李 杰,李小娟,肖友倫,任佐華,鄧力喜,夏新格,朱 艷,劉二明*
(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410128;2.湖南省植物保護(hù)研究所,湖南 長(zhǎng)沙 410125;3.遵義師范學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,貴州 遵義 563006; 4. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410128)
【研究意義】稻瘟病菌[Magnaportheoryzae(Hebert)Barr]無(wú)性態(tài)為Pyriculariaoryzae(Cook)Sacc,是稻梨孢屬真菌,由其引起的水稻稻瘟病是我國(guó)水稻三大病害之一,一般可引起水稻減產(chǎn)10%~30%,嚴(yán)重的可達(dá)50%以上甚至絕收[1]。據(jù)報(bào)道,全球每年因稻瘟病造成的水稻產(chǎn)量損失高達(dá)1000萬(wàn)t以上,經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)百億美元[2];近年我國(guó)稻瘟病的年均危害面積在7500萬(wàn) hm2左右[1]。實(shí)踐證明,在眾多的防治措施中,選育和利用抗病品種是控制該病害最經(jīng)濟(jì)、安全和有效的措施[1-2],而抗瘟性鑒定評(píng)價(jià)則是開(kāi)展抗病育種研究的重要環(huán)節(jié)。迄今為止,在稻瘟病選擇壓力大、病菌群體遺傳組成豐富的病圃中進(jìn)行自然誘發(fā)仍是最有效、最可靠和最經(jīng)濟(jì)的抗瘟性鑒定評(píng)價(jià)方法[3]。然而,由于水稻稻瘟病菌生理小種的多樣性和易變性,大部分水稻品種在推廣種植3~5年之后抗性下降甚至喪失[4]。因此,開(kāi)展病圃稻瘟病菌生理小種的鑒定研究,有針對(duì)性地篩選稻瘟病抗源與抗性品種,進(jìn)而加快稻瘟病抗性品種的培育與合理利用進(jìn)程,對(duì)稻瘟病的可持續(xù)防治具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】為客觀反映各稻區(qū)稻瘟病的實(shí)際發(fā)生情況與對(duì)抗病育種進(jìn)行科學(xué)指導(dǎo),通常要在同一稻區(qū)不同生態(tài)區(qū)域的稻瘟病常發(fā)或重發(fā)區(qū)設(shè)立多個(gè)自然誘發(fā)病圃,并利用7個(gè)中國(guó)鑒別品種測(cè)定病圃?xún)?nèi)的稻瘟病菌生理小種組成情況。如廣東省至今設(shè)立了3個(gè)代表性病圃[5],湖南省也設(shè)立了3個(gè)代表性病圃對(duì)區(qū)試品種進(jìn)行抗瘟性鑒定[6-8],廣西、湖北、云南、貴州等地的情況也類(lèi)似[9-12]。廣東省3個(gè)稻瘟病圃分別設(shè)址于陽(yáng)江、龍川及從化呂田,姜先芽等[13]研究表明陽(yáng)江病圃稻瘟病菌的優(yōu)勢(shì)生理小種為ZC13,其次為ZB13;康金平等[14]研究顯示龍川病圃稻瘟病菌的優(yōu)勢(shì)生理小種為ZB13,其次是ZC13;楊建源等[5]研究發(fā)現(xiàn),從化呂田病圃稻瘟病菌的優(yōu)勢(shì)生理小種為ZB13,其次是ZB5、ZC13;這揭示,廣東3個(gè)病圃的優(yōu)勢(shì)生理小種較為一致,而鐘寶玉等[15]研究發(fā)現(xiàn)廣東省的優(yōu)勢(shì)生理小種也為ZB13,表明這3個(gè)病圃的小種類(lèi)型在廣東省具有代表性。湖南省3個(gè)稻瘟病圃分別設(shè)址于桃江、瀏陽(yáng)、鳳凰,其中桃江病圃位于湖南省益陽(yáng)市桃江縣高橋鄉(xiāng)羅溪村,長(zhǎng)期是長(zhǎng)江中下游稻區(qū)和湖南省水稻新品種區(qū)試的稻瘟病抗性鑒定基地。近年來(lái),虞選杰等[16]、毛銳等[17]、周瑚等[18]先后研究了桃江稻瘟病圃病菌的遺傳多樣性情況,均顯示該病圃稻瘟病菌群體的遺傳差異大、遺傳結(jié)構(gòu)復(fù)雜,但未對(duì)病菌的生理小種類(lèi)型進(jìn)行鑒定?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】桃江病圃稻瘟病菌群體遺傳多樣性豐富、優(yōu)勢(shì)小種在湖南省具有代表性,但近10年來(lái)未對(duì)桃江病圃稻瘟病菌的生理小種組成與毒性進(jìn)行過(guò)研究。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)在番茄燕麥培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)孢測(cè)定64個(gè)分離菌株的產(chǎn)孢能力,利用離體接種鑒定技術(shù)并基于接種菌株在7個(gè)中國(guó)鑒別品種上的抗感反應(yīng),分析桃江病圃稻瘟病菌群體的生理小種類(lèi)型與毒性,旨在為湖南省乃至長(zhǎng)江中下游地區(qū)抗稻瘟病品種選育與利用提供參考依據(jù)。
1.1.1 供試鑒別品種 7個(gè)中國(guó)鑒別品種分別為特特普、珍瓏13、四豐43、東農(nóng)363、關(guān)東51、合江18、麗江新團(tuán)黑谷,均由湖南省農(nóng)科院植物保護(hù)研究所繁殖并提供。
1.1.2 供試稻瘟病菌 2018年在桃江病圃(湖南省益陽(yáng)市桃江縣高橋鄉(xiāng)羅溪村)采集稻瘟病穗頸瘟標(biāo)樣100份,通過(guò)單孢分離法獲得稻瘟病菌64個(gè),菌株名錄及來(lái)源水稻品種(系)名稱(chēng)詳見(jiàn)表1。
1.1.3 培養(yǎng)基 水瓊脂培養(yǎng)基(Water agar medium):瓊脂30 g,加水定容至1 L,滅菌。
馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato dextrose agar medium):馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂18 g,加水定容至1 L,滅菌。
番茄燕麥培養(yǎng)基(OTA medium):燕麥片40 g(煮沸過(guò)濾),番茄汁150 mL,瓊脂18 g,pH 6.5~6.7,加水定容至1 L,滅菌。
1.2.1 菌株產(chǎn)孢 將分離獲得的64個(gè)稻瘟病菌接種到番茄燕麥培養(yǎng)基上(培養(yǎng)皿直徑6 cm)進(jìn)行活化,待菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)后,加入2 mL水,用棉簽輕刮下培養(yǎng)基表面的菌絲并打散;再用1 mL移液槍將菌絲液轉(zhuǎn)移至新的番茄燕麥培養(yǎng)基上(培養(yǎng)皿直徑6 cm),滅菌玻璃棒涂布均勻,于超凈工作臺(tái)上吹干后,放入培養(yǎng)箱中28 ℃黑暗培養(yǎng)2~3 d;然后用棉簽將培養(yǎng)基表面菌絲輕擦去,置于光照培養(yǎng)箱中28 ℃藍(lán)黑光照培養(yǎng)3~4 d,即可獲得大量分生孢子。每皿加2 mL無(wú)菌水洗下孢子,顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)量,測(cè)定菌株的產(chǎn)孢能力。
1.2.2 菌株生理小種鑒定 (1)播種與育苗。供試鑒別品種預(yù)先在室溫下進(jìn)行催芽,露白后播種于塑料育秧盆中,每品種30粒左右。育苗土為田間土壤,秧苗接種前5~7 d施用一次尿素。
(2)制備孢子懸浮液。分離的稻瘟病菌株在番茄燕麥培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)孢完成后,先加2 mL無(wú)菌水于培養(yǎng)皿中,再用油畫(huà)筆洗下分生孢子,最后將孢子濃度調(diào)至1×105個(gè)/mL接種備用。
(3)離體葉片劃傷接種。待水稻秧苗長(zhǎng)至4葉期時(shí),參照并改良張海旺等[19]方法進(jìn)行水稻離體葉片劃傷接種。先用消過(guò)毒的剪刀將其葉子剪成4 cm左右葉段,再用槍頭垂直主葉脈處制造2個(gè)微創(chuàng)傷口但不穿透葉片;將葉片放入預(yù)先加有6-BA溶液的培養(yǎng)皿(直徑9 cm)中,把10 μL孢子液滴在葉片傷口上;然后將接種后的培養(yǎng)皿置于28 ℃黑暗條件下放置24 h,最后在28 ℃光照/黑暗交替條件下放置5~7 d,感病品種麗江新團(tuán)黑谷充分發(fā)病后調(diào)查記錄抗感反應(yīng)類(lèi)型。每處理3次重復(fù)。
(4)確定稻瘟病菌生理小種類(lèi)型。根據(jù)張海旺等[19]離體葉片接種采用的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)查:葉片劃傷處呈褐色點(diǎn)狀病斑,記為“R”;病斑呈梭形,最外層是淡黃色的中毒部,形狀不規(guī)則,記為“S”。記載鑒別品種的抗(R)感(S)反應(yīng)類(lèi)型,參照全國(guó)稻瘟病生理小種聯(lián)合試驗(yàn)組(1980)的標(biāo)準(zhǔn)[20]進(jìn)行病菌生理小種分類(lèi)和毒性分析。
1.2.3 病圃自然誘發(fā)鑒定 稱(chēng)取7個(gè)中國(guó)鑒別品種的種子各10 g,經(jīng)浸種、催芽于2018年5月21日播種于湖南桃江病圃中,秧箱兩邊播種鑒別品種,中間播種誘發(fā)品種湘晚秈11號(hào),當(dāng)苗齡在4~6葉期時(shí)調(diào)查,具體調(diào)查方法與分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[6]執(zhí)行,當(dāng)誘發(fā)品種發(fā)病在7級(jí)以上時(shí),調(diào)查7個(gè)中國(guó)鑒別品種的發(fā)病情況,0~4級(jí)為“R”反應(yīng),5~9級(jí)為“S”反應(yīng)。
采用Excel2013軟件,分別對(duì)不同分離菌株的產(chǎn)孢數(shù)量進(jìn)行平均值與標(biāo)準(zhǔn)差分析,根據(jù)在7個(gè)鑒別品種上的抗感反應(yīng)進(jìn)行生理小種類(lèi)型劃分,在此基礎(chǔ)上統(tǒng)計(jì)各生理小種出現(xiàn)的頻率并作出柱形圖。
通過(guò)在OTA培養(yǎng)基上培養(yǎng)與藍(lán)黑光燈誘導(dǎo)產(chǎn)孢,孢子洗脫后利用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)量(表2),9-1-1、17-1-1、17-1-6、20-1-1、20-2-1、31-1-1、X7-1-16、X7-1-2、X7-1-3等9個(gè)菌株產(chǎn)孢能力最強(qiáng),孢子數(shù)量在100×104個(gè)/mL以上;其次是6-1-1、6-2-1、9-2-1、31-1-3、31-2-1、33-1-2、35-2-2、S3-4-1、X1-1-8等9個(gè)菌株,產(chǎn)孢數(shù)量達(dá)50~100×104個(gè)/mL;而1-2-1、2-1-1、3-1-6、7-1-6、7-1-6、8-1-1、8-2-1、11-1-2、15-1-2、18-1-1、27-1-1、27-1-6、35-2-1、35-2-3、65-2-1、65-2-2、S3-1-1、S3-4-1、S8-2-4等35個(gè)菌株產(chǎn)孢數(shù)量為10~50×104(個(gè)/mL)之間;但3-2-4、S3-4-2、S4-1-7、S4-3-1、S8-1-7、S8-1-8、S8-1-9、S8-2-5、S8-4-2、X1-2-1、X7-1-7等11個(gè)菌株產(chǎn)孢低于10×104個(gè)/mL。以上結(jié)果比表明,來(lái)源桃江病圃的不同稻瘟病菌株在產(chǎn)孢能力上存在明顯差異,其中產(chǎn)孢量在10×104個(gè)/mL以上的53個(gè)菌株繼續(xù)生理小種鑒定研究。
表2 桃江病圃分離獲得的64個(gè)稻瘟病菌株的產(chǎn)飽數(shù)量分析
續(xù)表2 Continued table 2
對(duì)從桃江病圃分離獲得的稻瘟病菌進(jìn)行生理小種鑒定,共鑒定出4群12個(gè)生理小種(表3),即ZA群,僅有ZA1生理小種;ZB群里有ZB1、ZB3、ZB5、ZB11、ZB13、ZB15、ZB31等7個(gè)生理小種,ZC群里有ZC3、ZC13、ZC15等3個(gè)生理小種;ZG群里只有ZG1生理小種。對(duì)各菌群與小種的出現(xiàn)頻率進(jìn)行分析,在ZA、ZB、ZC、ZG 4個(gè)種群中,出現(xiàn)頻率最高的為ZB,頻率為79.2%,其次是ZC,頻率為17.0%;頻率最低的是ZA、ZG,均僅為1.9%,這表明桃江病圃稻瘟病菌優(yōu)勢(shì)種群為ZB。在ZA1、ZB1、ZB3、ZB5、ZB11、ZB13、ZB15、ZB31、ZC3、ZC13、ZC15、ZG1等12個(gè)生理小種中,出現(xiàn)頻率最高的是ZB15(圖1),頻率為39.6%;其后依次是ZB1、ZC3、ZB5;出現(xiàn)頻率最低的是ZA1、ZB11、ZC15、ZG1,僅為1.9%;這表明桃江病圃稻瘟病菌的優(yōu)勢(shì)生理小種為ZB15。
表3 桃江病圃稻瘟病菌生理小種鑒定結(jié)果
7個(gè)中國(guó)鑒別品種在桃江自然誘發(fā)病圃的鑒定結(jié)果表明(圖2),誘發(fā)品種湘晚秈11號(hào)的病級(jí)為9級(jí);7個(gè)鑒別品種中,麗江新團(tuán)黑谷為9級(jí),四豐43為8級(jí),珍瓏13為7級(jí),皆呈感病(S)反應(yīng);其余4個(gè)品種特特普、東農(nóng)363、關(guān)東51、合江18均為抗病(R)反應(yīng);因此7個(gè)鑒別品種在病圃也依次呈現(xiàn)“RSSRRRS”的反應(yīng)類(lèi)型,這與優(yōu)勢(shì)生理小種ZB15在7個(gè)鑒別品種上的反應(yīng)型吻合。
根據(jù)接種菌株在7個(gè)中國(guó)鑒別品種上的抗感反應(yīng),對(duì)桃江病圃稻瘟病菌群體的毒性進(jìn)行分析,表明強(qiáng)毒生理小種ZB1出現(xiàn)頻率達(dá)15.1%,比例僅次于優(yōu)勢(shì)生理小種ZB15,ZB1除了在特特普上呈現(xiàn)抗病(R)反應(yīng),其余皆是感病(S)反應(yīng)(圖3-a)。之后按出現(xiàn)頻率高低依次是ZB5、ZC3,這兩個(gè)生理小種的毒性也較強(qiáng)。毒性最強(qiáng)的ZA1在7個(gè)鑒別品種上都呈感病(S)反應(yīng)(圖3-b),在桃江病圃中也被分離鑒定到。以上結(jié)果揭示,桃江病圃稻瘟病菌群體的毒性較強(qiáng)。
7個(gè)中國(guó)鑒別品種被廣泛用于我國(guó)各稻區(qū)稻瘟病菌生理小種鑒定,其鑒定結(jié)果對(duì)指導(dǎo)水稻抗稻瘟病育種及抗性品種的合理布局具有重要參考價(jià)值[15, 21-23]。湖南桃江病圃是長(zhǎng)江中下游國(guó)家與湖南省水稻區(qū)試新品種的稻瘟病抗性鑒定基地,本研究通過(guò)將稻瘟病菌接種于7個(gè)中國(guó)鑒別品種的離體葉片上,基于抗感反應(yīng)把2018年桃江病圃稻瘟病菌劃分為4群12個(gè)生理小種,其中優(yōu)勢(shì)種群為ZB,占比79.2%;優(yōu)勢(shì)生理小種為ZB15,比例達(dá)39.6%。優(yōu)勢(shì)生理小種ZB15在7個(gè)鑒別品種上的抗感反應(yīng)型依次為RSSRRRS(R表抗病,S表感病);2018年將7個(gè)鑒別品種種植在桃江病圃使其自然發(fā)病,結(jié)果也依次呈RSSRRRS的反應(yīng)型;這表明,離體接種鑒定的優(yōu)勢(shì)生理小種類(lèi)型與田間是吻合的,揭示桃江病圃田間稻瘟病菌的優(yōu)勢(shì)生理小種為ZB15。
近年來(lái),尚沒(méi)有對(duì)湖南桃江病圃稻瘟病菌進(jìn)行生理小種研究的報(bào)道。對(duì)湖南省而言,最近的報(bào)道來(lái)自黃紅梅等[24]的研究,他們對(duì)采自湖南省瀏陽(yáng)、桃江、煙溪等17 個(gè)縣市的303個(gè)稻瘟病菌株進(jìn)行生理小種鑒定,共鑒定出7 群41個(gè)生理小種,其中ZB 為優(yōu)勢(shì)種群,ZG1為優(yōu)勢(shì)小種,其次為ZB13小種??梢?jiàn),ZB群是湖南省稻區(qū)稻瘟病菌的主要優(yōu)勢(shì)種群,而桃江病圃稻瘟病菌的優(yōu)勢(shì)種群也為ZB,這表明桃江病圃稻瘟病菌種群在湖南具有代表性。但是,桃江病圃稻瘟病菌群體的優(yōu)勢(shì)生理小種、毒性與湖南省存在差異,桃江病圃病菌的毒性明顯強(qiáng)于湖南省各地采集分離的病菌,這與周瑚等[25]的研究較為一致,分析其原因主要有:①桃江病圃四面環(huán)山、日照時(shí)間短、結(jié)露時(shí)間長(zhǎng)、濕度大,極有利于稻瘟病發(fā)生,這保證了菌株的大量充分繁殖,同時(shí)增強(qiáng)了菌株的毒性變異性;②病圃每年均要承擔(dān)上萬(wàn)份水稻品種、資源及低世代材料的抗瘟性鑒定,且病圃每年都會(huì)淘汰感和高感稻瘟病的水稻材料,保留下來(lái)的材料大部分表現(xiàn)中感或中抗水平,能使這些材料致病的菌株往往毒性較強(qiáng)[6]。因此,經(jīng)桃江病圃鑒定篩選出的抗病品種或資源在湖南省水稻生產(chǎn)與抗性育種上得到了廣泛應(yīng)用。然而,由于7個(gè)中國(guó)鑒別品種的遺傳背景不明,對(duì)稻瘟病抗性育種與品種布局的指導(dǎo)作用有限,下一步研究宜利用單基因品種對(duì)稻瘟病菌進(jìn)行致病型劃分。
稻瘟病菌誘導(dǎo)產(chǎn)孢是接種前的關(guān)鍵環(huán)節(jié),離體接種要求病菌的分生孢子產(chǎn)生量在10×104個(gè)/mL孢子以上。本研究通過(guò)將稻瘟病菌絲液轉(zhuǎn)移至番茄燕麥培養(yǎng)基上,用藍(lán)黑光連續(xù)照射誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得了大量分生孢子,但不同菌株在產(chǎn)孢能力方面存在明顯差異。早期相關(guān)研究也表明培養(yǎng)基與光照條件對(duì)菌株的產(chǎn)孢量影響最大[26-27]。孫國(guó)昌等[26]研究認(rèn)為玉米粉稻稈培養(yǎng)基最適宜用于稻瘟病菌誘導(dǎo)產(chǎn)孢;王寶華等[27]比較了幾種培養(yǎng)基的誘導(dǎo)產(chǎn)孢效果,發(fā)現(xiàn)燕麥片培養(yǎng)基誘導(dǎo)稻瘟病菌產(chǎn)孢的效果最好。孫國(guó)昌等[26]研究還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)波長(zhǎng)310~430 nm的藍(lán)黑光連續(xù)照射能顯著地促進(jìn)稻瘟病菌分生孢子的產(chǎn)生。因此,建議番茄燕麥培養(yǎng)基加藍(lán)黑光連續(xù)照射以大量誘導(dǎo)稻瘟病菌產(chǎn)生分生孢子。
本研究對(duì)2018年分離自湖南桃江病圃的64個(gè)稻瘟病菌株進(jìn)行產(chǎn)孢能力分析,結(jié)果表明,番茄燕麥培養(yǎng)基加藍(lán)黑光連續(xù)照射可有效誘導(dǎo)這些菌株產(chǎn)生分生孢子,但在產(chǎn)孢能力方面不同菌株存在明顯差異。利用7個(gè)中國(guó)鑒別品種對(duì)其進(jìn)行生理小種鑒定與毒性分析,結(jié)果顯示,測(cè)定的53個(gè)菌株被劃分為4群12個(gè)生理小種,優(yōu)勢(shì)種群為ZB,優(yōu)勢(shì)生理小種為ZB15,強(qiáng)毒生理小種ZB1出現(xiàn)頻率較高,還出現(xiàn)了毒性最強(qiáng)的ZA1小種;這揭示,桃江病圃稻瘟病菌群體的毒性較強(qiáng),經(jīng)桃江病圃鑒定與篩選出的抗病品種或資源將在湖南省乃至長(zhǎng)江中下游地區(qū)的水稻生產(chǎn)與抗性育種上發(fā)揮重要作用。