6-OHDA誘導(dǎo)的帕金森病小鼠表現(xiàn)出以p16Ink4a上調(diào)和星形膠質(zhì)細(xì)胞衰老為特征的衰老表型

袁 笑，田野野，薛 崢

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢 430030

帕金森病（Parkinson disease，PD）是一種神經(jīng)退行性疾病，在人群中的發(fā)病率隨著人口老齡化加劇而升高，是一種年齡相關(guān)性疾病，也是一種致殘性疾病。當(dāng)今可用的治療方法不能顯著改變疾病的進(jìn)展，造成了很大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］。PD的臨床癥狀主要包括以運(yùn)動(dòng)遲緩、肢體抖動(dòng)、肌肉僵硬為主要表現(xiàn)的運(yùn)動(dòng)障礙，以及以睡眠-喚醒周期調(diào)節(jié)障礙、認(rèn)知障礙、情緒和情感障礙、自主神經(jīng)功能障礙和疼痛為主要表現(xiàn)的非運(yùn)動(dòng)障礙。這兩方面都會(huì)隨著疾病的發(fā)展而加重，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［2］。

衰老是癌癥、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、骨質(zhì)疏松、纖維化和神經(jīng)退行性疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［3-4］。近年來，衰老與神經(jīng)退行性疾病的關(guān)系越來越受到重視［3，5］。人們?cè)噲D從靶向去除衰老細(xì)胞的角度尋找治療神經(jīng)退行性疾病的方法［6］。動(dòng)物模型在認(rèn)識(shí)PD的發(fā)病機(jī)制和尋找潛在治療靶點(diǎn)的過程中發(fā)揮重要作用［7］。在小鼠紋狀體內(nèi)注射6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）可建立一種較為理想的PD模型，能很好地模擬多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性損傷，能夠誘發(fā)PD中出現(xiàn)的主要行為缺陷和非運(yùn)動(dòng)癥狀［7-8］，具有生產(chǎn)穩(wěn)定、造模效果易于判斷的特點(diǎn)，適用于多種神經(jīng)保護(hù)策略的研究。然而，這種動(dòng)物模型是否具有與PD患者類似的衰老表現(xiàn)，是否能用于PD與衰老方向的基礎(chǔ)研究，尚未可知。本研究建立6-OHDA誘導(dǎo)的PD小鼠模型，探討此模型的衰老表型及衰老的膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選取雄性C57BL/6J小鼠，9～10月齡，體質(zhì)量28～35 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（豫）2020-0005。動(dòng)物飼養(yǎng)于該醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（鄂）2019-0106。高壓滅菌飲用水和飼料，動(dòng)物自由攝取。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)2020-S108）。將動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）和6-OHDA組，每組15只小鼠。

1.1.2 藥物與試劑 6-OHDA、阿撲嗎啡、L-抗壞血酸（Sigma-Aldrich，美國），兔抗酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）抗 體（16825-1-AP，Proteintech，中國），兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體（25859-1-AP，Proteintech，中國），兔抗離子鈣接頭蛋白分子1（ionized calcium bindingadaptor molecule-1，Iba-1）單克隆抗體（016-26721，Wako，日本），兔抗少突膠質(zhì)細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄因子2（oligodendrocyte transcription factor 2，Olig2）單 克 隆 抗 體（ab109186，Abcam，美國），小鼠抗p16抗體（sc-1661，Santa Cruz，美國），小鼠抗p21抗體（sc-6246，Santa Cruz，美國），488標(biāo)記的驢抗兔IgG抗體（711-545-152，Jackson ImmunoResearch，美國），594標(biāo)記的驢抗小鼠IgG抗體（715-585-150，Jackson ImmunoResearch，美國），DAPI（MBD0015，Sigma-Aldrich，美國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 6-OHDA紋狀體立體定位注射建立PD模型 將小鼠置于吸入式麻醉誘導(dǎo)盒中，將異戊烷濃度升至2%行誘導(dǎo)麻醉。待小鼠充分麻醉后，將小鼠頭部連接麻醉面罩，調(diào)整異戊烷濃度至1%維持麻醉。將動(dòng)物固定在立體定位儀（RWD，中國）上，沿頭部矢狀線做1.3 cm長的切口，用3%H2O2消化顱骨表面的軟組織，暴露前囟。以中線旁-2 mm、前囟前+0.5 mm為進(jìn)針點(diǎn)，用顱骨鉆（RWD，中國）在顱骨表面打直徑約為1 mm的小孔。微量進(jìn)樣器（上海高鴿，10μL）緩慢下行，在顱骨下3.5 mm注入藥物（6-OHDA組注入含有1%抗壞血酸的6-OHDA溶解液1.2μL，Sham組注入含有1%抗壞血酸的生理鹽水），速度0.5μL/min，每次注射完成后需留針5 min。緩慢退出進(jìn)樣器，處理創(chuàng)面。

1.2.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

（1）阿撲嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn) 在造模后第21日，腹腔注射0.125 g/L的阿撲嗎啡（0.5μg/g）觀察小鼠旋轉(zhuǎn)情況。將小鼠放置在5 000 mL的燒杯里，杯底附新鮮干燥墊料，等待5 min后，連續(xù)計(jì)數(shù)10 min內(nèi)小鼠向未造模側(cè)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，每旋轉(zhuǎn)360°記為1圈。

（2）轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn) 注射6-OHDA前1周，將小鼠置于轉(zhuǎn)棒儀上（IITC Life Science，美國）進(jìn)行預(yù)訓(xùn)練，分別以恒速16 r/min進(jìn)行練習(xí)，連續(xù)訓(xùn)練5 d，去除未達(dá)到均一水平的小鼠。在造模后的第21日，以16 r/min勻速進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，記錄小鼠在轉(zhuǎn)棒上停留的時(shí)間，取3次平均值，每次檢測間隔2 h。

與陸上車用柴油排放相比，船舶和港作機(jī)械所用的燃料污染危害更大，船舶污染已成為繼機(jī)動(dòng)車尾氣污染、工業(yè)企業(yè)排放之后第三大大氣污染來源。多項(xiàng)研究表明，國際航運(yùn)業(yè)70%的硫排放在距離海岸線400千米以內(nèi)的主要貿(mào)易路線上，在海陸風(fēng)的作用下，航運(yùn)排放污染可以侵入內(nèi)陸數(shù)百千米。

1.2.3 腦組織制備 末次行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，將小鼠用異氟醚麻醉，用PBS經(jīng)心臟灌注處死小鼠。用于蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)（Western blotting）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RTqPCR）分析的腦組織，放入預(yù)冷的異戊烷中快速冷凍，儲(chǔ)存在-80℃的冰箱中。用于免疫熒光染色的腦組織，在PBS灌流后使用4%多聚甲醛灌注，并在4%多聚甲醛中固定24 h，在30%蔗糖溶液脫水3 d。小鼠大腦的冠狀切片厚20μm，貼在抗脫落的載玻片上，將載玻片儲(chǔ)存在-80℃冰箱中，待后續(xù)染色。分別采集造模側(cè)和健側(cè)的紋狀 體［caudate putamen（striatum），CPu］及 黑 質(zhì)（substantia nigra，SN）區(qū)域的組織，用于Western blotting和RT-9PCR實(shí)驗(yàn)。在CPu和SN區(qū)域中分別收集60～70個(gè)切片，用于免疫熒光染色。

1.2.4 Western blotting檢測腦組織中TH蛋白含量 將小鼠CPu、SN區(qū)域腦組織加入蛋白裂解液和研磨珠，在組織研磨儀（賽維爾生物，中國）中打碎，提取蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)與5×上樣緩沖液混勻后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，常規(guī)轉(zhuǎn)膜封閉后加入一抗TH（1∶2 000），同時(shí)以GAPDH為內(nèi)參，4℃孵育過夜，TBST緩沖鹽溶液洗滌。根據(jù)一抗種屬加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，ECL顯色。用Biorad曝光機(jī)拍照，使用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。

1.2.5 免疫熒光染色觀察細(xì)胞衰老 將腦組織切片經(jīng)封閉和破膜后加入一抗，包括兔抗GFAP抗體（1∶200）、兔抗Iba-1單克隆抗體（1∶200）、兔抗Olig2單克隆抗體（1∶200）、小鼠抗p16抗體（1∶100）、小鼠抗p21（1∶100），置于濕盒中，4℃靜置過夜。次日用0.01 mol/L PBS洗片3次，每次5 min；滴加對(duì)應(yīng)二抗和DAPI，置于濕盒中，室溫避光靜置1 h；再用0.01 mol/L PBS洗片3次，每次5 min；擦干玻片，50%甘油封片。所有切片均在激光掃描共聚焦顯微鏡FV500（Olympus，日本）下盲法觀察。每只小鼠取CPu和SN區(qū)各3個(gè)腦片，在40倍物鏡視野下隨機(jī)采集各腦片相應(yīng)區(qū)域的照片5張，使用ImageJ軟件的Cell Counter插件分別統(tǒng)計(jì)與p16、p21、p16+GFAP、p16+Iba-1、p16+Olig2染色陽性細(xì)胞數(shù)量，取15張照片的平均值以減少誤差。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來自每組5只小鼠。

1.2.6 RT-qPCR檢測細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（cyclin-dependent kinase inhibitor，CDKi）及衰老相關(guān)分泌 表 型 （senescence-associated secretory phenotype，SASP） 在造模后的第21日，在冰上收集小鼠造模側(cè)及健側(cè)CPu及SN區(qū)腦組織。用RNAiso PLUS（Takara，中國）提取總RNA，按照PrimeScriptRT試劑盒（Takara，中國）說明書，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用熒光染料ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，中國）在RT-qPCR儀（stepone PLUS，Thermofisher，美國）進(jìn)行CDKi（p15Ink4b、p16Ink4a、p19Ink4d、p21和p27Kip1）和SASP［Cxcl10、Ccl2、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，Tnf-α）、白介素1α（interleukin-1α，Il-1α）、Il-1β、Il-6、基質(zhì)金屬蛋白酶3（matrix metalloproteinase 3，Mmp3）］的定量檢測。CT值歸一化為同一樣本的β-肌動(dòng)蛋白。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物Tab 1 Primersfor RT-qPCR

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以x±s形式表示。多組間比較采用單因素方差分析和Tukey事后檢驗(yàn)；2組間差異采用獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD模型構(gòu)建

造模后，6-OHDA組小鼠的毛色變灰，持續(xù)到術(shù)后第21日；小鼠體質(zhì)量逐漸下降，從第14日開始恢復(fù)。轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與Sham組相比，6-OHDA組小鼠在轉(zhuǎn)棒上的停留時(shí)間較短（P=0.000）（圖1A）。阿樸嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與Sham組相比，6-OHDA組小鼠總旋轉(zhuǎn)次數(shù)較多（P=0.000）（圖1B）。Western blotting結(jié)果顯示：6-OHDA組的CPu和SN區(qū)域TH蛋白表達(dá)量均顯著低于Sham組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.000）（圖1C、D）。以上結(jié)果表明造模成功。

圖1 6-OHDA誘導(dǎo)的小鼠PD模型評(píng)估Fig 1 Evaluation of 6-OHDA-induced PD model

2.2 細(xì)胞衰老的觀察

2.2.1 以p16Ink4a上調(diào)為特征的細(xì)胞衰老 術(shù)后第21日，免疫熒光染色結(jié)果（圖2）顯示：與Sham組比較，6-OHDA組中CPu和SN區(qū)域p16Ink4a陽性細(xì)胞明顯增多，Sham組無p16表達(dá)；2組CPu區(qū)和SN區(qū)均未發(fā)現(xiàn)明顯的p21陽性細(xì)胞；CPu和SN區(qū)域p16Ink4a陽性細(xì)胞與p21陽性細(xì)胞數(shù)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.000）。RT-qPCR檢測Sham組和6-OHDA組造模側(cè)CPu和SN區(qū)域CDKi，結(jié)果顯示，與Sham組相比：6-OHDA組造模側(cè)CPu和SN區(qū)域p16Ink4a、p15Ink4b和p19Ink4d的表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）；p21輕微上調(diào)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；p27Kip1輕微上調(diào)，但僅在SN區(qū)域的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.016）。

圖2 細(xì)胞衰老標(biāo)志物的檢測（n=5）Fig 2 Detection of cell senescence markers(n=5)

2.2.2 SASP的變化 RT-qPCR分析了8個(gè)最常見的SASP基因，結(jié)果顯示：與Sham組相比，6-OHDA組造模側(cè)CPu區(qū)域的Cxcl10、Ccl2、Tnf-α、Il-1α和Il-6顯著上調(diào)，Il-1β顯著下調(diào)（均P<0.05），SN區(qū)域的Ccl2、Tnf-α、Il-1α和Il-6顯著上調(diào)（均P<0.05），Mmp3和Il-1β均顯著下調(diào)（均P<0.05）（圖3）。

圖3 造模后第21日SASP表達(dá)水平的變化Fig 3 SASPlevels on day 21 post modelling

2.3 6-OHDA誘導(dǎo)的小鼠PD模型中膠質(zhì)細(xì)胞衰老變化

6-OHDA組造模側(cè)CPu區(qū)域含有多個(gè)與GFAP和p16Ink4a抗體均呈陽性免疫反應(yīng)的星型膠質(zhì)細(xì)胞，很少有共表達(dá)p16Ink4a和Olig2的少突膠質(zhì)細(xì)胞，基本不存在共表達(dá)p16Ink4a和Iba-1的小膠質(zhì)細(xì)胞；且星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量大于少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞（均P<0.05）。健側(cè)與造模側(cè)相比，3種衰老的膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量具有相似的趨勢，即星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量最多，小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量最少；但健側(cè)膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量較造模側(cè)少，兩側(cè)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.000）。健側(cè)和造模側(cè)的SN區(qū)域也觀察到GFAP和p16Ink4a陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞（圖4）。

圖4 CPu和SN區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞的衰老表型(n=5)Fig 4 Senescent phenotypeof glial cells in CPu and SN regions(n=5)

3 討論

細(xì)胞衰老會(huì)產(chǎn)生SASP［12］。SASP包含促炎癥細(xì)胞因子、趨化因子、生長調(diào)節(jié)劑、血管生成因子和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等［13］。SASP的組成和表達(dá)強(qiáng)度因衰老的持續(xù)時(shí)間、促衰老刺激的來源和細(xì)胞類型而有很大不同［14］。目前，PD動(dòng)物模型有多種，常見的包括1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）、6-OHDA、百草枯、魚藤酮等毒性模型及PD致病基因的單基因轉(zhuǎn)基因小鼠模型［8］。這些模型中是否都有衰老表型，衰老產(chǎn)生的SASP譜與PD患者有哪些差異，都值得進(jìn)一步研究。

有文獻(xiàn)報(bào)道，在PD患者的黑質(zhì)中，核苷酸結(jié)合寡聚化 結(jié) 構(gòu) 域 樣 受 體 蛋 白 3（nucleotide-binding oligomerization domain，leucine rich repeat and pyrin domain containing 3，NLRP3）上調(diào)幾乎僅定位到小膠質(zhì)細(xì)胞［15］，NLRP3炎癥小體可以促進(jìn)IL-1β、IL-18的成熟和分泌［16］，而IL-1β可以進(jìn)一步誘導(dǎo)促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，包括MMP。本研究中，可能是由于造模后第21日的小膠質(zhì)細(xì)胞呈靜息狀態(tài)，相應(yīng)的NLRP3小體水平較低，因此6-OHDA組SASP中的Mmp3和Il-1β呈下調(diào)趨勢。在以后的研究中可以擴(kuò)大SASP的檢測譜以探索相關(guān)分子機(jī)制。

神經(jīng)退行性疾病中，已經(jīng)被測定有衰老標(biāo)志物的細(xì)胞包括星型膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞［17］。星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性也是嚙齒動(dòng)物、非人類和人類靈長類動(dòng)物生理衰老的標(biāo)志［18］。阿爾茨海默?。ˋlzheimer′sdisease，AD）相關(guān)的研究中，也確定了AD模型小鼠中少突膠質(zhì)祖細(xì)胞的衰老表型［4］?？紤]到PD與AD在病理改變方面有很多相似之處［19］，我們認(rèn)為在PD模型小鼠中也應(yīng)研究膠質(zhì)細(xì)胞的衰老情況。本研究結(jié)果顯示，6-OHDA紋狀體注射PD模型小鼠中，衰老表現(xiàn)最明顯的是星形膠質(zhì)細(xì)胞。這也與文獻(xiàn)報(bào)道中，PD患者衰老標(biāo)志物陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞水平較高的結(jié)論相一致［20］。目前研究［21］表明，通過靶向去除衰老細(xì)胞的抗衰老藥物在治療神經(jīng)退行性疾病中很有潛力。因此，星形膠質(zhì)細(xì)胞可以作為抗衰老藥物在PD治療應(yīng)用中的靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，紋狀體注射6-OHDA造成的PD模型小鼠具有以p16Ink4a高表達(dá)和星形膠質(zhì)細(xì)胞衰老為特征的衰老表型，其產(chǎn)生機(jī)制及意義需要進(jìn)一步研究。

參·考·文·獻(xiàn)

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