CD30L 基因表達(dá)對(duì)脂多糖刺激后小鼠腹腔CD11b+細(xì)胞表型變化影響的研究①

張芷寧 王 笑 王曉楠 張曉清 孫 遜 （中國(guó)醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，沈陽(yáng)110000）

CD30 和 CD30 配 體（CD30 ligand，CD30L，CD153），分別屬于腫瘤壞死因子超家族受體8（tu?mor necrosis factor receptor superfamily 8，TNFRSF8）和腫瘤壞死因子超家族8（tumor necrosis factor su?perfamily 8，TNFSF8）成員［1］。CD30 是Ⅰ型膜相關(guān)糖蛋白，最初發(fā)現(xiàn)于霍奇金淋巴瘤（Hodgkin's lym?phoma，HL）和鏡影細(xì)胞（Reed-Sternberg 細(xì)胞，R-S細(xì)胞），作為HL 中霍奇金氏細(xì)胞和R-S 細(xì)胞的標(biāo)志物，主要表達(dá)在活化的效應(yīng)性或記憶性T細(xì)胞，活化的 B 細(xì)胞和淋巴源性腫瘤細(xì)胞表面［2-3］。CD30L 是Ⅱ型膜相關(guān)糖蛋白，表達(dá)在巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、活化的 CD4+T 細(xì)胞、活化的 CD8+T 細(xì)胞、γδT 細(xì)胞、CD4+CD3?CD11c?輔助細(xì)胞表面［4-5］。CD30 和 CD30L在血液系統(tǒng)惡性腫瘤以及慢性炎性疾病，例如紅斑狼瘡、哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）和特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）中表達(dá)上調(diào)［6］。CD30L/CD30 在免疫系統(tǒng)的各個(gè)方面均具有重要的調(diào)節(jié)功能，在人T 細(xì)胞白血病中，CD30 呈現(xiàn)高表達(dá)并活化核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB），促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［7］；在RA中CD30L/CD30發(fā)揮動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)作用，驅(qū)動(dòng)著復(fù)雜的促炎和抗炎機(jī)制［8］；在過敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）中，CD30L 通過放大Th2 細(xì)胞應(yīng)答效應(yīng)，在過敏性鼻炎的發(fā)展中發(fā)揮重要作用［9］。故CD30L/CD30 可能在炎性疾病治療中起到關(guān)鍵性作用。然而其影響炎性疾病的機(jī)制是否與固有免疫系統(tǒng)有關(guān)尚未明確。

高等脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)，主要由固有免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)構(gòu)成，當(dāng)機(jī)體受到損傷時(shí)，自身保護(hù)性免疫機(jī)制激活，出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。巨噬細(xì)胞屬于固有免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞的典型標(biāo)志分子包括CD11b、F4/80 等，當(dāng)出現(xiàn)環(huán)境刺激（如微生物產(chǎn)物、受損細(xì)胞）時(shí)，血液循環(huán)的單核細(xì)胞在趨化因子CCL2 的作用下，進(jìn)入組織并且分化成巨噬細(xì)胞，位于炎癥的浸潤(rùn)部位，可以吞噬有害微生物，清除凋亡細(xì)胞并促進(jìn)創(chuàng)傷后的組織修復(fù)［10-11］。成熟的巨噬細(xì)胞可以進(jìn)一步極化為經(jīng)典活化型或替代活化型巨噬細(xì)胞［12］。LPS 是革蘭氏陰性細(xì)菌外膜中的大分子，作為病原體相關(guān)模式分子（pathogen-associated molecular patterns，PAMP），可以與巨噬細(xì)胞表面Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）結(jié)合，活化巨噬細(xì)胞，使其抗原提呈和吞噬微生物的能力提高，并且促進(jìn)促炎性細(xì)胞因子及毒性介質(zhì)的分泌［13］。

本研究通過建立TGM 誘導(dǎo)的小鼠腹腔無菌炎癥模型，分離腹腔CD11b+細(xì)胞，利用LPS 刺激，研究在炎癥條件下CD30L 對(duì)CD11b+細(xì)胞表型變化的影響。結(jié)果顯示，Cd30l基因的缺失使小鼠腹腔CD11b+細(xì)胞的活化性表型表達(dá)下降，抑制性表型表達(dá)上升，因此CD30L 可能對(duì)CD11b+細(xì)胞表型的變化產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和材料 RPMI1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自Biological Indus?tries 公司；脂多糖（LPS）、巰基乙酸培養(yǎng)基、紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自Sigma 公司；流式抗體APCCy7 antimouse CD11b、FITC anti-mouse F4/80、BV605 antimouse CD86、PE anti-mouse CD30L、V500 anti-mouse I-A/E、CD16/32 購(gòu)自 Biolegend 公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8 周齡的SPF 級(jí)C57BL/6 雌性小鼠購(gòu)自北京維通利華公司，小鼠飼養(yǎng)于SPF 屏障設(shè)施內(nèi)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腹腔無菌炎癥模型的建立 小鼠腹腔注射無菌PBS 和TGM，高壓蒸汽滅菌鍋高壓滅菌PBS及TGM 121℃，15 min。使用5 ml注射器連續(xù)向小鼠腹腔注射無菌PBS或TGM 3 d，1 ml/（只·d）。

1.2.2 小鼠腹腔CD11b+細(xì)胞的分離培養(yǎng) 將小鼠頸椎脫臼處死，無菌條件下灌洗并收集腹腔細(xì)胞，常規(guī)裂解紅細(xì)胞，接種于含有10% FBS 的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，去除未貼壁細(xì)胞。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)注射TGM 前后WT 小鼠腹腔CD11b+細(xì)胞表型變化 制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度至1×106個(gè)/ml，100 μl抗體體系重懸細(xì)胞，按試劑盒說明書加入anti-CD16/32，避光冰上孵育15 min，加入F4/80、CD11b、CD86、CD30L、I-A/E 抗體，避光冰上孵育30 min。流式緩沖液洗滌細(xì)胞懸液，300μl流式緩沖液重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 體外LPS 刺激小鼠腹腔CD11b+細(xì)胞 調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml 并分別接種于含有10%FBS 及 10、100、1 000 ng/ml LPS 的 RPMI1640 培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)8 h、16 h、24 h后收集細(xì)胞。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LPS 刺激WT 小鼠CD11b+細(xì)胞不同時(shí)間及濃度其表型的變化 制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度至1×106個(gè)/ml，100 μl抗體體系重懸細(xì)胞，按試劑盒說明書加入CD16/32，避光冰上孵育15 min，加入F4/80、CD11b、CD86、CD30L、I-A/E抗體，避光冰上孵育30 min。流式緩沖液洗滌細(xì)胞懸液，300μl流式緩沖液重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LPS 刺激WT 和CD30LKO小鼠腹腔CD11b+細(xì)胞不同時(shí)間其表型變化 制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度至1×106個(gè)/ml，100 μl PBS重懸細(xì)胞，按試劑盒說明書加入CD16/32，避光冰上孵 育 15 min，加 入 F4/80、CD11b、CD86、I-A/E、CD206 抗體，避光冰上孵育30 min。流式緩沖液洗滌細(xì)胞懸液，300 μl 流式緩沖液重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 7.0 軟件，在滿足方差齊性的條件下，兩組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（Student'sttest）進(jìn)行比較，計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 注射TGM 前后，WT小鼠腹腔巨噬細(xì)胞數(shù)量及表型變化 提取小鼠腹腔CD11b+細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PBS 注射組（對(duì)照組）和TGM 注射組CD11b+細(xì)胞數(shù)量變化及其表面 F4/80、CD86、I-A/E、CD30L表達(dá)情況。結(jié)果如圖1所示，與對(duì)照組相比，TGM注射組細(xì)胞總數(shù)明顯增高，CD11b+細(xì)胞數(shù)量增多。CD11b+細(xì)胞中CD86、F4/80表達(dá)無明顯變化，I-A/E、CD30L 表達(dá)下降。結(jié)果表明，向小鼠腹腔注射TGM可募集大量CD11b+細(xì)胞，且抑制CD11b+細(xì)胞上I-A/E及CD30L表達(dá)。

圖1 向小鼠腹腔注射TGM 前后，CD11b+細(xì)胞數(shù)量及表型的變化Fig.1 Changes in number of CD11b+cells in mice after in?traperitoneal injection of TGM

2.2 不同條件下LPS 刺激小鼠腹腔CD11b+細(xì)胞表型變化結(jié)果分析 使用10、100、1 000 ng/ml LPS 分別刺激培養(yǎng)TGM 處理的WT 小鼠腹腔CD11b+細(xì)胞8 h、16 h、24 h，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表型分子表達(dá)情況。結(jié)果如圖2 所示，隨著LPS 刺激CD11b+細(xì)胞時(shí)間的增加，CD11b+細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，CD11b+細(xì)胞表面活化表型F4/80、CD86、I-A/E 表達(dá)逐漸增高，尤其在100 ng/ml 條件下上升最為明顯。使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)CD11b+細(xì)胞上CD30L的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組（0 h）相比，LPS 刺激組CD30L的表達(dá)隨著刺激時(shí)間的增加而增高。

圖2 不同條件的LPS刺激下，CD11b+細(xì)胞表面分子的表達(dá)變化Fig.2 Changes in expression of CD11b+cells surface mole?cules under different LPS conditions

2.3Cd30l基因缺失對(duì)LPS 刺激小鼠腹腔CD11b+細(xì)胞表型變化的影響 加入濃度為100 ng/ml 的LPS 刺激小鼠腹腔 CD11b+細(xì)胞 8 h、16 h 以及 24 h，并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表型的變化。流式結(jié)果表明，隨著刺激時(shí)間的增加，與WT 小鼠相比，Cd30l基因敲除組小鼠CD11b+細(xì)胞百分比上升，CD11b+細(xì)胞中 CD86、I-A/E 表達(dá)逐漸降低，CD206表達(dá)逐漸增高（如圖3）。

圖3 CD30L對(duì)CD11b+細(xì)胞上活化與抑制表型的影響Fig.3 Effects of CD30L molecules on expression of acti?vated and inhibited phenotypes in CD11b+cells

3 討論

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞是目前為止研究最深入的組織巨噬細(xì)胞群之一，它在清除凋亡細(xì)胞和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中扮演重要角色［14-16］。在炎癥及腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，CD30 與其配體CD30L 結(jié)合后可進(jìn)一步激活下游的轉(zhuǎn)錄因子，從而介導(dǎo)細(xì)胞增殖或凋亡。而LPS可激活巨噬細(xì)胞，引起細(xì)胞因子合成和釋放，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥的發(fā)生。CD11b 是白細(xì)胞黏附因子β 2 整合素的α 亞單位，它作為整合素家族成員之一，是巨噬細(xì)胞表面的經(jīng)典標(biāo)志物。表皮生長(zhǎng)因子樣激素受體 1（EMR1），又稱 F4/80，作為 EGF TM7 蛋白家族的一員，它是小鼠巨噬細(xì)胞成熟的標(biāo)志物［17］。有學(xué)者指出，腹腔巨噬細(xì)胞表達(dá)出不同水平的F4/80，主要是因?yàn)樗鼈兎只图せ畹臓顟B(tài)不同［18］?？乖岢始?xì)胞（antigen presenting cell，APC）包括巨噬細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等［19］。主要組織相容性Ⅱ類分子（MHC Ⅱ）主要表達(dá)于APCs，參與T 細(xì)胞的激活和分化，調(diào)控適應(yīng)性免疫應(yīng)答。CD86 可以與 T 細(xì)胞表面 CD28 結(jié)合，作為 T 細(xì)胞活化 的 第 二 信 號(hào)［20］。 甘 露 糖 受 體 Mrc1，也 稱 為CD206，它表達(dá)在大多數(shù)巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞亞群的表面，是M2 表型小鼠巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物，參與抗原呈遞、內(nèi)吞和吞噬、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、固有免疫及適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)［21-22］。

有研究將基因敲除小鼠用于鑒定參與巨噬細(xì)胞分化過程中的轉(zhuǎn)錄因子，指出PU. 1和C/ EBPα是巨噬細(xì)胞前體生成所必需的分子［23］。而本研究利用CD30L 基因敲除小鼠對(duì)LPS 刺激CD11b+細(xì)胞過程中的變化進(jìn)行了研究。本研究向小鼠腹腔注射TGM 后，募集到大量CD11b+細(xì)胞，成功建立無菌炎癥模型。隨后，本課題組分離培養(yǎng)了原代CD11b+細(xì)胞，證明CD30L 表達(dá)在CD11b+細(xì)胞上，并且發(fā)現(xiàn)在LPS誘導(dǎo)激活后，巨噬細(xì)胞表面F4/80表達(dá)上調(diào)，提示CD11b+細(xì)胞吞噬能力增強(qiáng)；其表面CD30L 表達(dá)上調(diào)，提示CD30L 參與了LPS 刺激巨噬細(xì)胞活化的過程，并且可能對(duì)其活化產(chǎn)生了作用。隨后，本研究進(jìn)行了濃度梯度實(shí)驗(yàn)觀察在LPS 刺激下CD11b+細(xì)胞表面表型的變化，發(fā)現(xiàn)其在100 ng/ml 時(shí)的變化最為明顯。進(jìn)而選擇100 ng/ml 作為刺激條件，利用Cd30l基因敲除小鼠進(jìn)一步展開研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cd30l基因敲除后，在LPS體外刺激條件下，巨噬細(xì)胞表面抑炎性表型CD206 表達(dá)增加，促炎性表型CD86、I-A/E 表達(dá)降低，提示其在LPS刺激下可能向著抑炎性表型活化，因此，推測(cè)CD30L 可能參與調(diào)控小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的活化。

以往有學(xué)者對(duì)CD30L/CD30信號(hào)通路進(jìn)行了研究。在OVA 誘導(dǎo)的過敏性鼻炎模型中，CD30L 起到抑炎作用［9］；在小鼠腦膠質(zhì)瘤模型中，在腫瘤條件下，與WT 小鼠相比，CD30LKO 組小鼠腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞比例明顯增高，CD206 表達(dá)增高，I-A/E 表達(dá)下降［24］，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，Cd30l基因的缺失能促進(jìn)小鼠腹腔CD11b+細(xì)胞抑制性表型CD206 的表達(dá)上調(diào)，抑制活化性表型CD86 的表達(dá)，而在炎癥條件下這種影響的具體信號(hào)通路還有待進(jìn)一步研究。