Clec9A介導(dǎo)的體內(nèi)壞死細(xì)胞清除機(jī)制研究進(jìn)展①

晏 黎 黃 偉 全紫瑤 崔天盆 （湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢430022）

惡性腫瘤由于生長(zhǎng)迅速，腫瘤中央部位血液供應(yīng)相對(duì)不足，易導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生壞死。同時(shí)，細(xì)胞壞死也是機(jī)體病毒感染的常見結(jié)果之一，且可發(fā)生于病毒感染的任一階段［1］。未被及時(shí)清除的壞死細(xì)胞，會(huì)通過釋放胞內(nèi)物質(zhì)，如損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）物質(zhì)，引起炎癥反應(yīng)［2-3］。因此，機(jī)體免疫系統(tǒng)通過識(shí)別DAMPs 以起到清除壞死細(xì)胞和抑制炎癥反應(yīng)的功能［3］。

C 型凝集素 9 家族 A 成員（ C-type lectin domain family 9，member A，Clec9A），又稱為樹突狀細(xì)胞-NK細(xì)胞凝集素群受體1（DC-NK lectin group receptor-1，DNGR-1）是一種限制性表達(dá)在人外周血BDCA3+樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）和小鼠 CD8α+DC、CD103+DC 上識(shí)別細(xì)胞死亡信號(hào)的 DAMPs 受體［4-8］。研究表明人BDCA3+DC 具有與小鼠CD8α+DC 相似的表型和功能特性，能利用Clec9A 識(shí)別壞死細(xì)胞，通過主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ類分子交叉提呈壞死細(xì)胞抗原［5，7-10］。

Clec9A 分子與受損或壞死細(xì)胞暴露的細(xì)胞骨架成分——纖維狀肌動(dòng)蛋白（filaments actin，F(xiàn)-ac?tin）結(jié)合后通過其胞質(zhì)區(qū)的免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）募集和活化脾酪氨酸激酶（spleen tyrosinebased kinase，Syk），交叉提呈壞死細(xì)胞的抗原，激活細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL），啟動(dòng)機(jī)體對(duì)壞死細(xì)胞的清除［4-6，11］（見圖1）。本文將從Clec9A 的分子結(jié)構(gòu)、配體、信號(hào)通路、交叉提呈抗原等方面來闡述其介導(dǎo)壞死細(xì)胞清除的機(jī)制及研究進(jìn)展。

1 Clec9A 的CTLD 是結(jié)合纖維狀肌動(dòng)蛋白的特異位點(diǎn)

Clec9A 屬于2 型跨膜蛋白，具有典型的V 群C型凝集素樣受體的結(jié)構(gòu)。包括細(xì)胞外C型凝集素區(qū)域（C-type lectin-like domain，CTLD）、頸部區(qū)域和跨膜區(qū)以及胞質(zhì)內(nèi)帶有半免疫受體酪氨酸活化基序（hem-ITAM）［6］（見圖 1）。ZHANG 等［11］研 究 發(fā) 現(xiàn)Clec9A 的 CTLD 是識(shí)別 F-actin 的區(qū)域，這與其中兩個(gè)色氨酸殘基有關(guān)。CTLD 結(jié)構(gòu)雖與其他C 型凝集素相似，但這種特異性并不存在于其他C 型凝集素中［4，12］。進(jìn)一步對(duì) CTLD 結(jié)合 F-actin 的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)每個(gè)CTLD 與螺旋狀排列在F-actin 中的3個(gè)肌動(dòng)蛋白亞基作用，連接兩個(gè)肌動(dòng)蛋白原絲［12］。這種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不同于其他肌動(dòng)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)，證實(shí)Clec9A 受體的特異性，與其作為識(shí)別壞死細(xì)胞的受體功能相一致。2016 年，HAN? 等［13］發(fā)現(xiàn) Clec9A 的頸部區(qū)域能夠感知細(xì)胞外pH 值和離子強(qiáng)度的變化，做出相應(yīng)結(jié)構(gòu)的改變，以提高交叉提呈抗原的能力。同時(shí)用其他C 型凝集素頸部結(jié)構(gòu)替換，發(fā)現(xiàn)不能促進(jìn)壞死細(xì)胞抗原的表達(dá)。表明Clec9A 的頸部區(qū)域?qū)儆谑荏w功能完整性的一部分，對(duì)抗原的有效提呈是必不可少的。

圖1 Clec9A介導(dǎo)的體內(nèi)壞死細(xì)胞清除機(jī)制示意圖Fig.1 Clec9A mediated mechanism of phagocytosis necrotic cells in vivo

綜上所述，Clec9A 的功能不同于其他C 型凝集素，能夠特異性識(shí)別壞死細(xì)胞，交叉提呈至CD8+T細(xì)胞［4，11-12］。在識(shí)別過程中，病原因素所導(dǎo)致細(xì)胞損傷釋放的細(xì)菌毒素、病毒核衣殼等微環(huán)境能夠增加CTLD 對(duì) F-actin 的親和力［12］。此外，Clec9A 的頸部區(qū)域結(jié)構(gòu)在抗原內(nèi)吞途徑中發(fā)生構(gòu)象改變，這有助于壞死細(xì)胞抗原的交叉提呈［13］。

2 Clec9A 通過結(jié)合暴露的纖維狀肌動(dòng)蛋白識(shí)別壞死細(xì)胞

肌動(dòng)蛋白是真核細(xì)胞中最豐富、最保守、功能最廣泛的蛋白之一，是細(xì)胞骨架微絲系統(tǒng)的主要組成成分，在球狀（G-actin）和絲狀（F-actin）之間經(jīng)歷聚合和拆卸的循環(huán)［14］。SANCHO 等［5］發(fā)現(xiàn) Clec9A的配體對(duì)糖苷酶和核酸酶有抵抗性，但對(duì)蛋白酶、高溫和酸敏感。認(rèn)為其配體是一種由于細(xì)胞壞死，失去胞膜的完整性而暴露出來的胞質(zhì)蛋白質(zhì)。進(jìn)一步對(duì)配體受體復(fù)合物進(jìn)行質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)該復(fù)合物是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞骨架蛋白，包括血影蛋白、肌球蛋白和細(xì)絲蛋白［4］。2012 年，AHRENS 等［4］和ZHANG 等［11］研究發(fā)現(xiàn)纖維狀肌動(dòng)蛋白是 Clec9A 的特異性配體［4，11］（見圖 1）。近年研究指出Ⅱ型肌球蛋白（Myosin Ⅱ）能將肌動(dòng)蛋白絲組織成束狀，增強(qiáng)Clec9A 與 F-actin 的結(jié)合力［14］。而缺乏Ⅱ型肌球蛋白的纖維狀肌動(dòng)蛋白會(huì)減弱其刺激Clec9A 交叉提呈壞死抗原的能力。這一發(fā)現(xiàn)為臨床增強(qiáng)Clec9A疫苗效果提供了新策略。

當(dāng)細(xì)胞受到損傷，細(xì)胞膜破裂時(shí)，并不會(huì)突然導(dǎo)致細(xì)胞骨架完整性的喪失，相反死亡細(xì)胞也會(huì)保留聚合的肌動(dòng)蛋白絲作為細(xì)胞壞死的信號(hào)［4］。這一特點(diǎn)使大量暴露的F-actin 非常適合作為一種細(xì)胞損傷的危險(xiǎn)信號(hào)啟動(dòng)機(jī)體免疫反應(yīng)［4，14］。而Clec9A結(jié)合F-actin 是啟動(dòng)壞死細(xì)胞相關(guān)抗原表達(dá)的基礎(chǔ)［4-5，11-12］。此外，Clec9A 還可以識(shí)別晚期凋亡細(xì)胞，可能是由于細(xì)胞膜完整性喪失和胞膜上肌動(dòng)蛋白暴露所致［11］。

3 Clec9A 通過激活胞內(nèi)脾酪氨酸激酶Syk啟動(dòng)內(nèi)吞壞死細(xì)胞

研究表明Clec9A 是一個(gè)激活受體，也是一個(gè)內(nèi)吞受體［5-6］。Clec9A 的胞質(zhì)含有與 C 型凝集素 1（Dectin-1）相同的 hem-ITAM 序列，且 Dectin-1 啟動(dòng)的信號(hào)通路依賴 Syk 激酶。因此，HUYSAME 等［6］構(gòu)建了與Clec9A和Dectin-1胞質(zhì)尾部相一致的酪氨酸磷酸化和非磷酸化形式的多肽，與RAW264.7 巨噬細(xì)胞溶解產(chǎn)物的信號(hào)分子進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)Clec9A 胞質(zhì)的hem ITAM 序列能募集和活化Syk 激酶，誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的腫瘤壞死因子、Ⅲ型干擾素等。這些細(xì)胞因子能夠激活體內(nèi)其他免疫細(xì)胞，共同清除體內(nèi)壞死細(xì)胞。進(jìn)一步研究確認(rèn)Clec9A 結(jié)合F-actin 后依賴Syk 激酶啟動(dòng)下游信號(hào)通路，內(nèi)吞壞死細(xì)胞，同時(shí)信號(hào)啟動(dòng)的能力與結(jié)合F-actin 的含量有關(guān)［4-6］（見圖1）。

SCHREIBELT 等［7］通過 NIH3T3 成纖維細(xì)胞表面交聯(lián)Clec9A 觀察細(xì)胞表面受體，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間推移受體數(shù)目逐漸減少，晚期核內(nèi)體/溶酶體標(biāo)記物L(fēng)AMP-1 染色也證實(shí)細(xì)胞內(nèi)形成內(nèi)吞小泡。與大多數(shù)的受體攝取抗原后將抗原送入胞質(zhì)溶酶體內(nèi)處理不同的是，Clec9A 通過Syk 激酶信號(hào)將壞死細(xì)胞碎片轉(zhuǎn)移到一個(gè)不可降解的循環(huán)內(nèi)體腔室，經(jīng)過MHCⅠ類途徑提呈［10］（見圖1）。這種特性可能會(huì)使Clec9A 保護(hù)抗原不被溶酶體降解，最大限度地提取抗原，繼而激活機(jī)體獲得性免疫應(yīng)答。

4 Clec9A 交叉提呈壞死細(xì)胞抗原至CD8+T細(xì)胞，激活CTL

Clec9A 交叉提呈的壞死細(xì)胞抗原包括非感染的壞死細(xì)胞、病毒感染的壞死細(xì)胞和腫瘤相關(guān)抗原，在治療腫瘤、抗病毒感染中具有重要作用［5，7，10，15］。IBORRA 等［15］研究指出向小鼠注射牛痘病毒感染細(xì)胞后，Clec9A 識(shí)別壞死細(xì)胞中的配體，啟動(dòng)抗牛痘病CD8+T 細(xì)胞的交叉反應(yīng)（見圖1）。在高免疫原性的環(huán)境（單純皰疹病毒感染），缺乏Clec9A 的樹突狀細(xì)胞會(huì)影響 CTL 的活化［10］。體外培養(yǎng)BDCA3+DC 能夠交叉提呈黑色素瘤抗原肽至CD8+T 細(xì)胞［7］。此外，最新研究指出 Clec9A 可以促進(jìn)CD169+巨噬細(xì)胞攝取抗原后，通過cDC1s 激活CD8+T細(xì)胞的能力［16］。

活化的CTL 通過識(shí)別MHC Ⅰ類途徑交叉提呈的抗原，特異性結(jié)合靶細(xì)胞，釋放顆粒酶與穿孔素，而不攻擊正常組織。因此，Clec9A 在機(jī)體免疫系統(tǒng)激活CTL 上具有一定作用，能夠感應(yīng)細(xì)胞壞死信號(hào)并且誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)，清除靶細(xì)胞［10］。

5 應(yīng)用

Clec9A能夠交叉提呈壞死細(xì)胞抗原，活化CTL，啟動(dòng)機(jī)體獲得性免疫，在抗病毒感染和腫瘤治療中具有重要作用。在丙型肝炎病毒感染中，人外周血BDCA3+Clec9A+DC 細(xì)胞能產(chǎn)生大量Ⅲ型干擾素，直接干擾病毒的復(fù)制［17］。同樣的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)在人類肝臟和扁桃體組織中的DC 上［18］。表明產(chǎn)生高水平的Ⅲ型干擾素是BDCA3+Clec9A+DC 的特點(diǎn)之一。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在皮膚感染牛痘病毒的小鼠中，DNGR-1 可以促進(jìn)BDCA3+DC 交叉提呈抗原，產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-12、IL-15 和共刺激分子CD24，促進(jìn)生成皮膚組織常駐記憶性T 細(xì)胞（Trm）［19］。此外，DN?GR-1 同樣有助于流感病毒感染后肺 Trm 的生成［19］。當(dāng)皮膚和黏膜再次感染時(shí)，Trm 能夠快速啟動(dòng)機(jī)體免疫應(yīng)答。因此，Clec9A 通過結(jié)合F-actin 感知壞死細(xì)胞，啟動(dòng)強(qiáng)烈的CTL 抗病毒反應(yīng)，同時(shí)在機(jī)體生成抗病毒記憶細(xì)胞中也起到重要作用［15，19］。

DC 是體內(nèi)連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的專職提呈細(xì)胞，靶向抗原至DC 上的Clec9A 可以引起CTL的活化，識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面相關(guān)腫瘤抗原，并通過細(xì)胞毒性促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死亡［20-21］。KRISTEEN等［22］合成抗腫瘤免疫治療劑抗Clec9A 抗體，該抗體能特異性與CD141+細(xì)胞結(jié)合，將抗原提呈至CD4+T及CD8+T 細(xì)胞，為制備Clec9A 抗體在腫瘤治療中提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。ZENG 等［23］研究出含有抗 Clec9A 抗體和特異腫瘤抗原的納米制劑，發(fā)現(xiàn)此納米制劑能有效地將抗原提呈至靶向腫瘤浸潤(rùn)的DCs，促進(jìn)抗原特異性CD4+和CD8+T 細(xì)胞增殖，增強(qiáng)抗腫瘤的CTL反應(yīng)和抗體應(yīng)答。最新研究發(fā)現(xiàn)在此納米制劑中增加α-半乳糖神經(jīng)酰胺免疫佐劑，不僅能增強(qiáng)CTL細(xì)胞的毒性，同時(shí)可以活化NKT 細(xì)胞，啟動(dòng)機(jī)體固有免疫，為腫瘤治療提供了新思路［24］。

6 結(jié)語

機(jī)體對(duì)壞死細(xì)胞的清除障礙會(huì)導(dǎo)致壞死性碎片病理性的積聚，促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)，加重炎癥反應(yīng)［5］。Clec9A 通過胞外 CTLD 區(qū)域不僅識(shí)別壞死細(xì)胞釋放的F-actin，同時(shí)交叉提呈至CD8+T 細(xì)胞，激活CTL 特異性殺傷靶細(xì)胞，導(dǎo)致壞死細(xì)胞進(jìn)一步清除［5-7，10］。在治療腫瘤及抗病毒感染中具有重要研究前景?，F(xiàn)階段對(duì)Clec9A 啟動(dòng)的信號(hào)通路機(jī)制研究并不很明確，進(jìn)一步探索Clec9A 的分子機(jī)制及其在病理反應(yīng)中的作用，對(duì)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和許多重大疾病的發(fā)展、診斷及治療有重要意義。