夷陵山羊微衛(wèi)星標(biāo)記雜合度與生長(zhǎng)性狀的回歸關(guān)系

鄧云霏，付玉蓉，沈洪學(xué)，劉桂瓊，朱德江，張 敏,，姜?jiǎng)灼?

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，湖北 武漢 430070;2. 宜昌市畜牧獸醫(yī)中心，湖北 宜昌 443000; 3. 宜昌市畜牧技術(shù)推廣站，湖北 宜昌 443000)

【研究意義】雜合度-適合度相關(guān)現(xiàn)象(Heterozygosity-fitness correlations，HFCs)在許多物種中已有發(fā)現(xiàn)，這些性狀包括體重、存活率和發(fā)育穩(wěn)定性等性狀。多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)個(gè)體雜合度與生長(zhǎng)性狀呈顯著正相關(guān)[1-6]。近交和遺傳漂變會(huì)降低遺傳雜合度，低雜合度會(huì)降低適應(yīng)性，從而導(dǎo)致雜合度與適合度相關(guān)[7]。雜合度可能是通過(guò)個(gè)體發(fā)育和生命早期最重要的環(huán)境之間的相互作用，即可能的生存能力選擇對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生影響[8]。局部效應(yīng)假設(shè)和一般效應(yīng)假設(shè)認(rèn)為，雜合度-適合度的相關(guān)性來(lái)自聯(lián)合超顯性，即受中性選擇的微衛(wèi)星標(biāo)記與選擇位點(diǎn)之間的遺傳關(guān)聯(lián)產(chǎn)生的表觀雜合子優(yōu)勢(shì)[9]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】個(gè)體多位點(diǎn)雜合度(Multilocus heterozygosity，MLH)是雜合子位點(diǎn)占所有測(cè)定位點(diǎn)的比值，其值越高說(shuō)明近期系譜中的近交程度越低。Coulson等[1]假設(shè)微衛(wèi)星標(biāo)記的突變主要通過(guò)重復(fù)單位數(shù)量的逐步變化而發(fā)生變異，并據(jù)此提出用個(gè)體2個(gè)等位基因之間重復(fù)單位的平方距離(meand2，MD)作為衡量近交程度的指標(biāo)。該方法基于逐步突變過(guò)程，適用于微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記[10]。MD是由單個(gè)個(gè)體在一個(gè)基因座上的2個(gè)等位基因計(jì)算的，是對(duì)形成個(gè)體的配子之間遺傳距離的度量。MD記錄純合性，但對(duì)于擁有數(shù)個(gè)等位基因的微衛(wèi)星，等位基因長(zhǎng)度變異的貢獻(xiàn)可能掩蓋了純合性的貢獻(xiàn)。因此，MD一般包含比個(gè)體雜合度更深層和久遠(yuǎn)的遺傳事件。MD是衡量近交程度的有用指標(biāo)，在衡量近期育種模式的結(jié)果時(shí)，它與更遙遠(yuǎn)的事件有關(guān)[6]。MLH反映近期事件造成的個(gè)體遺傳變異，MD反映遠(yuǎn)期事件造成的個(gè)體遺傳變異?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】夷陵山羊是地方肉用山羊品種，分布在中國(guó)的三峽地區(qū)(TGA)。三峽地區(qū)眾多的河流與溝壑劃分出一系列相互獨(dú)立的區(qū)域，在這里逐漸形成豐富的山羊品種資源。雜種優(yōu)勢(shì)在現(xiàn)代畜牧生產(chǎn)中受到廣泛應(yīng)用，雜合度-適合度的相關(guān)性研究在動(dòng)物生產(chǎn)中具有重要價(jià)值。若在群體中存在正回歸關(guān)系，則應(yīng)采用育種方法提高個(gè)體雜合度。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】確定夷陵山羊MLH、MD與生長(zhǎng)性狀、體重-體長(zhǎng)指數(shù)之間的關(guān)系；比較MLH與MD2種指標(biāo)在衡量近交程度上的差異，探索夷陵山羊體重是受近期還是遠(yuǎn)期變異的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

采集5個(gè)三峽地方品種共269只山羊的血液樣品，包括夷陵山羊(YL，n=37)、宜昌白山羊(YW，n=52)、麻城黑山羊(MB，n=60)、酉州烏羊(YB，n=60)和烏骨山羊(BB，n=60)，提取基因組DNA用于SNP測(cè)序，分析夷陵山羊與其他4種山羊的遺傳分化。5個(gè)山羊品種主產(chǎn)區(qū)均分布于長(zhǎng)江三峽地區(qū)沿岸。

采集247只夷陵山羊的血液樣品，均為2歲及2歲以上的成年母羊，提取基因組DNA用于微衛(wèi)星測(cè)序，分析微衛(wèi)星雜合度與生長(zhǎng)性狀的關(guān)系。樣本分別來(lái)自長(zhǎng)陽(yáng)永興生態(tài)牧業(yè)科技有限公司(n=63)、宜昌老高荒生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司(n=114)和秭歸縣兩河口鎮(zhèn)宋春雷山羊養(yǎng)殖家庭農(nóng)場(chǎng)(n=70)，以上3個(gè)核心保種場(chǎng)飼養(yǎng)管理方式與營(yíng)養(yǎng)水平一致。測(cè)定每只羊的體長(zhǎng)、體高、胸圍和體重，體重體尺測(cè)定參照農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)《綿、山羊生產(chǎn)性能測(cè)定技術(shù)規(guī)范》(NY/T 1236-2017)中的方法測(cè)定。

1.2 SNP測(cè)序分型

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)苯酚-氯仿法提取基因組DNA，溶解于TE緩沖液[10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1 mmol/L EDTA(pH 8.0)]中，并于-20 ℃儲(chǔ)存。選擇來(lái)自山羊的7條染色體的14個(gè)SNP標(biāo)記，每個(gè)基因座的引物和基因分型方法如表1所示。

表1 14個(gè)SNP位點(diǎn)的引物序列、退火溫度及基因分型方法

續(xù)表1 Continued table 1

1.3 微衛(wèi)星測(cè)序分型

從GenBank和FAO公布的數(shù)據(jù)以及前人研究中[11]，挑選7個(gè)山羊通用微衛(wèi)星位點(diǎn)。用熒光標(biāo)記引物對(duì)各位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，毛細(xì)管電泳法進(jìn)行測(cè)序分型(昆泰銳公司進(jìn)行)。PCR擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，退火20 s，72 ℃延伸10 s，從變性到延伸共進(jìn)行35次循環(huán)。微衛(wèi)星位點(diǎn)信息、退火溫度如表2所示，PCR反應(yīng)體系如表3所示。

表2 7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物序列和退火溫度

表3 7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的PCR反應(yīng)體系

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 體重-體長(zhǎng)指數(shù)計(jì)算 計(jì)算3種體重-體長(zhǎng)指數(shù)：G指數(shù)(Gindex，IG)、體質(zhì)指數(shù)(Body massindex，IBM)和體重指數(shù)(Ponderal index，IP)。

IG計(jì)算公式[12]：

IG=BW/BL1.5

(1)

式中，BW為體重，BL為體長(zhǎng)。

IBM計(jì)算公式[13]：

IBM=BW/BL2

(2)

式中，BW為體重，BL為體長(zhǎng)。

IP計(jì)算公式[14]：

IP=BW/BL3

(3)

式中，BW為體重，BL為體長(zhǎng)。IP參考人類新生兒的體重-身高指數(shù)。

1.4.2 個(gè)體雜合度計(jì)算 用Excel計(jì)算個(gè)體的多位點(diǎn)雜合度(MLH)和等位基因距離平方均值(MD)。

個(gè)體多位點(diǎn)雜合度指n個(gè)位點(diǎn)上雜合位點(diǎn)數(shù)占總位點(diǎn)數(shù)的比值，計(jì)算公式如下：

MLH=Hi/n

(4)

式中，Hi是雜合位點(diǎn)數(shù)，n是所有位點(diǎn)數(shù)。

等位基因距離平方均值指?jìng)€(gè)體n個(gè)位點(diǎn)上等位基因大小之差的平方和平均值，計(jì)算公式[1]如下：

(5)

式中，ia和ib是位點(diǎn)i上等位基因a和b重復(fù)單位的長(zhǎng)度，n為個(gè)體計(jì)分的位點(diǎn)總數(shù)。

1.4.3 群體遺傳參數(shù)分析 用Genepop計(jì)算5個(gè)山羊品種之間的Nei氏遺傳距離，并用Mega v.10.0.5的Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。用POPGENE計(jì)算7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的群體觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)，用PIC_CALC計(jì)算多態(tài)信息含量(PIC)。

用SAS v9.4的GLM過(guò)程對(duì)MLH、MD與性狀、體重-體長(zhǎng)指數(shù)進(jìn)行回歸分析。為了提高正態(tài)性，對(duì)MD取對(duì)數(shù)值[lg(d2+1)][15]，并以該值進(jìn)行后續(xù)分析。為了避免生長(zhǎng)性狀與雜合度兩者間度量尺度差異過(guò)大導(dǎo)致的統(tǒng)計(jì)效力下降，對(duì)體長(zhǎng)、體高、胸圍和體重取對(duì)數(shù)值。該過(guò)程不會(huì)改變數(shù)據(jù)間的性質(zhì)與相關(guān)關(guān)系，通過(guò)取對(duì)數(shù)壓縮了變量尺度，以達(dá)到提高統(tǒng)計(jì)效力的目的。

2 結(jié)果與分析

2.1 品種間的親緣關(guān)系聚類

根據(jù)Nei氏遺傳距離，用Neighbor-Joining方法構(gòu)建5個(gè)山羊品種的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)(圖1)。夷陵山羊和宜昌白山羊先聚為一類，再與酉州烏羊聚為一類，烏骨山羊和麻城黑山羊則單獨(dú)聚為一類。

2.2 夷陵山羊體重體尺及其指數(shù)多樣性

夷陵山羊成年體重變異范圍較大(表4)，大于1倍標(biāo)準(zhǔn)差的比例是15.8%，大于2倍標(biāo)準(zhǔn)差的比例是1.2%。體尺、體重-體長(zhǎng)指數(shù)也表現(xiàn)出相似的特點(diǎn)，表明該群體包含豐富的遺傳變異。

表4 夷陵山羊體重、體尺及其指數(shù)的平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差和變異范圍

2.3 夷陵山羊群體遺傳標(biāo)記多樣性

夷陵山羊7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的平均等位基因數(shù)為8.6(表5)，等位基因座數(shù)量變異范圍是6～10。夷陵山羊均顯示出雜合性，7個(gè)位點(diǎn)的雜合度平均值為0.631，變異范圍為0.360～0.837。期望雜合度平均值為0.672，變異范圍為0.546～0.759。

7個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)信息含量均值為0.615，除位點(diǎn)INRABERN172的PIC值為0.441，其余位點(diǎn)的均大于0.5，表明具有較豐富的遺傳變異信息(表5)。

表5 夷陵山羊7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的雜合度和多態(tài)信息含量

2.4 夷陵山羊的MLH、MD與生長(zhǎng)性狀、體重-體長(zhǎng)指數(shù)的回歸關(guān)系

夷陵山羊4個(gè)生長(zhǎng)性狀與3個(gè)體重-體長(zhǎng)指數(shù)中，體重與MD存在顯著的回歸關(guān)系(P<0.05，表6和圖2)，回歸方程表示為lg(WT)=0.03354lg(d2+1) + 1.403，MD可解釋1.72%的體重變異。IG、IBM和IP分別與MD存在顯著的回歸關(guān)系(P<0.05)，回歸方程分別表示為IG=8.32lg(d2+1) + 54.87，IBM=12.58lg(d2+1) + 70.83和IP=27.25lg(d2+1) + 120.4，MD可解釋2.88%的IG變異，2.75%的IBM變異和2.34%的IP變異夷陵山羊MLH、MD與生長(zhǎng)性狀和體重-體長(zhǎng)指數(shù)的回歸曲線擬合度均較低(R2<0.1)。在其他物種的相關(guān)研究中，體重與雜合度回歸曲線的擬合度均低于0.1(R2<0.1)[6]，說(shuō)明在微衛(wèi)星雜合度與適應(yīng)性性狀相關(guān)性研究中其擬合度較低屬于普遍現(xiàn)象，與數(shù)據(jù)的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換無(wú)關(guān)。

表6 夷陵山羊MLH、MD與生長(zhǎng)性狀和體重-體長(zhǎng)指數(shù)的單因素回歸分析結(jié)果

3 討 論

3.1 夷陵山羊與相鄰4種山羊的遺傳差異

夷陵山羊與其余4種山羊存在遺傳差異。首先，夷陵山羊與宜昌白山羊先聚為一類。夷陵山羊主產(chǎn)區(qū)位于湖北宜昌，含有50%宜昌白山羊血緣、25%波爾山羊血緣和25%努比山羊血緣，此結(jié)果符合夷陵山羊的培育歷史。其次，與夷陵山羊遺傳距離較近的是酉州烏羊，最遠(yuǎn)的是麻城山羊和烏骨山羊。聚類結(jié)果與各山羊品種主產(chǎn)區(qū)的地理分布情況基本相符，這與三峽地區(qū)特殊的地理環(huán)境有關(guān)[16]。地理隔離是群體間基因交流的天然屏障[17]，盡管5種山羊的產(chǎn)地集中，地理距離相對(duì)較小，但三峽地區(qū)河流與溝壑眾多，將此處的山羊群體劃分至破碎的小生境中，加上各地交通不便，各個(gè)山羊群體之間幾乎沒(méi)有基因交流。上述條件使得分布在此處的山羊小群體產(chǎn)生分化，逐漸形成豐富的地方山羊品種。因此，夷陵山羊是獨(dú)立于其他4種山羊的品種。

3.2 夷陵山羊體重與MD的關(guān)系

夷陵山羊體重與用微衛(wèi)星標(biāo)記估測(cè)的MD間有顯著回歸關(guān)系(P<0.05)，而體長(zhǎng)、體高和胸圍與MD沒(méi)有顯著回歸關(guān)系(P>0.05)。在馬鹿、斑海豹中發(fā)現(xiàn)初生重與MD之間存在正回歸關(guān)系(P<0.05)[1, 18]。

Han等[19]在通山烏骨山羊中觀測(cè)到體重、體長(zhǎng)、體高、胸圍和管圍等性狀與MLH具有顯著回歸關(guān)系(R2=2.51%～3.68%,P<0.05)。在鼠[2]、豬[3-4]、歐洲鰻鱺[5]和雞[6]等物種中，也觀測(cè)到雜合度與體重、生長(zhǎng)速率等適應(yīng)性性狀存在正回歸關(guān)系。由此可知，個(gè)體雜合度與體重等性狀具有普遍的回歸關(guān)系。但在本研究中，夷陵山羊體重與MLH間沒(méi)有顯著回歸關(guān)系(P>0.05)。MLH與MD是衡量個(gè)體遺傳多樣性的兩種不同指標(biāo)，有關(guān)2種指標(biāo)的相互補(bǔ)充與區(qū)別需進(jìn)一步探討。

3.3 夷陵山羊體重-體長(zhǎng)指數(shù)與MD的關(guān)系

夷陵山羊IG、IBM、IP與MD間有顯著回歸關(guān)系(P<0.05)。未見(jiàn)其他MD與體重-體長(zhǎng)指數(shù)關(guān)系的相關(guān)研究報(bào)道。

IG是由Gootwine[11]提出的一個(gè)新的體重-體長(zhǎng)指數(shù)，專為綿羊而設(shè)計(jì)。IBM的含義是單位體表面積的平均體重。IBM是衡量動(dòng)物機(jī)體能量?jī)?chǔ)備的一個(gè)良好指標(biāo)[20-23]。IBM包含體重和體型信息，與背膘厚、背最長(zhǎng)肌和產(chǎn)奶量等營(yíng)養(yǎng)狀況性狀的正相關(guān)表明IBM具有附加屬性[24]。IP的含義是單位體積的平均體重，相當(dāng)于機(jī)體密度的度量。目前在山羊上還未見(jiàn)關(guān)于IG、IBM、IP與MD之間關(guān)系的研究。實(shí)際上IG、IBM與IP都包含有體重和體型信息，它們與MD的正相關(guān)也說(shuō)明雜合度高的個(gè)體在機(jī)體能量?jī)?chǔ)備方面比雜合度低的更具優(yōu)勢(shì)。

3.4 夷陵山羊MLH與MD結(jié)果之間的對(duì)比

MLH與MD是有效衡量近交程度的指標(biāo)，MLH反映近期事件造成的個(gè)體遺傳變異，MD反映遠(yuǎn)期事件造成的個(gè)體遺傳變異。

夷陵山羊的體重與MD間有顯著回歸關(guān)系(P<0.05)，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與MLH相關(guān)性(P>0.05)。MLH是雜合子位點(diǎn)占所有測(cè)定位點(diǎn)的比例，MD是形成個(gè)體的配子之間遺傳距離的度量，MD相比MLH包含更多的種群歷史信息。盡管有研究認(rèn)為MLH比MD更適合作為雜合度-適合度相關(guān)性研究的遺傳指標(biāo)，但當(dāng)種群存在群體統(tǒng)計(jì)學(xué)歷史，或種群中所有個(gè)體都高度雜合時(shí)，同時(shí)使用這2種指標(biāo)可能對(duì)進(jìn)化過(guò)程的深入分析有所幫助，因此更傳統(tǒng)的雜合度測(cè)量方法無(wú)法區(qū)分個(gè)體間差異[25]。Coltman等[18]認(rèn)為，對(duì)于微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)據(jù)，MD比MLH更適用于衡量自然群體中的個(gè)體遺傳變異。夷陵山羊是人工培育品種，其父系血統(tǒng)來(lái)自波爾山羊與努比山羊，母系血統(tǒng)來(lái)源于宜昌白山羊。波爾山羊是人工培育品種，努比山羊是從國(guó)外引進(jìn)后經(jīng)過(guò)本土化的人工培育品種，宜昌白山羊是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期選育的本土品種。夷陵山羊具有50%的宜昌白山羊血統(tǒng)。因此，本研究結(jié)果顯示夷陵山羊的體重與MD的關(guān)系可能遺傳于其母系品種宜昌白山羊的長(zhǎng)期自然與人工選擇事件的結(jié)果。

在本研究中，夷陵山羊的IG、IBM、IP與MD間有顯著回歸關(guān)系(P<0.05)，但與MLH沒(méi)有相關(guān)性(P>0.05)。Gibbs與Chiucchi[26]對(duì)14個(gè)響尾蛇群體的研究表明，在13個(gè)群體中個(gè)體體質(zhì)(以Scaled mass index衡量)與MLH沒(méi)有相關(guān)性，僅有1個(gè)群體結(jié)果顯著。IBM和IP是反映體型的體況指標(biāo)。本研究的結(jié)果提示夷陵山羊的體型的個(gè)體間差異可能并非由近期發(fā)生的近交產(chǎn)生，而是由遠(yuǎn)期遺傳變異事件造成基因組層面上的變異產(chǎn)生的，這可能要追溯到夷陵山羊品種形成之前的時(shí)期，即群體遺傳分化。營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)備能力影響動(dòng)物生存能力，由于IG、IBM與IP能在一定程度上反映營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)備能力，在適宜范圍內(nèi)，其值越大，個(gè)體具有更高的適應(yīng)能力。IG、IBM和IP在衡量家養(yǎng)群體的個(gè)體遺傳變異時(shí)具有各自的優(yōu)點(diǎn)，在評(píng)估近交程度時(shí)可相互補(bǔ)充。

4 結(jié) 論

夷陵山羊的體重與MD之間存在顯著的正回歸關(guān)系，說(shuō)明其體重變異可能是遺傳于其母系品種宜昌白山羊的長(zhǎng)期適應(yīng)性進(jìn)化的結(jié)果。夷陵山羊的IG、IBM、IP與MD之間存在顯著的回歸關(guān)系，即體型在一定程度上受遠(yuǎn)期遺傳變異事件的影響。

致 謝：感謝宜昌市畜牧獸醫(yī)中心與華中農(nóng)業(yè)大學(xué)肉羊繁育課題組的劉辰暉、種玉晴、許鋒等人在采樣時(shí)給予的幫助。感謝長(zhǎng)陽(yáng)永興生態(tài)牧業(yè)科技有限公司、宜昌老高荒生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司和秭歸縣兩河口鎮(zhèn)宋春雷山羊養(yǎng)殖家庭農(nóng)場(chǎng)工作人員的支持。