異土木香內(nèi)酯誘導(dǎo)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞BCR-ABL融合蛋白降解

陳 晨，高豐厚

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院腫瘤科，上海 201999

慢性粒細(xì)胞白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）是一種骨髓增生性腫瘤，BCR-ABL基因的異常表達(dá)是其顯著特征；研究顯示，該基因是由9號染色體上的C-ABL與22號染色體上的BCR相互易位形成的融合基因［1-2］。該融合基因編碼的BCR-ABL融合蛋白具有較強(qiáng)的酪氨酸蛋白激酶活性，可通過激活多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化［3］。酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）——伊馬替尼是美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的首個用于臨床的選擇性TKI，可極大地改善CML患者的生存率［4-5］。然而，隨著該藥物的長期使用，臨床上逐漸出現(xiàn)了伊馬替尼耐受的情況［6］。盡管沿著既有的思路開發(fā)了第2代TKI如Nilotinib、Dasatinib，同樣地也出現(xiàn)了耐藥性報(bào)道［7］。因此，尋求靶向BCR-ABL蛋白的新策略與新藥物仍然是目前克服BCR-ABL陽性腫瘤細(xì)胞耐藥的主要研究方向。異土木香內(nèi)酯（isoalantolactone，Iso）是從桉樹屬植物的根中分離出的內(nèi)酯化合物［8］。研究［9］表明，其對多種腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性效應(yīng)，而對正常細(xì)胞則無明顯毒性。基于此，本研究觀察了Iso對伊馬替尼敏感和耐藥的CML細(xì)胞的效應(yīng)，探討其下調(diào)伊馬替尼敏感和耐藥CML細(xì)胞中BCR-ABL融合蛋白的分子機(jī)制，以期為CML耐藥的相關(guān)研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及主要試劑

K562細(xì)胞（對伊馬替尼敏感）和K562R細(xì)胞（對伊馬替尼耐藥）由上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系吳英理教授贈送。293T細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。

Iso由吳英理教授贈送。主要試劑：蛋白酶體抑制劑MG132、自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）、溶酶體抑制劑氯喹（chloroquine，CQ）和半胱天冬酶抑制劑Z-VAD-FMK（Selleck，美國），RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基（HyClone，美國），胎牛血清（Gibco，美國），CCK-8細(xì)胞增殖和毒性檢測試劑盒（Dojindo，日本），F(xiàn)ITCAnnexin-V細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（BD Pharmingen，美國），SYBR Green熒光定量PCR試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司），Lipo 3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen，美國）；剪切型多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（cleaved poly ADP-ribose polymerase，cleaved PARP）抗體、剪切型半胱天冬酶3（cleaved caspase 3，cleaved CASP3）抗體、C-ABL抗體、半胱天冬酶7（caspase 7，CASP7）抗體、β-肌動蛋白（β-actin）抗體（CST，美國），CASP3抗體（Abcam，美國），辣根過氧化物酶結(jié)合兔抗鼠二抗、辣根過氧化物酶結(jié)合羊抗兔二抗（Jackson ImmunoResearch，美國）。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基分別培養(yǎng)K562和K562R細(xì)胞，在培養(yǎng)K562R細(xì)胞時需加入10μmol/L伊馬替尼以維持其耐藥性。同時，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力 將處于對數(shù)生長期的K562和K562R細(xì)胞分別用完全培養(yǎng)液重懸，按照5×103個/孔接種至96孔板中。向其中分別加入2.5、5、10、20、40、80μmol/L Iso作為處理組，加入等體積的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）作為對照組，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。采用CCK-8法分別于接種后0、24、36、48 h檢測細(xì)胞活性，并用酶標(biāo)儀檢測各孔在450 nm處的吸光度。細(xì)胞增殖抑制率（%）=［1-處理組D（450 nm）/對照組D（450 nm）］×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 分別將K562和K562R細(xì)胞按照1×104個/孔接種至6孔板中，加入Iso使其終濃度為10μmol/L（即為Iso組），同時加入等體積的DMSO作為對照組。培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞并按照試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞重懸，加入5μLAnnexin V-FITC和5μL PI染液，室溫下避光孵育15 min，于流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá) ①分別用不同濃度的Iso（2.5、5、7.5、10、20μmol/L，即為處理組）處理K562和K562R細(xì)胞24 h，對照組用等體積的DMSO；同時，用10μmol/L Iso處理K562和K562R細(xì)胞0、6、12、24 h。②分別用2μmol/L MG132、5μmol/L 3-MA、20μmol/L CQ預(yù)處理K562細(xì)胞1 h后，再加入10μmol/L Iso處理6 h；用50μmol/L Z-VAD-FMK預(yù)處理K562和K562R細(xì)胞1 h后，再加入10μmol/L Iso處理12 h。分別收集①、②實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞，加入適當(dāng)體積的1×SDS裂解液于100℃金屬浴中裂解10 min，而后行SDSPAGE電泳。經(jīng)轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉，加入對應(yīng)的一抗，包括剪切型PARP抗體（1∶1 000）、剪切型CASP3抗體（1∶1 000）、C-ABL抗體（1∶1 000）、CASP7抗體（1∶1 000）、β-actin抗體（1∶1 000）及CASP3抗體（1∶2 000），4℃孵育過夜，TBST洗膜后加入二抗（1∶5 000）。室溫孵育2 h，再經(jīng)TBST洗膜后加入化學(xué)發(fā)光顯影液進(jìn)行曝光。

1.2.5 反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時熒光定量PCR檢測 采用10μmol/L Iso分別處理K562或K562R細(xì)胞0、6、12、24 h后，用TRIzol試劑抽提該2種細(xì)胞的總RNA，并按照反轉(zhuǎn)錄說明書將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。依據(jù)SYBR Green熒光定量PCR試劑盒的步驟行實(shí)時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）檢測，以β-actin為內(nèi)參，BCR-ABL基因表達(dá)差異以相對表達(dá)量2-ΔΔCT展示。qPCR引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列Tab 1 Primer sequence for qPCR

1.2.6 構(gòu)建CASP3和CASP7敲減的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株 為敲減K562R細(xì)胞中CASP3和CASP7基因，首先需構(gòu)建pLL3.7-shCASP3和pLL3.7-shCASP7質(zhì)粒，敲減序列見表2。將293T細(xì)胞接種于6孔板中，并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。按照Lipo 3000轉(zhuǎn)染試劑說明書，將能表達(dá)病毒外殼的質(zhì)粒psPAX.2和病毒膜蛋白質(zhì)粒pMD2.G與上述構(gòu)建的pLL3.7質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后收集帶有病毒顆粒的培養(yǎng)基上清液，用其感染K562R細(xì)胞，篩選CASP3和CASP7敲減的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。隨后，分別向CASP3、CASP7敲減細(xì)胞中加入10μmol/L Iso處理12 h，采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測BCR-ABL蛋白的表達(dá)，方法同“1.2.4”。

表2 靶向敲減序列Tab 2 Target sequence of knockdown

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 8軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料以±s表示。組間差異采用Studentt檢驗(yàn)或方差分析進(jìn)行比較。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Iso對K562和K 562R細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)分析

采用CCK-8法檢測不同濃度的Iso于不同時間下對K562和K562R細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)，結(jié)果（表3）顯示，與對照組相比，Iso可抑制上述細(xì)胞的增殖，且呈劑量和時間依賴性。

表3 Iso對K562/K562R細(xì)胞的增殖抑制率分析（%）Tab 3 Analysisof proliferation inhibition rateof K562/K562Rcellsby Iso（%）

2.2 Iso誘導(dǎo)K562和K562R細(xì)胞凋亡效應(yīng)的檢測

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測Iso（10μmol/L）誘導(dǎo)K562和K562R細(xì)胞24 h的凋亡效應(yīng)，結(jié)果（圖1）顯示，與對照組相比，Iso處理K562和K562R細(xì)胞后，發(fā)生凋亡的細(xì)胞比例明顯增多（P=0.034，P=0.000）。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測Iso對K562和K562R細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)Fig 1 Apoptosisinducing effects of Iso on K562 and K562R cells by flow cytometry

2.3 Iso對K562和K562R細(xì)胞中BCR-ABL融合蛋白及凋亡相關(guān)蛋白水平的影響

用一系列濃度（0、2.5、5、7.5、10、20μmol/L）的Iso處理K562和K562R細(xì)胞24 h后，經(jīng)Western blotting檢測（圖2A、B）顯示，凋亡相關(guān)蛋白（包括剪切型CASP3和剪切型PARP）水平均顯著增加，BCR-ABL融合蛋白水平呈劑量依賴性下降。同時，隨著Iso（10μmol/L）作用CML細(xì)胞的時間延長，Western blotting結(jié)果（圖2C、D）顯示凋亡相關(guān)蛋白水平顯著增加、BCR-ABL蛋白水平顯著降低。

圖2 不同濃度及作用時間下Iso對K562和K 562R細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白和BCR-ABL融合蛋白水平的影響Fig 2 Effects of Iso on the levels of apoptosis-related protein and BCR-ABL fusion protein in K562 and K562Rcells at different concentrations and time

2.4 Iso對BCR-ABL mRNA水平的影響

為了探索Iso下調(diào)BCR-ABL融合蛋白表達(dá)的機(jī)制，采用反轉(zhuǎn)錄及qPCR檢測BCR-ABLmRNA的表達(dá)水平。結(jié)果（圖3）顯示Iso處理K562和K562R細(xì)胞后，BCRABLmRNA的表達(dá)水平無明顯變化。

圖3 Iso對K 562細(xì)胞（A）和K562R細(xì)胞（B）中BCR-ABL mRNA水平的影響Fig 3 Effects of Iso on the level of BCR-ABL mRNA in K562 cells(A)and K562Rcells(B)

2.5 蛋白酶體抑制劑、自噬抑制劑和溶酶體抑制劑對Iso誘導(dǎo)K562細(xì)胞中BCR-ABL融合蛋白下調(diào)的影響

為進(jìn)一步探究Iso誘導(dǎo)CML細(xì)胞中BCR-ABL蛋白的降解途徑，采用蛋白酶體抑制劑MG132、自噬抑制劑3-MA、溶酶體抑制劑CQ分別聯(lián)合Iso處理K562細(xì)胞，結(jié)果（圖4）顯示上述3種抑制劑均不能阻斷由Iso誘導(dǎo)的K562細(xì)胞中BCR-ABL蛋白的降解。

圖4 蛋白酶體抑制劑MG132（A）、自噬抑制劑3-MA（B）和溶酶體抑制劑CQ（C）對Iso誘導(dǎo)BCR-ABL融合蛋白下調(diào)的影響Fig 4 Effects of proteasome inhibitor MG132(A),autophagy inhibitor 3-MA(B)and lysosomal inhibitor CQ(C)on the down-regulation of BCR-ABL fusion protein induced by Iso

2.6 半胱天冬酶抑制劑對Iso誘導(dǎo)K 562和K 562R細(xì)胞中BCR-ABL融合蛋白下調(diào)的影響

為探究半胱天冬酶活性是否參與Iso誘導(dǎo)的CML細(xì)胞中BCR-ABL融合蛋白的降解，采用半胱天冬酶抑制劑Z-VAD-FMK聯(lián)合Iso處理K562和K562R細(xì)胞。結(jié)果（圖5）顯示Z-VAD-FMK作用后，CASP3活性形式（剪切型CASP3）及下游剪切型PARP均有所減少，表明ZVAD-FMK抑制了半胱天冬酶的活性。結(jié)果表明，Z-VADFMK能夠部分逆轉(zhuǎn)由Iso誘導(dǎo)的CML細(xì)胞中BCR-ABL蛋白的降解。

圖5 半胱天冬酶抑制劑Z-VAD-FMK對Iso誘導(dǎo)BCR-ABL融合蛋白下調(diào)的影響Fig 5 Effects of caspase inhibition Z-VAD-FMK on the down-regulation of BCRABL fusion protein induced by Iso

2.7 CASP3和CASP7在Iso誘導(dǎo)K562R細(xì)胞內(nèi)BCRABL蛋白下調(diào)作用中的比較

為了進(jìn)一步證實(shí)半胱天冬酶的激活有助于Iso誘導(dǎo)BCR-ABL融合蛋白的降解，本研究通過構(gòu)建CASP3和CASP7敲減的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，用Iso分別處理上述細(xì)胞。結(jié)果（圖6）顯示與NC組相比，敲減CASP7的細(xì)胞中CASP7表達(dá)量減少，但卻不能逆轉(zhuǎn)BCR-ABL融合蛋白的降解；而在敲減CASP3的細(xì)胞中，敲減CASP3則可部分逆轉(zhuǎn)該融合蛋白的降解。

圖6 CASP7（A）與CASP3（B）敲減對Iso誘導(dǎo)BCR-ABL融合蛋白下調(diào)的影響Fig 6 Effects of CASP7(A)and CASP3(B)knockdown on the down-regulation of BCR-ABL fusion protein induced by Iso

3 討論

BCR-ABL融合蛋白可通過激活多種信號通路［如磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）、核因子活化B細(xì)胞κ輕鏈增強(qiáng)子（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB）、JAK激 酶（Janus kinase，JAK）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）等通路］促進(jìn)細(xì)胞的存活和增殖，因此靶向BCR-ABL或?qū)⑹侵委烠ML的有效方法［1-2，10］。越來越多的證據(jù)［7，11］表明，通過小分子化合物誘導(dǎo)BCR-ABL的降解可能是克服TKI耐藥的有效策略。本研究發(fā)現(xiàn)，Iso可抑制CML細(xì)胞增殖且呈時間、劑量依賴性。值得說明的是，當(dāng)使用2.5μmol/L Iso處理K562細(xì)胞時，其抑制率較低，且隨著時間的增加組內(nèi)存在一定的偏差，使得該組在不同時間點(diǎn)下的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但隨著Iso濃度的增加，其抑制效果更為明顯。此外，Iso可誘導(dǎo)CML細(xì)胞中BCR-ABL融合蛋白的下調(diào)，而不影響B(tài)CR-ABLmRNA水平；同時，蛋白酶體和自噬溶酶體途徑均不參與Iso誘導(dǎo)BCR-ABL融合蛋白的降解過程。

近來的研究發(fā)現(xiàn)，caspase途徑參與了BCR-ABL融合蛋白的降解。如藤黃酸可通過激活caspase系統(tǒng)下調(diào)BCRABL蛋白的表達(dá)［12］，抗氧化劑黃腐酚通過激活caspase而非自噬或泛素蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin proteasome system，UPS）誘導(dǎo)BCR-ABL蛋白的降解［13］，而巰氧吡啶硫鉑通過caspase激活來抑制BCR-ABL的表達(dá)［14］。本研究的數(shù)據(jù)顯示半胱天冬酶抑制劑可阻斷Iso對BCRABL的降解，這也提示Iso可通過半胱天冬酶的激活來誘導(dǎo)BCR-ABL蛋白降解。

在半胱天冬酶家族中，CASP3和CASP7參與了多個蛋白質(zhì)的降解過程［15-16］。激活CASP3可促進(jìn)法尼?；D(zhuǎn)移 酶（farnesyltransferase，F(xiàn)Tase）/牻 牛 兒 基 轉(zhuǎn) 移 酶（geranylgeranyltransferase，GGTase）α亞基的裂解［17］，CASP7能夠裂解腫瘤壞死因子受體1（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）［18］，CASP3和CASP7也負(fù)責(zé)P53誘導(dǎo)的BCR-ABL降解［19］。本研究發(fā)現(xiàn)在CASP3敲減的K562R細(xì)胞中可部分逆轉(zhuǎn)由Iso誘導(dǎo)的BCR-ABL降解，而CASP7的敲減對該降解無影響。這一結(jié)果提示，CASP3活化可能參與了Iso誘導(dǎo)的BCR-ABL融合蛋白的降解過程。然而，Iso如何活化CASP3、活化的CASP3如何參與BCR-ABL融合蛋白的降解，或可通過觀察Iso如何作用于CASP3上游分子及活化的CASP3如何剪切BCR-ABL蛋白中氨基酸來闡明。

綜上，本研究證實(shí)Iso可通過激活CASP3來誘導(dǎo)CML細(xì)胞中BCR-ABL融合蛋白的降解。該結(jié)果為探究Iso靶向降解BCR-ABL融合蛋白提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時也為克服CML治療中的耐藥問題提供了新的線索。

參·考·文·獻(xiàn)

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