人胸腺基質(zhì)發(fā)育及退化的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析

李雨晨，白麗蓮，黃荷鳳，劉欣梅

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國(guó)際和平婦幼保健院婦產(chǎn)科，上海市胚胎源性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200030

胸腺是建立適應(yīng)性免疫及自身免疫耐受的關(guān)鍵器官。T細(xì)胞在胸腺內(nèi)的分化有賴于以胸腺上皮細(xì)胞（thymic epithelial cell，TEC）、成纖維細(xì)胞（fibroblast，F(xiàn)b）和樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）等為代表的胸腺基質(zhì)細(xì)胞形成功能健全的微環(huán)境［1］。在胸腺內(nèi)，分化中的T細(xì)胞在TEC誘導(dǎo)下完成T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）基因重排形成TCR組庫(kù)，并識(shí)別由TEC和DC等抗原提呈細(xì)胞（antigen-presenting cells，APC）通過主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC）提呈的自身抗原肽，作出適當(dāng)強(qiáng)度的免疫反應(yīng)，完成陽(yáng)性選擇和陰性選擇，獲得成熟的免疫反應(yīng)功能，并清除自身反應(yīng)性T細(xì)胞，建立免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)［2］。

人類胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)TEC分化大約始于胚胎第8周，10～12周時(shí)皮、髓質(zhì)分界逐漸清晰；12～15周時(shí)，胸腺淋巴細(xì)胞數(shù)量達(dá)到高峰，T細(xì)胞在趨化因子作用下向外周淋巴組織遷移［3］。胸腺的體積于青春期達(dá)到高峰，并在成年后逐漸退化［4］。了解胸腺的發(fā)育和退化，對(duì)于研究機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的維持、自身免疫疾病的發(fā)生規(guī)律和免疫功能重建等方面均有重要意義［5］。

由于正常人類胸腺樣本不易獲取，過去對(duì)胸腺發(fā)育和退化的研究主要來自小鼠等模式生物，并且通常局限于整個(gè)組織水平或分選的特定細(xì)胞類型［6-7］。近年來，單細(xì)胞RNA測(cè)序（single-cell RNA-sequencing，scRNA-seq）技術(shù)的發(fā)展使得我們能從少量組織樣本中獲得單細(xì)胞分辨率的轉(zhuǎn)錄組圖譜，以揭示生物學(xué)過程中的細(xì)胞異質(zhì)性［8-10］。盡管目前已有針對(duì)人類胸腺的scRNA-seq研究發(fā)表，且覆蓋了從胚胎至成年的各個(gè)生命時(shí)期，但這些研究?jī)A向于將來自不同發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的樣本進(jìn)行整合分析，而忽略了由發(fā)育階段變化造成的生物學(xué)差異［11-12］。

為了探索人類胸腺基質(zhì)細(xì)胞在不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)，我們利用ArrayExpress數(shù)據(jù)庫(kù)中的人類胸腺單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（E-MATB-8581）［12］進(jìn)行生物信息學(xué)分析。根據(jù)樣本來源的孕周（post-conception weeks，PCW）和出生后年齡將其劃分為胚胎期、嬰兒期和成人期，分析不同類型的基質(zhì)細(xì)胞在各個(gè)發(fā)育階段的基因表達(dá)差異，并結(jié)合富集分析推測(cè)潛在的功能變化。

1 資料與方法

1.1 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)準(zhǔn)備

從zenodo數(shù)據(jù)庫(kù)下載DOI編號(hào)為10.5281/zenodo.3572422的E-MATB-8581［12］的“細(xì)胞-基因”表達(dá)矩陣，根據(jù)原數(shù)據(jù)提供的細(xì)胞類型注釋，選取了DC細(xì)胞、TEC細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cell，Endo）和Fb細(xì)胞等亞群進(jìn)行后續(xù)分析。該公共數(shù)據(jù)代表的胸腺樣本來自人類胚胎期（孕7～17周）、嬰兒期（3、6、10、15、30月齡）及成人期（13～35歲），包含的生命階段較完整，符合本研究的需要。

1.2 細(xì)胞分群

主要使用R語(yǔ)言Seurat對(duì)軟件包表達(dá)矩陣進(jìn)行分析［13］。保留符合以下條件的細(xì)胞數(shù)據(jù)：①檢測(cè)到基因數(shù)>500。②檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄本數(shù)>2 000。通過Log-Normalize方法，設(shè)置10 000為放縮因子，對(duì)轉(zhuǎn)錄本計(jì)數(shù)進(jìn)行歸一化。使用R語(yǔ)言RSCORE軟件包［14］，參考蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）數(shù)據(jù)庫(kù)BioGRID（4.2.192）［15］，對(duì)10 000個(gè)高可變基因構(gòu)建加權(quán)的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)，并根據(jù)相關(guān)性將多個(gè)基因模塊化，最終每個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)信息被轉(zhuǎn)換為基因模塊的評(píng)分值。基于該“細(xì)胞-模塊”矩陣進(jìn)行主成分分析（principal components analysis，PCA）降維。根據(jù)碎石圖選取前25個(gè)主成分（principal components，PC），使用統(tǒng)一流形逼近與投影（uniform manifold approximation and projection，UMAP）進(jìn)行非線性降維，在二維平面反映細(xì)胞間的相似程度［16］。

1.3 差異表達(dá)分析

對(duì)同一細(xì)胞亞型，以不同發(fā)育階段作為分組變量，使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)鑒定各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異表達(dá)基因。為了減少樣本間批次效應(yīng)的影響，將發(fā)育軌跡劃分為7～8孕周組（07-08PCW）、9～11孕周組（09-11PCW）、12～15孕周組（12-15PCW）、16～17孕周組（16-17PCW）、嬰兒期組（Infant）和成人期組（Adult）。使用Bonferroni校正法進(jìn)行多重檢驗(yàn)校正，修正后P值<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。選取各個(gè)階段中差異表達(dá)滿足|log2FC|>0.5的基因用于基因本體論（Gene Ontology，GO）功能分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome，KEGG）通路富集分析。

1.4 GO功能及KEGG通路富集分析

使用R語(yǔ)言clusterProfiler軟件包對(duì)各個(gè)階段富集表達(dá)的差異基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析［17］。使用Benjamini-Hochberg校正法校正多重檢驗(yàn)P值，修正后P值<0.05時(shí)認(rèn)為富集分析結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人胸腺基質(zhì)細(xì)胞的分群

基于UMAP結(jié)果，幾種主要基質(zhì)細(xì)胞在二維平面上能相互區(qū)分（圖1A）。我們根據(jù)經(jīng)典的細(xì)胞亞型標(biāo)記基因驗(yàn)證了分群的可靠性（圖1B）。TEC高表達(dá)泛上皮細(xì)胞標(biāo)記基因EPCAM和TEC標(biāo)記基因FOXN1［3］，其中皮質(zhì)TEC（cortical TEC，cTEC）表達(dá)PSMB11。DC的亞群分別高表達(dá)DC1標(biāo)記基因CLEC9A、DC2標(biāo)記基因CLEC10A和活化DC（activated DC，aDC）標(biāo)記基因LAMP3［18］。Endo高表達(dá)標(biāo)記基因CDH5［19］。Fb則高表達(dá)PDGFRA和COLEC11，以及2型Fb標(biāo)記基因FBN1［20］。

圖1 人類胸腺基質(zhì)細(xì)胞的UMAP分群圖Fig 1 UMAPplots of human thymic stromacells

Fb主要來自胚胎階段和成人階段，并依據(jù)不同發(fā)育階段分成離散的2群細(xì)胞。然而，來自同一階段內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)、不同建庫(kù)策略的Fb細(xì)胞幾乎完全混合，提示這種離散分群可能來源于胚胎期和成人期的生物學(xué)差異，而非批次效應(yīng)。TEC主要以cTEC和Ⅰ型髓質(zhì)TEC（medullary TEC，mTEC）細(xì)胞為主，其次是高表達(dá)自身免疫調(diào)控基因AIRE（autoimmune regulator）的Ⅱ型mTEC。盡管相同TEC亞型的細(xì)胞形成了相對(duì)集中且連續(xù)的分群，但來自不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞并未完全混合。類似地，來自胚胎期和成年期的Endo也形成了連續(xù)但不混合的分群。DC1、DC2和aDC亞群之間能清晰地區(qū)分，但來自不同發(fā)育階段的同一亞群細(xì)胞則被均勻混合。以上結(jié)果提示，基于PPI構(gòu)建基因相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)的分析方式，既有效地區(qū)分了不同細(xì)胞類型，同時(shí)揭示了可能由發(fā)育階段造成的差異，且相比于DC，這種差異在TEC、Endo和Fb中更為顯著。

2.2 APC隨發(fā)育進(jìn)程的轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)

對(duì)差異基因的GO和KEGG分析顯示，cTEC在胚胎早期主要富集包括核糖體參與的蛋白合成和加工等功能，而自9周齡開始直到成年則主要富集抗原提呈、自身免疫疾病相關(guān)的信號(hào)通路（圖2A）。此外，在出生后，cTEC下調(diào)表達(dá)與黏著斑（focal adhesion）、PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)的基因（圖2B）。與cTEC略有不同，Ⅰ型mTEC在胚胎和嬰兒期主要富集抗原提呈相關(guān)的信號(hào)通路，在成年期則富集與核糖體、mRNA代謝和細(xì)胞凋亡等有關(guān)的信號(hào)通路，并相應(yīng)下調(diào)多種自身免疫疾病相關(guān)通路的基因（圖3A）。Ⅱ型mTEC在胚胎期和嬰兒期的功能富集與Ⅰ型mTEC相似，但在成年期的差異表達(dá)基因未發(fā)現(xiàn)顯著上調(diào)的信號(hào)通路，僅發(fā)現(xiàn)少數(shù)下調(diào)的基因可能與糖代謝相關(guān)（圖3B）。

圖2 人類cTECs差異基因的KEGG通路分析Fig 2 The KEGG pathway analysis of differentially expressed genesof human cTECs

圖3人類mTECs差異基因的KEGG通路分析Fig 3 KEGG pathway analysis of differentially expressed genes of human mTECs

2類DC細(xì)胞自胚胎期至成人期均富集包括抗原提呈或多種自身免疫疾病相關(guān)的通路。其中，與其他時(shí)期相比，孕7～8周時(shí)的DC1細(xì)胞下調(diào)表達(dá)1型糖尿病等疾病相關(guān)的基因，而嬰兒期DC1細(xì)胞和胚胎期相比，還富集細(xì)胞凋亡相關(guān)的通路（圖4A）；出生后的DC2細(xì)胞和胚胎期相比，還富集腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)相關(guān)的通路，并且下調(diào)表達(dá)和糖類或蛋白質(zhì)代謝相關(guān)的基因（圖4B）。

圖4 人類胸腺DCs差異基因的KEGG通路分析Fig 4 KEGG pathway analysis of differentially expressed genes of human thymic DCs

我們進(jìn)一步關(guān)注MHC分子，即人白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）基因在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)差異。cTEC中的HLA基因大多在孕12周后表達(dá)上調(diào)，此后的發(fā)育階段中無顯著差異（圖5A）。而早在孕9～11周時(shí)，Ⅰ型mTEC中的HLA基因即呈現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，并持續(xù)到嬰兒期；進(jìn)入成年期后，Ⅰ型mTEC中的多種MHC-Ⅱ類分子基因，包括HLA-DQB1、HLA-DQA1、HLADRB5、HLA-DPA1、HLA-DPB1和HLA-DRB1等均顯著下調(diào)，MHC-Ⅰ類分子基因（HLA-A、HLA-B、HLA-C等）的下調(diào)則較輕微（圖5A）。HLA基因的表達(dá)模式在成年Ⅱ型mTEC細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)顯著改變（圖5A）。2類DC細(xì)胞的HLA分子均自胚胎早期就開始表達(dá)，在出生后達(dá)到峰值，并持續(xù)至成年（圖5B）。

圖5 人類胸腺APCs中HLA基因的表達(dá)差異Fig 5 Differential expression of HLA genesin human thymic APCs

2.3 Fb細(xì)胞隨發(fā)育進(jìn)程的轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)

Fb 1型細(xì)胞在胚胎期主要上調(diào)胰島素樣生長(zhǎng)因子2（insulin-like growth factor 2，IGF2）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-1（transforming growth factor-β1，TGF-β1），在胚胎期和嬰兒期上調(diào)COL1A1和COL3A1等膠原α鏈基因（圖6A）。Fb 2型細(xì)胞的膠原基因表達(dá)譜和Fb 1型細(xì)胞類似。然而，2種Fb自嬰兒期開始即上調(diào)MHC-Ⅰ類分子基因（HLAB、HLA-C）（圖6A），并在成人期下調(diào)表達(dá)多種膠原基因（圖6B）。此外，2種Fb在出生后階段均上調(diào)多種趨化因子配體基因，包括CXCL14、CCL19和CCL21等。作為比較，我們發(fā)現(xiàn)Ⅰ型mTEC的CCL19和CCL21在成年期較胚胎和嬰兒期下調(diào)（圖6C）。

圖6 人類胸腺Fb1和Fb2在不同發(fā)育階段的差異表達(dá)基因Fig 6 Differentially expressed genes of human thymic Fb1 and Fb2 across development stages

GO和KEGG分析提示，2種Fb細(xì)胞在胚胎期的功能以核糖體相關(guān)的蛋白質(zhì)合成或加工為主。Fb 1型細(xì)胞在嬰兒期主要富集細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）相關(guān)的通路，而在成人期則富集抗原提呈相關(guān)的通路（圖7A）。與Fb 1型細(xì)胞略有不同，F(xiàn)b 2型細(xì)胞在嬰兒期和成人期均富集抗原提呈和免疫反應(yīng)相關(guān)的通路（圖7B）。而2種Fb在成人期的下調(diào)基因均富集了以蛋白質(zhì)消化吸收和Prion病等為主的信號(hào)通路。以上結(jié)果提示，在出生后的胸腺發(fā)育中，F(xiàn)b從以一般基質(zhì)細(xì)胞的支持功能為主，逐漸產(chǎn)生參與T細(xì)胞抗原識(shí)別、分化和激活的功能。

圖7 人類胸腺Fb 1型和Fb 2型差異基因的KEGG通路分析Fig 7 KEGG pathway analysis of differentially expressed genes of human thymic Fb1 and Fb2

2.4 Endo隨發(fā)育進(jìn)程的轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)

在胚胎期和嬰兒期，Endo主要富集ECM和黏著斑等相關(guān)的通路。而自出生后開始，Endo還富集抗原提呈相關(guān)通路，特別是在成年期同時(shí)富集包括1型糖尿病、自身免疫性甲狀腺疾病相關(guān)的通路，并且下調(diào)細(xì)胞黏附、ECM或PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)的基因。HLA基因的表達(dá)譜顯示Endo在出生后顯著上調(diào)MHC-Ⅰ類和多種MHC-Ⅱ類分子基因（HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB5、HLADPA1和HLA-DPB1等）（圖8）。

圖8 人類胸腺Endo在不同發(fā)育階段的差異表達(dá)基因Fig 8 Differentially expressed genes of human thymic Endo across development stages

3 討論

在2類MHC分子中，通常認(rèn)為MHC-Ⅰ類分子主要與CD8分子結(jié)合，而MHC-Ⅱ主要結(jié)合CD4［21］。在胸腺內(nèi)，cTEC主要通過提呈2類自身抗原肽-MHC復(fù)合物，刺激T細(xì)胞前體作出適當(dāng)強(qiáng)度的免疫反應(yīng)，使CD4/CD8雙陽(yáng)性（double positive，DP）細(xì)胞獲得MHC限制性免疫反應(yīng)，激活生存信號(hào)并分化為CD4或CD8單陽(yáng)性（single positive，SP）細(xì)胞［2］。我們的分析發(fā)現(xiàn)，自胚胎期分化成熟以來，人類cTEC的抗原提呈功能一直持續(xù)到成年，同時(shí)2類MHC分子的表達(dá)均未見明顯下調(diào)。這些結(jié)果提示，胸腺的生理性退化可能對(duì)主要由cTEC完成的陽(yáng)性選擇功能影響較小。

由于mTEC的抗原提呈主要用于篩選出非自身反應(yīng)性T細(xì)胞，其抗原提呈功能下降可能使某些自身反應(yīng)性T細(xì)胞從陰性選擇中逃逸，進(jìn)入外周造成自身免疫疾?。?2］。過去對(duì)自身免疫疾病模型NZB小鼠的研究［23］發(fā)現(xiàn)，其胸腺中MHC-Ⅱ陽(yáng)性的mTEC比例在生理性退化時(shí)的數(shù)量衰減較對(duì)照組更顯著，提示了這類mTEC在自身免疫疾病發(fā)生中的潛在作用。我們的分析在單細(xì)胞分辨率水平更精確地推斷了人類胸腺生理性退化時(shí)最易影響的潛在mTEC亞型（Ⅰ型mTEC），其在成年期顯著下調(diào)MHC-Ⅱ類分子，抗原提呈功能較胚胎期和嬰兒期有所下降?？紤]不同MHC分子的親和性，這一改變可能更容易影響CD4單陽(yáng)性細(xì)胞，即諸如輔助性T細(xì)胞或調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等的前體，進(jìn)而影響青春期后的機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)［24］。值得注意的是，過去普遍認(rèn)為表達(dá)AIRE基因的Ⅱ型mTEC對(duì)誘導(dǎo)中心耐受、調(diào)控mTEC表達(dá)自身抗原肽等過程尤為關(guān)鍵［25-26］，然而，根據(jù)我們的功能富集分析，在成年期，該類細(xì)胞未見顯著的轉(zhuǎn)錄改變，且AIRE基因本身和HLA基因的表達(dá)也無明顯下調(diào)。因此，胸腺退化對(duì)Ⅱ型mTEC的影響有待設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

對(duì)于胸腺中的非APC細(xì)胞，我們主要分析了Fb和Endo。單細(xì)胞測(cè)序的細(xì)胞分群揭示了兩者在出生前后的轉(zhuǎn)錄差異。胚胎期的Fb除了表達(dá)多種膠原基因參與構(gòu)建ECM之外，還同時(shí)上調(diào)IGF2基因，這可能與其通過胰島素樣生長(zhǎng)因子受體（insulin-like growth factor receptor，IGF-R）誘導(dǎo)胚胎期T細(xì)胞前體的發(fā)育有關(guān)［27］。IGF2在出生后的Fb中下調(diào)，可能提示這種誘導(dǎo)作用的下降。在成年期，F(xiàn)b中多種膠原基因的下調(diào)，則可能使胸腺難以維持有序排列的小葉結(jié)構(gòu)。由于MHC-Ⅰ類分子通常在人類大多數(shù)細(xì)胞類型中均有表達(dá)，其表達(dá)上調(diào)不足以說明Fb在出生后分化出抗原提呈的功能。然而，CCL19和CCL21是mTEC通過CCR7誘導(dǎo)SP細(xì)胞進(jìn)入胸腺髓質(zhì)的主要趨化因子［28-29］。與Ⅰ型mTEC逐漸下調(diào)CCL19和CCL21相對(duì)應(yīng)，出生后的Fb上調(diào)這2個(gè)基因提示其具有類似的誘導(dǎo)T細(xì)胞在胸腺內(nèi)遷移的功能，也可能與出生后誘導(dǎo)T細(xì)胞歸巢或退化時(shí)的炎性反應(yīng)有關(guān)。

與Fb不同，胸腺中的Endo在出生后顯著上調(diào)2類MHC分子的表達(dá)，并可能由此參與T細(xì)胞的抗原識(shí)別。與MHC-Ⅰ類分子不同，MHC-Ⅱ類分子通常由專職的APC（professional APC）表達(dá)［30］。MHC-Ⅱ類分子在Endo中上調(diào)可由γ干擾素（γ-interferon，IFN-γ）誘導(dǎo)，并參與調(diào)控效應(yīng)-記憶T細(xì)胞（effector memory T cells）的抗原識(shí)別［31］，可能是與出生后適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的構(gòu)建相協(xié)調(diào)的改變。

綜上所述，我們基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法，揭示了多種人類胸腺基質(zhì)細(xì)胞在不同發(fā)育階段中潛在的功能改變，推斷了胸腺在出生后發(fā)育和退化過程中易受影響的細(xì)胞類型。胸腺生理性退化可能主要影響T細(xì)胞分化的陰性選擇。這些結(jié)果為后續(xù)研究人體免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)在生命早、中期的動(dòng)態(tài)改變和胸腺微環(huán)境的體外重建提供了新的依據(jù)。

參·考·文·獻(xiàn)

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