均釋放出不同能量的ELF-EMFs[1-3]。日常生活中人們使用電子產(chǎn)品的時(shí)間越長(zhǎng)，眼與ELF-EMFs接觸的時(shí)間和累積劑量也越大。在眼的生長(zhǎng)發(fā)育過程中，眼部的成纖維細(xì)胞起著重要作用，鞏膜重塑、眼眶構(gòu)建、脈絡(luò)膜的發(fā)育與成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為有關(guān)，電子產(chǎn)品的過度使用可能會(huì)對(duì)成纖維細(xì)胞造成影響，從而促進(jìn)眼部疾病的發(fā)生[4]。目前，ELF-EMFs對(duì)成纖維細(xì)胞行為的影響尚未明確。mRNA是一種重要的基因表達(dá)載體，承接著轉(zhuǎn)錄到翻譯的功能[5]。隨著技術(shù)的創(chuàng)新和發(fā)展以及高通量測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，可以使用生物信息學(xué)方法對(duì)不同樣本之間的生物學(xué)進(jìn)程、分子功能和細(xì)胞組分進(jìn)行分析[6]。本研究擬對(duì)成纖維細(xì)胞受ELF-EMFs干擾后基因的差異表達(dá)和一些關(guān)鍵信號(hào)通路及可能參與細(xì)胞輻射后應(yīng)激的差異基因mRNA表達(dá)量的變化進(jìn)行分析和總結(jié)，為相關(guān)眼病的發(fā)病機(jī)制研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞來源 NIH/3T3細(xì)胞系(FH0380)購于上海富衡生物科技有限公司。

1.1.2主要試劑及儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基(葡萄糖質(zhì)量濃度為4 500 mg/L)、澳洲胎牛血清、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetra acetic acid，EDTA)消化液、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、青鏈霉素溶液、Trizol試劑、TruSeq鏈?zhǔn)絤RNA文庫制備試劑盒(美國Thermo Fisher公司)；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(日本Takara公司)。Agilent2200生物分析儀(美國安捷倫公司)；倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)；低溫高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 NIH/3T3細(xì)胞接種培養(yǎng)在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，以DMEM高糖培養(yǎng)基為常規(guī)培養(yǎng)基，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中，隔天換液。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液在37 ℃培養(yǎng)箱中消化1 min，以1∶ 4比例傳代，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%，更換培養(yǎng)液，將細(xì)胞分為電磁輻射組和正常對(duì)照組，每組各3個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣本。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果[7]設(shè)置輻射劑量和時(shí)間，電磁輻射組細(xì)胞置于0.2 mT、50 Hz的電磁輻射系統(tǒng)中，正常對(duì)照組置于同等條件未通電的相同線圈系統(tǒng)中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，提取RNA。

1.2.2ELF-EMFs輻射系統(tǒng)的建立 使用本課題組前期自制的磁場(chǎng)輻照系統(tǒng)[7]，由周長(zhǎng)60 cm、高度8 cm、168匝的Helmholtz線圈和變壓器構(gòu)成，其中3個(gè)線圈相互串聯(lián)后疊放并與細(xì)胞培養(yǎng)箱外的變壓器相連。使線圈所在空間產(chǎn)生一個(gè)恒定、均勻的50 Hz正弦磁場(chǎng)輻照區(qū)，該輻射系統(tǒng)所產(chǎn)生的磁場(chǎng)用電磁輻射分析儀測(cè)定。在細(xì)胞受磁場(chǎng)輻照時(shí)，培養(yǎng)皿中心位于輻照系統(tǒng)的中心軸上。

1.2.3總RNA提取 細(xì)胞培養(yǎng)24 h，電磁輻射組和正常對(duì)照組分別清除培養(yǎng)基，加入適量PBS快速?zèng)_洗細(xì)胞，用Trizol試劑抽提細(xì)胞中的總RNA，采用Agilent 2200檢測(cè)RNA質(zhì)量，質(zhì)檢合格的樣品用于進(jìn)一步測(cè)序、生物學(xué)分析及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence引物名稱引物序列(5’-3’)片段長(zhǎng)度(bp)MAPK12正向:CGCCGTGTACCAAGACCTG19反向:GAGGCGCAACTCTCTGTAGG20NTRK3正向:TCTTTGCCCAGCCAAGTGTAG21反向:TCCTTGAGATGTCCGTAATGTTG23AGTR2正向:CGCAACTGGCACCAATGAG19反向:AGGGAGGGTAGCCAAAAGGAG21VEGF正向:AGGAGTACCCCGACGAGATAGA22反向:CACATCTGCTGTGCTGTAGGAA22β-actin正向:CGTTGACATCCGTAAAGACC20反向:TCAGTAACAGTCCGCCTAGAAG22 注:PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);MAPK:有絲分裂原激活的蛋白激酶;NTRK:神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性酪氨酸激酶受體;AGTR:血管緊張素Ⅱ受體;VEGF:血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子;β-actin:β-肌動(dòng)蛋白 Note:PCR:polymerase chain reaction;MAPK:mitogen activated protein kinase;NTRK:neurotrophic receptor tyrosine kinase;AGTR:angiotensin Ⅱ receptor;VEGF:vascular endothelial growth factor

1.2.4文庫構(gòu)建質(zhì)檢和測(cè)序 采用TruSeq鏈?zhǔn)絤RNA文庫制備試劑盒為每個(gè)RNA樣品構(gòu)建cDNA文庫。將RNA溶于無酶水中，用Oligo dT磁珠、RNA結(jié)合緩沖液、洗滌液及Tris進(jìn)行重懸和清洗，得到純化后的mRNA，并將其片段化為200～500 bp。以切割的RNA片段為模版，進(jìn)行第1鏈和第2鏈cDNA合成。dUTP混合物用于第2鏈cDNA合成，可去除第2鏈。將該cDNA片段末端修復(fù)，并加上polyA尾。純化連接的cDNA產(chǎn)物，并用尿嘧啶DNA糖基化酶處理以除去第2鏈cDNA。通過PCR富集純化的第1鏈cDNA以創(chuàng)建cDNA文庫。選出合格的片段后，擴(kuò)增15個(gè)循環(huán)，再次純化得到最終文庫。采用Agilent 2200對(duì)構(gòu)建的文庫進(jìn)行質(zhì)檢。本文庫中，300 bp≤庫主峰長(zhǎng)≤600 bp，質(zhì)量濃度≥2 ng/μl，峰型單一，沒有雜峰，符合后續(xù)上機(jī)要求。采用基于Illumina HiSeqXTen測(cè)序平臺(tái)的第2代高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)這些文庫進(jìn)行150 bp的配對(duì)末端測(cè)序。

1.2.5培養(yǎng)細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)量測(cè)定 將高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的基因組比對(duì)結(jié)果轉(zhuǎn)換為基因表達(dá)量，根據(jù)RNA Mapping結(jié)果和基因組注釋文件，將電磁輻射組和正常對(duì)照組的6個(gè)樣本采用HTSeq算法統(tǒng)計(jì)每個(gè)基因的表達(dá)情況。將測(cè)序序列(clean data)比對(duì)到測(cè)序物種(NCBI Taxonomy ID：10090)對(duì)應(yīng)的參考基因組(mm10)上，確定測(cè)序序列在基因組上的定位情況。采用RPKM(Reads Per Kilobase Million Reads)及FPKM(Fragments Per Kilobase Million Reads)對(duì)基因的表達(dá)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.6差異基因分析及篩選 采用EdgeR算法過濾差異表達(dá)的基因，經(jīng)過顯著分析和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)分析后，遵循以下標(biāo)準(zhǔn)對(duì)mRNA進(jìn)行篩選：表達(dá)差異倍數(shù)log2Fold Change>0.585或<-0.585，F(xiàn)DR<0.05。通過差異基因篩選結(jié)果中的差異倍數(shù)以及差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性結(jié)果，在火山圖中對(duì)基因表達(dá)的差異分布情況進(jìn)行展示，獲得顯著差異基因的數(shù)量、顯著上/下調(diào)基因的數(shù)量及差異程度信息。采用基因表達(dá)聚類圖直觀呈現(xiàn)多樣本多個(gè)基因的全局表達(dá)量變化，表達(dá)多樣本或多基因表達(dá)量的聚類關(guān)系。

1.2.7基因功能注釋和相關(guān)通路分析 基于數(shù)據(jù)庫，將分析得到的差異基因分別從生物學(xué)進(jìn)程、分子功能和細(xì)胞組分3個(gè)層面進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology，GO)注釋，得到基因參與的所有GO，采用Fisher檢驗(yàn)計(jì)算每個(gè)GO的顯著性水平(P值)，從而篩選出差異基因富集的顯著性GO。關(guān)注P值<0.05的相關(guān)基因。將篩選出的差異基因基于京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行通路注釋，得到差異基因參與的所有通路條目，采用Fisher檢驗(yàn)計(jì)算Pathway的顯著性水平(P值)，從而篩選出差異基因富集的顯著性通路條目。

1.2.8實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)差異基因的表達(dá) 按照RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將獲取的cDNA分別加入各引物的反應(yīng)體系中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，有絲分裂原激活的蛋白激酶12(mitogen activated protein kinase 12，MAPK12)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性酪氨酸激酶受體3型(neurotrophic tyrosine kinase receptor type 3，NTRK3)、2型血管緊張素Ⅱ受體(angiotensin Ⅱ receptor type 2，AGTR2)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)PCR引物序列見表1，反應(yīng)體系為20 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火及延伸34 s，循環(huán)40次。擴(kuò)增后進(jìn)行熔解曲線分析。以β-actin為內(nèi)參照，采用2-△△Ct法計(jì)算各目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)經(jīng)K-S檢驗(yàn)證實(shí)呈正態(tài)分布，以mean±SD表示。本次分析選用的差異篩選算法為EdgeR。EdgeR是基于負(fù)二項(xiàng)分布的統(tǒng)計(jì)方法，采用TMM算法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，采用多組實(shí)驗(yàn)的精確統(tǒng)計(jì)模型進(jìn)行基因差異表達(dá)鑒定的算法。以FDR<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。2個(gè)組各個(gè)樣本基因表達(dá)水平的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNA對(duì)比

比對(duì)到小鼠參考基因組的reads數(shù)占比(Mapped Rate)均高于90%，在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，未見存在顯著異常的染色體富集，未受到污染，結(jié)果可靠性良好。

2.2 轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量的分析

根據(jù)基因在樣本中FPKM密度分布圖和FPKM分布箱線圖可見測(cè)序樣本中以中等表達(dá)的基因?yàn)橹鳎捅磉_(dá)和高表達(dá)的基因占比很少，整體基因表達(dá)狀況良好。電磁輻射組和正常對(duì)照組各自3個(gè)樣本間的相關(guān)系數(shù)(r)在0.95～1.00(圖1)。

圖1 ELF-EMFs作用后2個(gè)組的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量 A：基因的FPKM密度分布圖 B：基因的FPKM分布箱線圖 C：樣本間基因表達(dá)水平相關(guān)性 顏色深淺代表Pearson相關(guān)性系數(shù)的高低，顏色越深，相關(guān)性越好Figure 1 Transcriptome expression levels of the two groups after exposure to ELF-EMFs A：FPKM density distribution map of genes B：Gene FPKM distribution boxplot C：Correlation matrix showing correlation coefficients between samples Deeper color represented higher correlation FPKM：Fragments Per Kilobase Million Reads

2.3 電磁輻射組與正常對(duì)照組中基因表達(dá)差異分析

在本次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中，共鑒定出17 980個(gè)基因，篩選出遵循表達(dá)差異倍數(shù)的共140個(gè)顯著差異基因，其中120個(gè)差異基因上調(diào)，差異較大的上調(diào)基因有Neat1、ND6、MAPK12、Tle2等，多與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)、NADH-泛醌氧化還原酶鏈、溶質(zhì)載體家族、細(xì)胞黏附分子等功能活動(dòng)相關(guān)；20個(gè)下調(diào)的基因多與泛素蛋白連接酶、選擇素、真核翻譯延伸因子等功能活動(dòng)相關(guān)(圖2)。樣本的雙向類聚分析結(jié)果可見電磁輻射組與正常對(duì)照組的相關(guān)性和均一性較好(圖3)。

圖2 ELF-EMFs作用后2個(gè)組差異基因火山圖 虛線是差異基因篩選采用的閾值，虛線之外為顯著差異基因；紅色代表顯著上調(diào)的差異基因，藍(lán)色代表顯著下調(diào)的差異基因，灰色代表非顯著差異的基因 FDR：錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率；FC：差異倍數(shù) 圖3 ELF-EMFs作用后2個(gè)組基因表達(dá)聚類圖 每個(gè)格子表示每個(gè)基因在不同樣本中的RPKM值。紅色代表該基因在中位數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化后，相對(duì)于中位數(shù)值的表達(dá)較高；綠色代表基因相對(duì)于中位數(shù)值的表達(dá)較低；顏色越深，越接近黑色代表越接近中位數(shù)值 圖4 ELF-EMFs作用后相關(guān)通路富集圖 VEGF：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；NOD：核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域；MAPK：絲裂原活化蛋白激酶Figure 2 Volcano plots displaying differentially expressed genes between the two groups after exposure to ELF-EMFs The dashed line was the threshold used for differentially expressed genes screening，and beyond the dashed line was the significantly differentially expressed genes;color red represented the significantly up-regulated genes，and color blue represented the significantly down-regulated genes，and color gray represented non-significantly differentially expressed genes FDR：false discovery rate;FC：fold change Figure 3 Gene expression cluster diagram of the two groups after exposure to ELF-EMFs Each grid represented the RPKM value of each gene in different samples.Color red meant that the gene expression was higher than that of median after median normalization，and color green meant that the expression of the gene was lower than that of median after median normalization.The darker the color，the closer it was to color black，and the closer it was to median Figure 4 Enrichment map of related pathways after exposure to ELF-EMFs VEGF：vascular endothelial growth factor;NOD：nucleotide-binding oligomerization domain;MAPK：mitogen-activated protein kinase

2.4 基因功能分析及與ELF-EMFs有關(guān)的通路篩選

通過GO分析，從生物學(xué)進(jìn)程來看，差異基因富集在翻譯的延長(zhǎng)、活性氧生物合成過程的調(diào)控、生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞發(fā)育、黑色素生物合成過程的調(diào)節(jié)、醛固酮分泌等方面；從分子功能來看，差異基因富集在三重密碼子-氨基酸銜接子活性、1，2-二羥基萘雙加氧酶活性等方面；從細(xì)胞組分來看，差異基因富集在陽離子通道配合物、線粒體丙酮酸脫氫酶復(fù)合物、血小板α顆粒膜、纖維狀膠原三聚體等方面。KEGG分析顯示差異基因主要涉及55條通路，其中富集顯著的10條通路集中于氨?；?tRNA的生物合成、血小板活化、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白信號(hào)通路、腎素-血管緊張素系統(tǒng)等，與細(xì)胞的生物合成密切相關(guān)(圖4)。在以上通路中，結(jié)合GO分析，Col27a1、MAPK12、NTRK3、B4galnt1、AGTR2等基因改變明顯，其中MAPK12和AGTR2在多條通路中均有涉及，這2個(gè)基因在ELF-EMFs作用后改變顯著。

2.5 2個(gè)組MAPK12、NTRK3、AGTR2和VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

電磁輻射組MAPK12、NTRK3、AGTR2和VEGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量均明顯高于正常對(duì)照組，2個(gè)組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.540、6.309、13.710、3.078，均P<0.05)(表2)。

表2 2個(gè)組MAPK12、NTRK3、AGTR2和VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(mean±SD)Table 2 Comparison of the relative expression levels of MAPK12,NTRK3,AGTR2 and VEGF mRNA between the two groups(mean±SD)組別樣本量不同基因mRNA相對(duì)表達(dá)量MAPK12NTRK3AGTR2VEGF正常對(duì)照組31.011±0.1901.011±0.1801.007±0.1501.008±0.153電磁輻射組32.389±0.0032.481±0.3502.354±0.0811.559±0.110t值12.5406.30913.7103.078P值<0.05<0.05<0.05<0.05 注:(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)) MAPK:有絲分裂原激活的蛋白激酶;NTRK:神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性酪氨酸激酶受體;AGTR:血管緊張素Ⅱ受體;VEGF:血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 Note:(Independent-samples t test) MAPK:mitogen activated protein kinase;NTRK:neurotrophic tyrosine kinase receptor;AGTR:angiotensin Ⅱ receptor;VEGF:vascular endothelial growth factor

3 討論

基因調(diào)控貫穿整個(gè)眼部的生長(zhǎng)發(fā)育過程，能夠精確調(diào)控細(xì)胞功能的變化。日常生活中，我們接觸電磁輻射的頻率變高，累積劑量增大。電子產(chǎn)品使用時(shí)間變長(zhǎng)，會(huì)使眼長(zhǎng)期暴露在這些設(shè)備所發(fā)出的ELF-EMFs中[8]，關(guān)于ELF-EMFs的安全更加受到關(guān)注。近年來，國際上從多個(gè)角度進(jìn)行了大量關(guān)于人體和動(dòng)物的調(diào)查及試驗(yàn)，研究ELF-EMFs對(duì)神經(jīng)、免疫、生殖等系統(tǒng)功能的影響[9-11]。也有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)ELF-EMFs對(duì)眼部健康有著不可忽略的影響[12-13]。

近年來，美國模式培養(yǎng)物集存庫對(duì)人胚胎眼鞏膜成纖維細(xì)胞存在部分爭(zhēng)議，而小鼠成纖維細(xì)胞與眼部多種成纖維細(xì)胞有著較類似的生物學(xué)功能，故在本研究中使用小鼠成纖維細(xì)胞作為替代。本研究共檢測(cè)到17 980個(gè)基因，140個(gè)有顯著差異的基因，其中上調(diào)表達(dá)基因120個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因20個(gè)。從GO生物學(xué)進(jìn)程中可發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞代謝過程和生物調(diào)控等方面；從GO細(xì)胞組分來看，大部分的差異表達(dá)基因富集在生物合成和分泌等方面；從GO的分子功能來看，差異表達(dá)基因主要富集在生物合成相關(guān)酶活性等方面。KEGG分析結(jié)果顯示，差異基因涉及的通路中，血小板活化、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白信號(hào)通路、腎素-血管緊張素系統(tǒng)最為顯著，提示ELF-EMFs調(diào)控小鼠成纖維細(xì)胞可能涉及以上相關(guān)通路的變化，MAPK12、AGTR2、VEGF基因在以上通路中改變顯著?，F(xiàn)階段普遍認(rèn)為，AGTR2在腎素-血管緊張素系統(tǒng)中起著非常重要的作用，該基因除了在高血壓和左心室肥厚重塑中作為重要的研究靶點(diǎn)之外[14-16]，以AGTR2為靶標(biāo)的腎素-血管緊張素系統(tǒng)的拮抗劑在糖尿病視網(wǎng)膜病變中有助于漸進(jìn)改變視網(wǎng)膜細(xì)胞的環(huán)境，從而保護(hù)視網(wǎng)膜[17]。在通過激光光凝視網(wǎng)膜血管疾病的治療中，AGTR2是抑制VEGF誘導(dǎo)血管生成的候選靶標(biāo)[18]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，選擇性激活A(yù)GTR2可以顯著阻斷血管緊張素Ⅱ、脂多糖和過氧化氫誘導(dǎo)的核因子-κB激活和炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，所以選擇性激活A(yù)GTR2可能是視網(wǎng)膜疾病治療的新途徑[19]，為眼科疾病的治療提供了新的靶標(biāo)。

但在本研究中，經(jīng)過ELF-EMFs處理后，AGTR2和VEGF的表達(dá)均顯著上調(diào)。VEGF作為眼部疾病發(fā)生的重要基因，在年齡相關(guān)性黃斑變性、中心性滲出性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變等眼部疾病的發(fā)生過程中有重要作用。VEGF表達(dá)水平升高提示ELF-EMFs對(duì)成纖維細(xì)胞的影響可能引發(fā)眼部各類疾病的發(fā)生。

MAPK家族控制大量的細(xì)胞過程，是真核生物對(duì)環(huán)境應(yīng)激和炎癥應(yīng)答的保守機(jī)制之一。MAPK12能夠通過生長(zhǎng)因子、促細(xì)胞分裂劑、激素、細(xì)胞因子等外部刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生特定細(xì)胞應(yīng)激，從而應(yīng)對(duì)各種外部刺激，對(duì)于眼部外傷、年齡相關(guān)性黃斑變性、角膜內(nèi)皮細(xì)胞增生有著重要作用[20-22]。

成纖維細(xì)胞是機(jī)體完成生物學(xué)功能的重要組成細(xì)胞，是疏松結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分，具有膠原形成、蛋白分泌、創(chuàng)傷修復(fù)等功能。在免疫耐受、組織修復(fù)等過程中有著重要作用[23-24]。在機(jī)體受到損傷時(shí)，傷口自然愈合是通過細(xì)胞外基質(zhì)沉積引起的組織纖維化進(jìn)行的，但過度纖維化會(huì)引起一些不良反應(yīng)，甚至?xí)l(fā)一些新的疾病，如系統(tǒng)性硬化[25]。翼狀胬肉的形成也與過度纖維化有著密切關(guān)系[26]，通過藥物處理，可抑制成纖維細(xì)胞的增生并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而防治復(fù)發(fā)性翼狀胬肉[27]。成纖維細(xì)胞的多種功能在眼部疾病的發(fā)展過程中具有重要作用。雖然過度纖維化會(huì)影響角膜損傷后的修復(fù)[28]，并與角膜上皮基底膜有著密切的關(guān)系[29]；但是在最新的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，角膜上皮清創(chuàng)可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使角膜基質(zhì)細(xì)胞衰老，表現(xiàn)出非纖維化的表型，可能參與角膜纖維化的自我限制[30]。

本研究通過對(duì)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，全面分析了ELF-EMFs對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，為進(jìn)一步的機(jī)制研究提供了方向。但本次測(cè)序僅為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，無法對(duì)非編碼RNA的調(diào)控進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可進(jìn)一步對(duì)電磁輻射后細(xì)胞進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，得到更加全面的結(jié)果。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MAPK12、AGTR2和VEGF基因?qū)τ贓LF-EMFs作用后成纖維細(xì)胞應(yīng)激有重要作用，這3個(gè)差異表達(dá)基因可能影響或參與了成纖維細(xì)胞損傷修復(fù)的過程，可作為探討ELF-EMFs對(duì)眼部病變影響的候選靶標(biāo)，其具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突