二花臉豬linc-NORFA核心啟動子鑒定與轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析

杜星，曾強，劉祿，李琦琦，楊柳，潘增祥，李齊發(fā)

二花臉豬linc-核心啟動子鑒定與轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析

杜星，曾強，劉祿，李琦琦，楊柳，潘增祥，李齊發(fā)

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，南京 210095

【】前期研究證實linc-作為母豬繁殖性狀候選基因參與調(diào)控卵泡閉鎖與卵泡顆粒細胞凋亡過程，進一步鑒定二花臉豬linc-核心啟動子并分析其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，為解析linc-介導(dǎo)豬卵泡閉鎖的分子機制奠定理論基礎(chǔ)并提供新的研究思路。采集二花臉豬耳組織樣品并提取基因組DNA，利用PCR擴增和測序技術(shù)獲得二花臉豬linc-5′調(diào)控區(qū)序列；通過構(gòu)建缺失表達熒光報告載體并利用熒光素酶活性試驗鑒定二花臉豬linc-核心啟動子；利用生物信息學(xué)分析二花臉豬linc-核心啟動子區(qū)序列特征與潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點；構(gòu)建豬真核生物表達載體并進一步采用Western blot、qRT-PCR以及熒光素酶活性試驗分析轉(zhuǎn)錄因子FOXO1過表達對二花臉豬linc-轉(zhuǎn)錄的影響；利用染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)錄因子FOXO1與二花臉豬linc-核心啟動子區(qū)的結(jié)合能力。通過克隆測序與序列拼接共獲得二花臉豬linc-5′調(diào)控區(qū)序列1 734 bp，其中包含兩個潛在的CpG島；利用熒光素酶活性試驗證實linc-核心啟動子位于-988 — -684 bp（轉(zhuǎn)錄起始位點作為+1），生物信息學(xué)分析表明二花臉豬linc-核心啟動子上包含多個轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合元件，例如ESR2、FOXO1、E2F1、BRCA1以及NFIC等；另外，ChIP試驗還證實在豬卵巢顆粒細胞中FOXO1作為轉(zhuǎn)錄因子直接靶向結(jié)合在linc-的核心啟動子區(qū)；進一步通過試驗證實FOXO1過表達可顯著下調(diào)linc-核心啟動子區(qū)活性（＜0.01），同時顯著抑制體外培養(yǎng)的豬卵巢顆粒細胞中l(wèi)inc-的表達（＜0.01）。鑒定了二花臉豬linc-核心啟動子區(qū)，同時證實FOXO1作為轉(zhuǎn)錄因子能夠與linc-核心啟動子區(qū)特異性結(jié)合，進而抑制后者的轉(zhuǎn)錄活性與表達。研究結(jié)果對探究linc-在豬卵泡閉鎖過程中顯著下調(diào)的分子機制具有重要意義。

二花臉豬；卵巢顆粒細胞；Linc-；核心啟動子；轉(zhuǎn)錄調(diào)控

0 引言

【研究意義】卵泡的正常發(fā)育與排卵對于維持雌性哺乳動物繁殖過程至關(guān)重要[1]，而卵泡閉鎖作為雌性哺乳動物卵巢中一種普遍的生理現(xiàn)象，過度的卵泡閉鎖嚴重制約了雌性哺乳動物繁殖力的發(fā)揮[2]。因此，探究卵泡閉鎖的分子機制對于減少卵泡閉鎖、提高排卵率以及維持雌性哺乳動物正常的繁殖過程具有重大意義。本研究為鑒定linc-的核心啟動子區(qū)及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制提供理論基礎(chǔ)，同時對解析二花臉豬高繁殖力性狀的形成機制具有一定意義。【前人研究進展】長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度大于200 nt且缺乏開放閱讀框（open reading frame，ORF）或編碼蛋白能力的內(nèi)源性RNA分子[3-4]。前人研究通過生物信息學(xué)分析與高通量測序技術(shù)在哺乳動物體內(nèi)鑒定了數(shù)以千計的lncRNAs，然而僅有極少數(shù)lncRNAs經(jīng)過系統(tǒng)的研究并具有完備的功能注釋，絕大多數(shù)lncRNAs的生物學(xué)功能、作用機制及表達調(diào)控模式仍不清楚[5-6]?，F(xiàn)階段研究指出lncRNAs的表達豐度較低、進化保守性與穩(wěn)定性較差、且具有嚴格的組織特異性表達模式，這些特點也成為了研究lncRNAs過程中的難點[7]。近年來，相關(guān)研究表明lncRNAs廣泛參與調(diào)控生物體內(nèi)多種重要的生理與病理過程[8]，同時鑒定了若干與雌性哺乳動物繁殖過程相關(guān)的lncRNAs。例如，通過構(gòu)建基因敲除小鼠模型證實與對于雌性小鼠卵巢中黃體形成、附植準(zhǔn)備以及類固醇激素合成等生理過程起到至關(guān)重要的作用[9-10]；而在對多囊卵巢綜合征患者的研究中發(fā)現(xiàn)linc-能夠通過促進KIP1降解進而抑制卵巢顆粒細胞生長[11]；另外，Li等通過研究證實能夠通過抑制P21介導(dǎo)的ERK/MAPK信號通路促進人卵巢顆粒細胞增殖水平[12]。目前l(fā)ncRNAs對于雌性哺乳動物卵巢功能與繁殖過程的影響程度尚不清楚，并且其對豬等大型家畜卵巢發(fā)育與功能的調(diào)控還未見報道。【本研究切入點】筆者前期鑒定了一個與二花臉豬高繁殖力相關(guān)的基因間長鏈非編碼RNA（long intergenic non-coding RNA，lincRNA）即linc-。進一步分析發(fā)現(xiàn)二花臉豬卵巢顆粒細胞中l(wèi)inc-的表達水平顯著高于西方豬種（如大白豬），且在閉鎖卵泡中表達下調(diào)[13]，表明其表達水平與豬繁殖力和卵泡發(fā)育命運相關(guān)。但目前關(guān)于linc-的轉(zhuǎn)錄調(diào)控鮮有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以二花臉豬linc-為研究對象，通過多種分子生物學(xué)手段鑒定其核心啟動子區(qū)，并對其序列特征進行分析；預(yù)測其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，同時分析轉(zhuǎn)錄因子對二花臉豬linc-轉(zhuǎn)錄的影響。研究結(jié)果對揭示豬卵巢中l(wèi)inc-轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制、解析二花臉豬高繁殖力性狀的形成機制具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 二花臉母豬耳組織樣品來源于江蘇焦溪二花臉核心育種場。取耳組織樣品放置于液氮中長期保存，并用于后續(xù)提取二花臉豬基因組DNA；采集18月齡發(fā)情商品母豬雙側(cè)新鮮卵巢，置于37℃含有慶大霉素的生理鹽水中，并于2 h內(nèi)帶回實驗室，用于后續(xù)卵巢顆粒細胞的體外培養(yǎng)。

1.1.2 試驗試劑 2×Vazyme LAmp Master Mix、AceQ QPCR SYBR Green Master Mix（南京諾唯贊生物科技有限公司）。PrimeScriptTMRT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物工程公司）。Trizol、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司）。熒光素酶活性檢測試劑盒（Promega公司）2 kb DNA marker、Agarose粉末、10×TBE buffer、2.5 mol·L-1甘氨酸、5 mol·L-1氯化鈉和pMD19-T載體（南京擎科生物科技有限公司）。37%多聚甲醛（南京晚晴生物有限公司）。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素和PBS溶液（Gibico公司）。限制性內(nèi)切酶I與I、T4連接酶（賽默飛世爾科技有限公司）。RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。DEPC水、ECL化學(xué)發(fā)光液、Protein A+G beads與IgG抗體（Bioworld生物公司）。FOXO1一抗和蛋白酶抑制劑（CST公司）。GAPDH一抗、山羊抗兔二抗（上海生工生物有限公司）。氯仿、無水乙醇、異丙醇、異戊醇、氯化鈉、EDTA等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 試驗地點 本試驗于2020年2—6月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院分子數(shù)量遺傳學(xué)實驗室完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用氯仿-異戊醇法從二花臉豬耳樣品中抽提基因組DNA，通過1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的質(zhì)量與完整性（電壓130V，電泳25 min），同時使用NanoDrop 3000核酸定量系統(tǒng)對DNA濃度進行檢測。純化后的二花臉豬基因組DNA置于-20℃環(huán)境中保存并用于后續(xù)試驗。

1.2.2 引物設(shè)計與合成、PCR擴增與測序 根據(jù)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中豬linc-序列（MK879596.1）設(shè)計特異性引物擴增二花臉豬linc-5′調(diào)控區(qū)序列，引物由南京擎科生物科技有限公司合成，具體序列見表1。PCR擴增體系（50 μL）如下：上、下游引物各2.5 μL、二花臉豬基因組DNA 2.5 μL、2×Vazyme LAmp Master Mix酶25 μL、加雙蒸水至50 μL。PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸40 s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸5 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，切取目的條帶經(jīng)純化克隆入pMD19-T載體上，隨后經(jīng)轉(zhuǎn)化后挑取單克隆送至上海生工生物有限公司進行測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 采用Promoter 2.0 PredictionServer在線軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/）與BDGP數(shù)據(jù)庫（https://fruitfly.org/seq_tools/promoter. html）對二花臉豬linc-的潛在核心啟動子區(qū)進行初步預(yù)測。利用BioEdit v7.0軟件對二花臉豬linc-核心啟動子區(qū)堿基組成進行分析。進一步采用JASPAR在線公共數(shù)據(jù)庫（http://jaspar.genereg. net/）分析二花臉豬linc-基因核心啟動子區(qū)上潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，具體使用方法參考文獻[14]。利用EMBOSS Cpgplot與MethPrimer在線分析系統(tǒng)對二花臉豬linc-基因5′調(diào)控區(qū)上潛在的CpG島進行預(yù)測。

1.2.4 載體構(gòu)建與熒光素酶活性試驗 本研究采用雙酶切法進行載體構(gòu)建，具體過程如下：設(shè)計帶有酶切位點的特異性引物擴增不同長度的二花臉豬linc-5′調(diào)控區(qū)片段，引物信息詳見表1。利用限制性內(nèi)切酶I與I將純化后的擴增片段置于37℃金屬浴中進行酶切反應(yīng)1 h，隨后與帶有相同黏性末端的pGL3-Basic線性載體進行連接（16℃過夜），連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、挑取單克隆、測序最終獲得相應(yīng)的陽性重組質(zhì)粒。將無內(nèi)毒重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染進入體外培養(yǎng)的顆粒細胞24 h后，采用熒光素酶活性檢測試劑盒對每個樣品的螢火蟲熒光與海腎熒光進行檢測，具體操作詳見說明書，相對熒光活性為螢火蟲熒光與海腎熒光的比值。

1.2.5 豬卵巢顆粒細胞體外培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將新鮮采集的健康母豬卵巢用含有慶大霉素的生理鹽水和體積分數(shù)為75%的酒精溶液反復(fù)清洗數(shù)次。顆粒細胞的分離培養(yǎng)方法參考文獻[15]進行，簡述如下：利用無菌醫(yī)用注射器吸取有腔卵泡（直徑為3—5 mm）中的顆粒細胞，將分離的顆粒細胞利用PBS清洗兩次后均勻置于細胞培養(yǎng)板中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基的主要成分如下：DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、體積分數(shù)為15%胎牛血清以及體積分數(shù)為1%的青鏈霉素。細胞放置于37℃、5% CO2的濕度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。采用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑將本試驗構(gòu)建的重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染進入體外培養(yǎng)的顆粒細胞，具體操作詳見使用說明。

1.2.6 RNA提取與qRT-PCR檢測 采用TRIzol提取顆粒細胞總RNA，具體操作步驟按參考文獻[16]進行。純化后的RNA采用PrimeScriptTMRT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為：500 ng總RNA，反轉(zhuǎn)錄酶2 μL，加入去離子水至10 μL；反應(yīng)條件為：37℃反應(yīng)15 min，85℃反應(yīng)5 s，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20℃保存。根據(jù)豬linc-、（NM_214014.3）以及序列（NM_001206359.1）設(shè)計定量引物（表1），并采用qRT-PCR方法對上述3個基因表達水平進行檢測。qRT-PCR反應(yīng)體系如下：上、下游引物各0.2 μL，ROX II 0.2 μL，cDNA模板0.6 μL，AceQ QPCR SYBR Green Master Mix酶5 μL，加水至10 μL；反應(yīng)程序如下：預(yù)變性95℃ 5 min，循環(huán)反應(yīng)95℃ 10 s、60℃ 30 s、40個循環(huán)，溶解曲線95℃ 15 s、60℃ 60 s、95℃ 15 s。以作為內(nèi)參基因，使用2-??CT法計算目的基因的相對表達水平。

表1 本試驗所用引物

1.2.7 Western blot試驗 體外培養(yǎng)的顆粒細胞轉(zhuǎn)染48 h后, 使用RIPA裂解液提取并收集顆粒細胞中總蛋白，利用BCA法對蛋白濃度進行檢測。通過蛋白免疫印跡法（Western blot）對轉(zhuǎn)染FOXO1過表達載體后豬卵巢顆粒細胞中FOXO1的蛋白水平進行檢測，具體操作方法和步驟參見文獻[16]。本試驗中使用的抗體采用體積分數(shù)為0.25%的牛血清蛋白溶液進行稀釋（1﹕1000）。蛋白條帶在暗室中使用ECL化學(xué)發(fā)光液進行顯色并曝光，利用Image J對蛋白灰度值進行分析，以GAPDH蛋白表達水平作為標(biāo)準(zhǔn)進行內(nèi)部對照。

1.2.8 染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）試驗 將卵巢顆粒細胞體外培養(yǎng)于10 cm細胞培養(yǎng)皿48 h后, 在培養(yǎng)基中依次加入37%多聚甲醛135 μL、2.5 mol·L-1甘氨酸220 μL，并置于37℃水平搖床上110 r/min混搖10 min，促使蛋白質(zhì)與染色質(zhì)交聯(lián)。收集細胞并利用超聲波破碎儀將染色質(zhì)碎片化，超聲波破碎儀參數(shù)設(shè)置如下：40%輸出功率，30個循環(huán)，每個循環(huán)打開破碎5 s、關(guān)閉冷卻15 s。隨后，在該體系中依次添加蛋白酶抑制劑和預(yù)先配置好的Protein A+G beads與FOXO1一抗混合物，并置于4℃環(huán)境下混搖孵育過夜，充分調(diào)取FOXO1-DNA復(fù)合物。最后利用5 mol·L-1氯化鈉溶液反交聯(lián)與洗脫過程獲得卵巢顆粒細胞中FOXO1富集的DNA片段。在本試驗中IgG一抗添加組作為陰性對照組，而基因組DNA作為陽性對照組的底物。設(shè)計引物FBE-X（FOXO1 binding element-X）擴增不含有FOXO1結(jié)合位點的DNA片段用于檢驗FOXO1的非特異性結(jié)合情況。根據(jù)二花臉豬linc-核心啟動子區(qū)上FOXO1的結(jié)合位點位置信息設(shè)計檢測引物FBE-1，引物信息詳見表1。

1.3 統(tǒng)計分析

利用SPSS Statistics v20.0和GraphPad Prism v6軟件進行差異顯著性分析。試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）的形式表示，兩組不同處理間顯著性采用雙尾檢驗進行分析。*表示差異顯著（≤0.05），**表示差異極顯著（≤0.01）。

2 結(jié)果

2.1 二花臉豬linc-NORFA5′調(diào)控區(qū)擴增與克隆測序

設(shè)計3對特異性引物P1—P3（表1）擴增二花臉豬linc-5′調(diào)控區(qū)，均能在最適退火溫度下得到單一清晰、且符合預(yù)期大小的電泳條帶（圖1-A）。將目的條帶分別進行切膠回收、純化、克隆測序與序列拼接最終獲得二花臉豬linc-5′調(diào)控區(qū)序列，且序列長度為1 734 bp（圖1-B）。

2.2 二花臉豬linc-NORFA5′調(diào)控區(qū)序列分析

利用BioEdit v7.0生物信息學(xué)分析軟件對上述試驗獲得的二花臉豬linc-5′調(diào)控區(qū)序列核苷酸序列的堿基構(gòu)成進行分析，其中包含A堿基284個、T堿基317個、C堿基489個以及G堿基644個（圖2-A），AT堿基含量（34.7%）明顯低于CG含量（65.3%）（圖2-B）。隨后利用EMBOSS Cpgplot與MethPrimer在線分析系統(tǒng)并以CpG island size＞100、CG%＞50%以及Obs/Exp＞0.6為標(biāo)準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)二花臉豬linc-基因5′調(diào)控區(qū)上存在兩個潛在的CpG島，分別命名為Island 1（-1 327 — -1 021）與Island 2（-653— -547），且兩個CpG島的長度分別為307 bp與107 bp（圖2-C）。

2.3 二花臉豬linc-NORFA核心啟動子區(qū)鑒定

根據(jù)上述試驗獲得的二花臉豬linc-5′調(diào)控區(qū)序列與生物信息學(xué)分析結(jié)果，設(shè)計了5對特異性引物（表1）擴增不同片段長度的linc-5′調(diào)控區(qū)片段，并成功構(gòu)建相應(yīng)的缺失表達熒光報告載體（圖3-A）。隨后分別將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入體外培養(yǎng)的豬卵巢顆粒細胞中，熒光素酶活性試驗結(jié)果顯示pNORFA-1與pNORFA-2的熒光活性無顯著差異，pNORFA-3的熒光活性顯著高于pNORFA-2（＜0.01，圖3-B），表明二花臉豬linc-基因核心啟動子區(qū)位于-988 bp — -684 bp（轉(zhuǎn)錄起始位點作為+1）。

2.4 二花臉豬linc-NORFA核心啟動子區(qū)序列特征分析

通過序列分析發(fā)現(xiàn)二花臉豬linc-核心啟動子區(qū)由305個堿基組成，其中A堿基為38個（12.5%），T堿基為74個（24.3%），C堿基個數(shù)為72個（23.6%），G堿基個數(shù)為121個（39.6%），嘧啶堿基（GC）含量（63.2%）明顯高于嘌呤堿基（AT）含量（36.8%）且與linc-5′調(diào)控區(qū)核苷酸序列堿基構(gòu)成基本一致。進一步分析發(fā)現(xiàn)linc-核心啟動子區(qū)包含10個潛在的甲基化位點（CG位點），暗示其轉(zhuǎn)錄可能受到DNA甲基化的影響（圖4-A）。利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)二花臉豬linc-核心啟動子區(qū)上包含多個轉(zhuǎn)錄因子的潛在結(jié)合位點，例如ESR2、FOXO1、BRCA1、E2F1、KLF4和NFIC等。進一步通過生物信息學(xué)分析上述潛在轉(zhuǎn)錄因子與二花臉豬linc-核心啟動子區(qū)結(jié)合位點的定位、相似度以及評價得分，結(jié)果如圖4-B所示。

2.5 二花臉豬轉(zhuǎn)錄因子FOXO1真核表達載體構(gòu)建

通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子FOXO1與二花臉豬linc-啟動子區(qū)具有較高結(jié)合能力，同時FOXO1作為促凋亡因子在哺乳動物卵泡閉鎖過程中發(fā)揮重要功能[17]，因此我們選擇了轉(zhuǎn)錄因子FOXO1進行后續(xù)研究。首先將二花臉豬編碼區(qū)全序列擴增克隆進入真核生物表達載體pcDNA3.1上，并將該重組質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-（圖5-A）。隨后又將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-瞬時轉(zhuǎn)染進入體外培養(yǎng)的豬卵巢顆粒細胞中，qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示FOXO1過表達能夠顯著上調(diào)顆粒細胞中mRNA（圖5-B，＜0.01）與蛋白表達水平（圖5-C，＜0.01），表明二花臉豬轉(zhuǎn)錄因子FOXO1真核生物表達載體構(gòu)建成功。

2.6 轉(zhuǎn)錄因子FOXO1對豬卵泡顆粒細胞中l(wèi)inc- NORFA轉(zhuǎn)錄的影響

為了進一步探究轉(zhuǎn)錄因子FOXO1對二花臉豬linc-轉(zhuǎn)錄的影響，我們將上述構(gòu)建的豬真核生物表達載體pcDNA3.1-瞬時轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的豬卵巢顆粒細胞中。qRT-PCR結(jié)果顯示FOXO1過表達后顆粒細胞中l(wèi)inc-的表達水平顯著下調(diào)（圖6-A，＜0.01）。另外，通過熒光素酶活性試驗證實FOXO1過表達能夠顯著抑制linc-核心啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性（圖6-B，＜0.01）。隨后，通過ChIP試驗證實在豬卵巢顆粒細胞中，F(xiàn)OXO1作為轉(zhuǎn)錄因子能夠與linc-核心啟動子區(qū)特異性結(jié)合（圖6-C）。最后利用雙氧水誘導(dǎo)顆粒細胞氧化應(yīng)激模型證實氧化應(yīng)激能夠顯著誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的豬卵巢顆粒細胞中的表達（圖6-D，＜0.01），同時顯著抑制linc-的表達水平（圖6-E，＜0.05）。上述結(jié)果表明在豬卵巢顆粒細胞中，轉(zhuǎn)錄因子FOXO1能夠通過與linc-核心啟動子結(jié)合進而下調(diào)其轉(zhuǎn)錄活性并顯著抑制其表達。

（A）M：2 kb DNA marker；P1-P3：PCR擴增產(chǎn)物；（B）二花臉豬linc-NORFA基因5′調(diào)控區(qū)序列

（A）核苷酸組成；（B）核苷酸比例；（C）CpG島分析

（A）載體構(gòu)建示意圖；（B）熒光素酶活性試驗(A) Plasmids construction; (B) Luciferase activity assays

3 討論

雌性哺乳動物原始卵泡庫中卵泡數(shù)量巨大，但僅有極少數(shù)卵泡能夠最終發(fā)育成熟并排卵，絕大多數(shù)卵泡在發(fā)育的各個階段發(fā)生閉鎖并退化[18]?，F(xiàn)階段研究普遍認為卵巢顆粒細胞凋亡是引起卵泡閉鎖的主要誘因[19]，而卵巢顆粒細胞凋亡則受到一個由多種體內(nèi)外因素組成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的影響，包括類固醇激素[16]、應(yīng)激[20]、有毒物質(zhì)與藥品[21]、細胞因子[22]以及表觀遺傳學(xué)因子等，其中三類表觀遺傳學(xué)因子現(xiàn)已證實參與調(diào)控母豬等雌性哺乳動物卵巢顆粒細胞凋亡過程，即miRNAs（miR-425、miR-10b）[23-24]、circRNAs（circINHA）[25]以及l(fā)ncRNAs（linc-）[13]。并且，越來越多的證據(jù)表明lncRNAs在維持雌性哺乳動物卵泡正常發(fā)育與排卵過程中扮演著重要的角色，本研究團隊通過RNA-seq也證實卵泡閉鎖過程中卵巢顆粒細胞內(nèi)一系列l(wèi)ncRNAs發(fā)生差異表達，但目前關(guān)于lncRNAs的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制尚未完全明晰。在基因結(jié)構(gòu)上lncRNAs與mRNAs相似，均通過聚合酶II來介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄起始，且絕大多數(shù)lncRNAs也具有穩(wěn)定的啟動子并在轉(zhuǎn)錄后形成典型的5′帽子結(jié)構(gòu)（5′-capped）和多聚腺苷酸結(jié)構(gòu)（poly-A）[26-27]；進一步分析發(fā)現(xiàn)lncRNAs在基因組上轉(zhuǎn)錄區(qū)域的染色質(zhì)特征與mRNAs也極其相似，兩者的轉(zhuǎn)錄起始位點均具有高水平H3K4me3組蛋白甲基化修飾特征，而在轉(zhuǎn)錄區(qū)域內(nèi)均含有較高水平H3K36me3甲基化修飾標(biāo)記[28]；同時根據(jù)現(xiàn)有報道指出lncRNAs與mRNAs的轉(zhuǎn)錄均可受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[29]。本研究通過鑒定并分析二花臉豬linc-的核心啟動子發(fā)現(xiàn)多個潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，同時進一步證實轉(zhuǎn)錄因子FOXO1能夠通過下調(diào)二花臉豬linc-核心啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性進而抑制其表達。

（A）灰色底紋代表甲基化位點，下劃線標(biāo)注代表轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點；（B）潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點生物信息學(xué)分析

除此之外，我們在二花臉豬linc-核心啟動子區(qū)上還發(fā)現(xiàn)了多個與哺乳動物卵泡發(fā)育與顆粒細胞狀態(tài)和功能調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，例如ESR2、BRCA1、E2F1以及KLF4等。雌二醇（E2）主要由卵巢顆粒細胞合成與分泌，卵泡液中低水平E2是豬卵泡閉鎖的重要特征之一，同時雌二醇-雌激素受體系統(tǒng)（E2-ESR2）對于維持雌性生殖系統(tǒng)健康與功能至關(guān)重要[30-31]。通過對不同雌性哺乳動物進行研究發(fā)現(xiàn)E2能夠促進卵巢顆粒細胞增殖，同時抑制顆粒細胞凋亡，而E2缺乏或E2-ESR2系統(tǒng)功能喪失則會產(chǎn)生相反的結(jié)果[32-33]。近年來，通過高通量測序技術(shù)證實E2能夠誘導(dǎo)不同類型細胞中l(wèi)ncRNAs表達文庫發(fā)生劇烈變化[34-35]。而的表達上調(diào)與豬卵巢顆粒細胞氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細胞凋亡以及基因組的不穩(wěn)定性密切相關(guān)[36]；另外，KLF4過表達能夠顯著促進大鼠顆粒細胞凋亡，同時顯著抑制細胞增殖[37]，隨后相關(guān)試驗證實KLF4能夠促進氧化應(yīng)激介導(dǎo)的顆粒細胞凋亡過程[38]。根據(jù)上述研究成果與本研究結(jié)果我們提出如下假設(shè)，即豬卵泡閉鎖發(fā)生過程中伴隨著大量轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生顯著變化，而這些功能差異轉(zhuǎn)錄因子的動態(tài)變化進一步影響了它們與linc-核心啟動子區(qū)的結(jié)合，從而改變linc-的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式。上述猜想或可部分解釋二花臉豬linc-在卵泡閉鎖過程中顯著下調(diào)的分子機制，后續(xù)研究將著重探討轉(zhuǎn)錄因子的動態(tài)變化對豬卵泡閉鎖過程中l(wèi)inc-表達調(diào)控的影響。

（A）pcDNA3.1-FOXO1構(gòu)建示意圖 Diagram showing the construction of pcDNA3.1-FOXO1；

（A）過表達FOXO1對linc-NORFA表達水平的影響；（B）過表達FOXO1對linc-NORFA核心啟動子活性的影響；（C）通過ChIP試驗鑒定FOXO1與linc-NORFA核心啟動子的結(jié)合豐度；（D）雙氧水誘導(dǎo)氧化應(yīng)激對FOXO1表達水平的影響；（E）雙氧水誘導(dǎo)氧化應(yīng)激對linc-NORFA表達水平的影響

筆者前期研究證實在豬卵巢顆粒細胞中l(wèi)inc-能夠通過miR-126/TGFBR2軸上調(diào)TGF-β信號通路活性，進而抑制豬卵巢顆粒細胞凋亡過程[13]。結(jié)合本研究結(jié)果，可以猜想FOXO1可能通過linc-/miR-126/TGFBR2軸調(diào)控豬卵巢顆粒細胞中TGF-β信號通路活性以及顆粒細胞狀態(tài)?，F(xiàn)階段研究表明FOXO1與TGF-β信號通路互作廣泛存在于哺乳動物各個組織、器官以及細胞中，并且介導(dǎo)了多種重要細胞生理過程的發(fā)生。例如，TGF-β信號通路通過影響FOXO1的表達與活性從而調(diào)控肝糖異生[39]、腎纖維化[40]以及巨噬細胞極化[41]等過程；而FOXO1的異常表達則能夠影響TGF-β信號通路活性或成員表達，進而調(diào)控膠質(zhì)母細胞瘤增殖[42]、疤痕修復(fù)[43]以及軟骨分化[44]等過程。然而，在雌性哺乳動物卵巢發(fā)育與功能發(fā)揮過程中FOXO1與TGF-β信號通路互作的研究尚未見報道。綜合本研究結(jié)果，我們在豬卵巢顆粒細胞中發(fā)現(xiàn)FOXO1與TGF-β信號通路可能存在互作關(guān)系，且該互作可能由一個不同類型RNA分子組成的新調(diào)控軸介導(dǎo)，即linc-/miR-126/TGFBR2軸，并最終參與調(diào)控豬卵泡閉鎖與卵巢顆粒細胞凋亡過程。

4 結(jié)論

本研究通過生物信息學(xué)分析與多種分子生物學(xué)實驗技術(shù)鑒定了二花臉豬linc-的核心啟動子區(qū)（-988 — -684 bp），并在其核心啟動子區(qū)上發(fā)現(xiàn)多個與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的作用元件，包括甲基化位點與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點等；構(gòu)建豬真核生物表達載體并證實轉(zhuǎn)錄因子FOXO1通過與二花臉豬linc-核心啟動子區(qū)結(jié)合，進而顯著抑制后者在豬卵巢顆粒細胞中的表達。上述發(fā)現(xiàn)為解析二花臉豬linc-在豬卵泡閉鎖過程中顯著下調(diào)的分子機制提供了理論依據(jù)，同時為進一步揭示豬卵泡閉鎖的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)拓展了新的方向。

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Identification of the Core Promoter of Linc-and Its Transcriptional Regulation in Erhualian Pig

DU Xing, ZENG Qiang, LIU Lu, LI QiQi, YANG Liu, PAN ZengXiang, LI QiFa

College of Animal Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095

【】In our previous study, linc-has been proved as a candidate gene for sow fertility and participated in regulating follicular atresia and granulosa cell apoptosis. The aim of this study is to identify the core promoter of linc-and investigate its transcriptional regulation in Erhualian pig, so as to provide theoretical basis and new ideas for revealing the mechanism of linc-regulation to ovarian follicular atresia.【】Ear samples of Euhualian pig were collected for genomic DNA extraction. PCR amplification and clone sequencing were used to obtain the 5’-flanking sequence of Erhualian pig linc-gene. Reporter vectors construction and luciferase activity assays were performed to identify the core promoter of linc-gene, and bioinformatic methods were conducted to analyze the characterization of linc-core promoter and the potential binding elements of transcription factors (TFs). In addition, piggene eukaryotic expression vector was constructed and Western blot, qRT-PCR, and luciferase activity assays were performed to analyze the effects and regulatory mechanism of FOXO1 overexpression on the transcription of linc-gene. Besides, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay was performed to identify the interaction between FOXO1 and the core promoter of linc-in porcine granulosa cells (GCs).【】A total of 1 734 bp 5’-flanking sequence of Erhualian pig linc-was obtained by PCR amplification and clone sequencing technology, which contained two potential CpG islands. Luciferase activity assay was performed and demonstrated that the core promoter of Erhualian pig linc-was located at -988 — -684 bp (TSS as +1). Multiple potential binding elements of several transcription factors (TFs) were identified within the core promoter of linc-using bioinformatic analyses, including ESR2, FOXO1, E2F1, BRCA1 and NFIC. In addition, results from ChIP assay proved that FOXO1 directly binds to the core promoter of linc-by acting as a transcription factor. Furthermore, It was proved that overexpression of FOXO1 could significantly down-regulate the activity of linc-core promoter (＜0.01), and also notably inhibited the expression level of linc-in porcine GCs (＜0.01).【】In this study, the core promoter of Erhualian pig linc-was identified, and FOXO1 acts as a transcription factor was proved, which significantly inhibited linc-transcription in porcine GCs through binding and further down-regulating the activity of its core promoter. These findings were of great significance for investigating the molecular mechanism of down-regulation of linc-during follicular atresia.

Erhualian pig; ovarian granulosa cells; linc-; core promoter; transcription regulation

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.15.016

2020-06-18；

2020-12-22

江蘇省自然科學(xué)基金（BK20180524）、國家自然科學(xué)基金（31902130）、中國博士后科學(xué)基金（2018M632321）

杜星，E-mail：duxing@njau.edu.cn。通信作者李齊發(fā)，E-mail：liqifa@njau.edu.cn

（責(zé)任編輯 林鑒非）