基于RIL和CSSL群體定位大豆脂肪酸組分QTL

渠可心，韓露，謝建國，潘文婧，張澤鑫，辛大偉，劉春燕，陳慶山，齊照明

基于RIL和CSSL群體定位大豆脂肪酸組分QTL

渠可心，韓露，謝建國，潘文婧，張澤鑫，辛大偉，劉春燕，陳慶山，齊照明

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院大豆遺傳改良實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030

【】大豆（）原產(chǎn)于中國，高品質(zhì)的大豆在食品、飼料、紡織品等多種加工業(yè)中廣泛應(yīng)用，因此，選育高品質(zhì)大豆已成為育種者和生產(chǎn)者的聚焦問題。通過對(duì)大豆脂肪酸各組分進(jìn)行QTL定位及候選基因的篩選，為大豆品質(zhì)改良奠定分子基礎(chǔ)。以美國大豆品種Charleston和東農(nóng)594為親本構(gòu)建重組自交系（RILs）、以栽培大豆綏農(nóng)14與野生大豆ZYD00006為親本構(gòu)建染色體片段代換系（CSSLs）為試驗(yàn)材料。利用氣相色譜法測(cè)定2個(gè)群體的脂肪酸含量，根據(jù)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院大豆遺傳改良實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的遺傳圖譜，通過Windows QTL Cartographer 2.5和ICIMapping軟件對(duì)2017—2018年RIL群體與CSSL群體中的大豆脂肪酸組分進(jìn)行QTL定位研究，并對(duì)所獲得的QTL置信區(qū)間進(jìn)行候選基因的挖掘。2017—2018年，RIL群體和CSSL群體分別定位到34和20個(gè)與脂肪酸組分相關(guān)的QTL，分布在除B2、C1、G、H、J、M和O以外的13個(gè)連鎖群上。比較2個(gè)群體的QTL定位結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在2個(gè)群體中重復(fù)檢測(cè)到10對(duì)QTL，其中，分布在A1、C2、D1a、F、K和N連鎖群上的QTL與多種脂肪酸含量相關(guān)，在A1連鎖群上檢測(cè)到亞油酸和油分含量重疊的QTL；在C2連鎖群上檢測(cè)到硬脂酸和油分含量重疊的QTL；在D1a連鎖群上檢測(cè)到硬脂酸和油分含量重疊的QTL；在F連鎖群上檢測(cè)到棕櫚酸、硬脂酸和油分含量重疊的QTL；在K連鎖群上檢測(cè)到亞油酸和亞麻酸含量重疊的QTL；在N連鎖群上檢測(cè)到棕櫚酸和油分含量重疊的QTL、油酸和亞油酸含量重疊的QTL。對(duì)QTL定位獲得的所有置信區(qū)間進(jìn)行候選基因的挖掘，從基因注釋數(shù)據(jù)集中共篩選出485個(gè)候選基因，其中，271個(gè)候選基因具有GO注釋，進(jìn)一步進(jìn)行GO富集數(shù)據(jù)分析，共有15個(gè)候選基因與脂肪酸相關(guān)。主要通過編碼植物?；??；d體蛋白（ACP）硫酯酶、脂肪酸去飽和酶、磷脂酶D1、脂肪酸-羥化酶、丙酮酸激酶和參與?；o酶A生物合成、調(diào)節(jié)脂肪酸鏈的延伸，從而影響脂肪酸的合成。共檢測(cè)到54個(gè)與大豆脂肪酸各組分相關(guān)的QTL，在2個(gè)群體中重復(fù)檢測(cè)到10對(duì)QTL，對(duì)QTL定位獲得的置信區(qū)間進(jìn)行候選基因的篩選，共有15個(gè)候選基因與脂肪酸相關(guān)。這些穩(wěn)定的脂肪酸相關(guān)的QTL和脂肪酸相關(guān)的候選基因可用于大豆脂肪酸改良的分子標(biāo)記輔助選擇。

大豆；導(dǎo)入系；氣相色譜法；QTL定位；基因挖掘；富集分析

0 引言

【研究意義】大豆（）原產(chǎn)于中國，是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，占世界油籽產(chǎn)量的61%，蛋白質(zhì)食物消費(fèi)量的68%[1]。大豆是植物油的主要供給原料，油分含量占籽粒干重的18%—23%，主要包含5種重要脂肪酸組分：棕櫚酸（palmitic acid）、硬脂酸（stearic acid）、油酸（oleic acid）、亞油酸（linoleic acid）和亞麻酸（linolenic acid）。大豆已經(jīng)成為人們?nèi)粘Ｉ钪猩攀诚牟豢扇鄙俚氖称?，與國民糧食安全的可持續(xù)發(fā)展緊密相連[2-4]。目前，中國處于大豆進(jìn)口最多的國家，而且高品質(zhì)的大豆在食品、飼料、紡織品等多種加工工業(yè)中的需求量日益劇增，出現(xiàn)了較為明顯的供需矛盾，鑒于這一問題，選育高品質(zhì)大豆新品種已成為育種者和生產(chǎn)者的聚焦問題[5-6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】大豆脂肪酸中，亞油酸含量最高，油酸次之，亞麻酸、棕櫚酸、硬脂酸含量相對(duì)較低[7]，其中，油酸已被證明可以降低血液中的膽固醇含量[4]，亞油酸已被證明可以防止動(dòng)脈硬化的作用[8]，亞麻酸具有降血壓、健腦抗衰老等作用[9]。因此，在衡量大豆油品質(zhì)的優(yōu)劣中，脂肪酸各組分的比例是一個(gè)非常重要的指標(biāo)。大豆脂肪酸組分含量的檢測(cè)方法主要包括氣相色譜法（gas chromatography，GC）[10-11]、近紅外反射光譜分析法（near infrared reflectance spectrometry，NIRS）[12-13]和高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[14-15]，而氣相色譜法是應(yīng)用最為廣泛的[16]。氣相色譜法是色譜法中的一種，主要是利用混合物各物質(zhì)之間的沸點(diǎn)、極性及吸附性的差異性來實(shí)現(xiàn)分離，目前，現(xiàn)代分離分析主要應(yīng)用該技術(shù)[17]。大豆脂肪酸的5種組分是由多基因控制的數(shù)量性狀，容易受不同環(huán)境條件的影響[18]。國內(nèi)外研究學(xué)者鑒定影響大豆籽粒貯藏物含量的QTL位點(diǎn)，主要通過分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合區(qū)間作圖（interval mapping，IM）[19]、復(fù)合區(qū)間作圖（composite interval mapping，CIM）[20]、多區(qū)間作圖（multiple interval mapping，MIM）[21]和完備區(qū)間作圖（inclusive composite interval mapping，ICIM）[22]等常用的分析方法來進(jìn)行。QTL定位的實(shí)質(zhì)是分析分子標(biāo)記與目標(biāo)性狀之間的連鎖關(guān)系[23]，隨著分子生物技術(shù)的飛速發(fā)展，國內(nèi)外研究學(xué)者已開發(fā)出適應(yīng)各種情況的QTL定位方法，大大地解決了分子輔助育種過程中所遇到的難題，為分子輔助育種的高效快速發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)[24]。目前，國內(nèi)外的研究學(xué)者對(duì)大豆脂肪酸含量進(jìn)行了大量的QTL定位研究[25-26]。Li等[27]共定位到26個(gè)與脂肪酸含量相關(guān)的穩(wěn)定QTL；XIA等[28]對(duì)2個(gè)群體在不同環(huán)境下進(jìn)行大豆脂肪酸各組分的QTL定位分析，共定位到16個(gè)相關(guān)的QTL；FAN等[29]共定位到52個(gè)相關(guān)的QTL；盛英華等[30]對(duì)2個(gè)群體的脂肪酸含量進(jìn)行QTL定位分析，共定位到57個(gè)相關(guān)的QTL?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，雖然與大豆脂肪酸相關(guān)的QTL已被大量報(bào)道，但是可以在不同環(huán)境或不同遺傳背景中被重復(fù)檢測(cè)到的QTL較少[31]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究于2017年和2018年測(cè)定190份染色體段代換系（chromosome segment substitution lines，CSSLs）群體及親本和147份重組自交系（recombinant inbred lines，RILs）群體及親本的脂肪酸各組分含量，并對(duì)大豆脂肪酸各組分進(jìn)行QTL定位，以期獲得能在不同遺傳背景下被重復(fù)檢測(cè)到的脂肪酸QTL。對(duì)檢測(cè)到QTL的定位區(qū)段進(jìn)行候選基因的挖掘，并選擇與脂肪酸相關(guān)的基因，為后續(xù)與脂肪酸各組分相關(guān)基因的精細(xì)定位及基因功能的研究奠定基礎(chǔ)，并對(duì)大豆品質(zhì)改良方面具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院大豆遺傳改良實(shí)驗(yàn)室歷經(jīng)12年構(gòu)建，以栽培大豆綏農(nóng)14與野生大豆ZYD00006為親本，并以綏農(nóng)14為輪回親本，采用分子輔助選擇段構(gòu)建的一套全基因組染色體片段代換系（CSSLs）的190份材料。以美國半矮稈大豆品種Charleston（♂，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供）和高蛋白大豆品系東農(nóng)594（♀，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所提供）親本構(gòu)建的重組自交系（RILs）群體的147份材料。2017—2018年播種在具有適當(dāng)土壤含水量（15%—20%）的中國哈爾濱（45.75°N，126.53°E）的向陽農(nóng)場(chǎng)試驗(yàn)田，采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，行長5 m，株距5 cm，壟距60 cm，3次重復(fù)，田間管理遵循正常的生產(chǎn)實(shí)踐。

1.2 脂肪酸的測(cè)定方法

采用Agilent7890B氣相色譜儀測(cè)定大豆脂肪酸的5種組分，每份材料隨機(jī)選取3粒籽粒，于65℃烘箱中烘干（12—14 h），研磨成粉末，稱取5 mg左右樣品，置于儲(chǔ)存管中。在儲(chǔ)存管中分別加入1 mL 2.5%的濃硫酸甲醇溶液、5 μL BHT（2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚50 mg·mL-1，甲醇溶解）還原劑和50 μL的內(nèi)標(biāo)十七烷酸（10 mg·mL-1，乙酸乙酯溶解），混勻后85℃水浴1.5 h，冷卻至室溫，加入160 μL 9%的NaCl溶液和700 μL正己烷，渦旋、震蕩，4 000 r/min常溫離心10 min，吸取上清液400—500 μL于新儲(chǔ)存管中，置于通風(fēng)櫥中吹干、過夜。最后加400 μL乙酸乙酯并迅速用氣相色譜儀進(jìn)行脂肪酸的測(cè)定，每個(gè)樣品測(cè)定3次，取平均值作為該脂肪酸組分的含量。

Agilent7890B氣相色譜儀所用色譜柱型號(hào)為：30 m×320 μm×0.25 μm。載氣：氮?dú)?0 mL·min-1，氫氣60 mL·min-1，空氣450 mL·min-1。進(jìn)樣量：1 μL，分流進(jìn)樣方式，分流比為10﹕1；進(jìn)樣口溫度170℃。反應(yīng)程序?yàn)?80℃保持1 min，以25℃·min-1的速率上升至250℃保持7 min。

氣相色譜分析過程中，首先試樣在汽化室內(nèi)被汽化，然后被惰性氣體（即流動(dòng)相）帶入色譜柱，柱內(nèi)含有固定相，由于試樣中各組分之間的氣相和固定相之間的分子作用力不同，使得在色譜柱中各個(gè)組分的運(yùn)行速度不同，從而產(chǎn)生了不同的峰值，最后分析色譜圖中各種組分的峰值，計(jì)算出不同組分的相對(duì)含量[21]。

1.3 脂肪酸各組分含量計(jì)算

氣相色譜儀的峰圖是以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，從而繪制不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]。根據(jù)5種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間和峰面積進(jìn)行定性定量分析各個(gè)脂肪酸組分，以十七烷酸的峰值為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算5種脂肪酸的絕對(duì)含量（mg·g-1）和相對(duì)含量（%），油分含量為5種脂肪酸的總和。

相對(duì)量計(jì)算公式：。

1.4 脂肪酸含量表型及QTL分析

采用Microsoft Excel 2010軟件對(duì)2個(gè)群體親本和后代單株脂肪酸各組分進(jìn)行基本統(tǒng)計(jì)量分析，包括最小值、最大值、平均值、變異系數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差、變異幅度、偏度和峰度。采用SPSS軟件對(duì)脂肪酸各組分進(jìn)行相關(guān)性分析。

RIL群體的遺傳圖譜由QI等[32]構(gòu)建完成，圖譜總長度為2 655.68 cm，包括5 308個(gè)特異長度擴(kuò)增片段標(biāo)記，覆蓋20個(gè)連鎖群（linkage group，LGs），標(biāo)記間平均距離為0.5 cm。CSSL群體的遺傳圖譜由XIN等[33]構(gòu)建完成。使用Win-QTLCart2.5軟件通過CIM對(duì)RILs群體進(jìn)行QTL定位，使用1 000次排列檢驗(yàn)分析表型數(shù)據(jù)，并設(shè)置顯著性=0.05，取LOD=2.5為閾值判斷QTL的存在。采用ICIM Mapping軟件中ICIM對(duì)CSSLs群體進(jìn)行與脂肪酸相關(guān)的QTL定位分析，使用1 000次排列檢驗(yàn)分析表型數(shù)據(jù)，并設(shè)置顯著性=0.05。QTL命名基于前研究者的方法，簡(jiǎn)而言之，QTL名稱的構(gòu)造如下：+性狀名稱+連鎖群或連鎖群數(shù)+“-”+QTL數(shù)目[34]。

2 結(jié)果

2.1 2個(gè)群體的脂肪酸含量和油分總量分布情況

運(yùn)用氣象色譜儀對(duì)2017—2018年的RILs和CSSLs群體籽粒中的5種脂肪酸含量和油分總量進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算5種脂肪酸和油分含量的頻率分布，以分析大豆籽粒在不同年份、不同群體脂肪酸積累的特點(diǎn)。結(jié)果表明，2017—2018年2個(gè)群體的脂肪酸各組分都呈現(xiàn)連續(xù)正態(tài)分布（圖1和圖2），表明脂肪酸是以數(shù)量方式遺傳的，并適用于脂肪酸各組分含量的QTL定位。油分含量變化范圍為19.66%—24.26%，符合正態(tài)分布（圖3），適用于油分含量的QTL定位，此外，在后代中也觀察到明顯的超親分離現(xiàn)象[27]，表明父母雙方對(duì)脂肪酸組成都有貢獻(xiàn)。

X軸代表脂肪酸各組分所占總油分的百分比，Y軸代表每個(gè)脂肪酸各組分所占總油分百分比的株系數(shù)，黑色實(shí)線表示RILs群體的正常曲線。2018年RILs群體的5種脂肪酸含量頻率分布與2017年的結(jié)果相同，呈現(xiàn)連續(xù)正態(tài)分布，所以在這里僅展示了2017年的結(jié)果。下同The X-axis represents the percentage of each fatty acid component to the total oil content, the Y-axis represents the plant coefficient of the percentage of each fatty acid component in the total oil content, and the black solid line represents the normal curve of the RILs population. The frequency distribution of the five fatty acid content of the RILs population in 2018 is the same as the 2017 results, showing continuous normal distribution, so only the 2017 results are shown here. The same as below

黑色實(shí)線表示CSSLs群體的正常曲線

2.2 RILs和CSSLs群體脂肪酸含量表型分析

對(duì)2017—2018年2個(gè)群體親本及后代單株的脂肪酸各組分含量和油分總量進(jìn)行基本統(tǒng)計(jì)分析（表1）。2年的RILs、CSSLs群體母本的棕櫚酸、硬脂酸和油酸含量均低于父本，而亞油酸和亞麻酸含量均高于父本，RILs群體2個(gè)親本的油酸含量差異較大，而CSSLs群體2個(gè)親本的油酸、亞油酸含量差異較大。后代群體的5種脂肪酸含量中除硬脂酸的平均值比親本高，其余性狀的平均值均位于兩親本之間，并且具有雙向超親的現(xiàn)象。這5種脂肪酸在RILs和CSSLs 2個(gè)群體中均存在較大變異，變異系數(shù)為1.13%—6.99%，其中，亞油酸的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）最小，為1.76%—2.31%；硬脂酸的變異系數(shù)（CV）最大，為3.91%—6.99%，2017年RILs群體的變異系數(shù)達(dá)到6.99%；油酸的變異系數(shù)僅次于硬脂酸，表明硬脂酸和油酸在后代群體具有較大差異，提高其在大豆5種脂肪酸組分中所占的比例具有一定意義。同一群體中5種脂肪酸各組分最大值和最小值差異較明顯，說明在后代分離群體中的表現(xiàn)分離程度較大，且變異連續(xù)，是屬于多基因控制的數(shù)量性狀，受基因和環(huán)境的共同影響。

黑色箭頭代表RILs群體和CSSLs群體的父本Charleston和野生豆（ZYD00006）油分總量所在位置，紅色箭頭代表RILs群體和CSSLs群體的母本東農(nóng)594和綏農(nóng)14油分總量所在位置

對(duì)2017—2018年RILs和CSSLs群體的5種脂肪酸含量進(jìn)行相關(guān)性分析（表2和表3），表明2個(gè)群體中5種脂肪酸含量相關(guān)性的趨勢(shì)一致，其中，油酸與棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸和亞麻酸呈顯著負(fù)相關(guān)；棕櫚酸與硬脂酸、亞油酸和亞麻酸呈顯著正相關(guān)，亞油酸與亞麻酸呈顯著正相關(guān)。其中，油酸和亞油酸的相關(guān)系數(shù)最大，2018年RILs群體中達(dá)到-0.939，2017年CSSLS群體中達(dá)到-0.991，說明可以通過對(duì)油酸或亞油酸的選擇，從而達(dá)到對(duì)另一種成分的選擇。

2.3 大豆脂肪酸含量QTL定位

基于所構(gòu)建的大豆遺傳連鎖圖譜，采用Win-QTLCart2.5和ICIM Mapping軟件分別對(duì)RILs和CSSLs群體進(jìn)行QTL定位（表4和表5），2017—2018年的2個(gè)群體共定位到54個(gè)與脂肪酸組分相關(guān)的QTL，RILs和CSSLs群體分別定位到34和20個(gè)QTL，分布在除B2、C1、G、H、J、M和O以外的13個(gè)連鎖群上，其中，以N連鎖群上最多，有10個(gè)QTL；其次是A1連鎖群上，有8個(gè)QTL；而A2和L連鎖群上均只有1個(gè)。

檢測(cè)到與棕櫚酸相關(guān)的QTL共有12個(gè)，RILs群體檢測(cè)到10個(gè)QTL分別位于A1、C2、D1b、E、F和N等6個(gè)連鎖群上，貢獻(xiàn)率為6.47%—13.50%，LOD值為2.64—5.60。其中，被檢測(cè)到位于E連鎖群上，QTL效應(yīng)值較大，貢獻(xiàn)率為13.50%。CSSLs群體檢測(cè)到2個(gè)QTL都位于N連鎖群上，表型貢獻(xiàn)率為4.62和7.75，LOD值為2.86和6.87。

檢測(cè)到6個(gè)與硬脂酸相關(guān)的QTL，其中RILs群體有4個(gè)QTL，分布在D1b、D2、F和N等4個(gè)連鎖群上，貢獻(xiàn)率為6.90%—11.11%，LOD值為2.84—4.51。其中，被檢測(cè)到位于F連鎖群上，QTL效應(yīng)值較大，貢獻(xiàn)率為11.11%；CSSLs群體檢測(cè)到2個(gè)QTL分別位于C2和D1b連鎖群上，表型貢獻(xiàn)率為3.21和5.00，LOD值為1.78和2.95。

表1 2個(gè)群體親本和后代單株脂肪酸含量的基本統(tǒng)計(jì)

PA：棕櫚酸；SA：硬脂酸；OA：油酸；LA：亞油酸；LNA：亞麻酸。下同

PA: Palmitic acid; SA: Stearic acid; OA: Oleic acid; LA: Linoleic acid; LNA: Linolenic acid. The same as below

表2 RILs群體脂肪酸含量的相關(guān)分析

對(duì)角線下方為2017年RILs和CSSLs群體各脂肪酸之間的相關(guān)系數(shù)，上方為2018年RILs和CSSLs群體各脂肪酸之間的相關(guān)系數(shù)；**：表示在＜0.01水平上顯著相關(guān)。下同

Below the diagonal line is the correlation coefficient between the fatty acids in the RILs and CSSLs populations in 2017, and above is the correlation coefficient between the fatty acids in the RILs and CSSLs populations in 2018; **: indicates a significant correlation at the＜0.01 level. The same as below

表3 CSSLs群體脂肪酸含量的相關(guān)分析

表4 RIL群體脂肪酸含量QTL定位

表5 CSSL群體脂肪酸含量QTL定位

檢測(cè)到與油酸相關(guān)的QTL共有10個(gè)，其中RILs群體檢測(cè)到7個(gè)QTL分別位于A1、D1a、D2、和N等4個(gè)連鎖群上，貢獻(xiàn)率為5.64%—9.43%，LOD值為2.65—3.94；CSSLs群體檢測(cè)到3個(gè)QTL分別位于D2、E和F連鎖群上，表型貢獻(xiàn)率為4.49%、5.22%和8.80%，LOD值為2.75、3.98和9.60。

檢測(cè)到8個(gè)與亞油酸相關(guān)的QTL，其中RILs群體有6個(gè)QTL，分布在A1、I、K、L和N等5個(gè)連鎖群上，貢獻(xiàn)率為6.40%—8.34%，LOD值為2.54—3.26；CSSLs群體檢測(cè)到2個(gè)QTL都位于A1連鎖群上，表型貢獻(xiàn)率為22.09%和4.28%，LOD值為11.65和2.59。其中，被檢測(cè)到位于A1連鎖群上，QTL效應(yīng)值較大，貢獻(xiàn)率為22.09%。

檢測(cè)到11個(gè)與亞麻酸相關(guān)的QTL，其中RILs群體有5個(gè)QTL，分布在B1、I、K和N等4個(gè)連鎖群上，貢獻(xiàn)率為7.74%—13.49%，LOD值為3.20—5.46，其中被檢測(cè)到位于K連鎖群上，QTL效應(yīng)值較大，貢獻(xiàn)率為13.49%；CSSLs群體檢測(cè)到6個(gè)QTL分別位于A1、A2、E、F和K等5個(gè)連鎖群上，表型貢獻(xiàn)率為2.92%—5.86%，LOD值為2.31—5.51。

檢測(cè)到7個(gè)與油分相關(guān)的QTL，其中RILs群體有2個(gè)QTL，分布在D1b和F等2個(gè)連鎖群上，貢獻(xiàn)率為6.95%和10.04%，LOD值為2.67和3.79，其中被檢測(cè)到位于F連鎖群上，QTL效應(yīng)值較大，貢獻(xiàn)率為10.04%；CSSLs群體檢測(cè)到5個(gè)QTL分別位于A1、C2、D1a、F和N等5個(gè)連鎖群上，表型貢獻(xiàn)率為3.02%—8.14%，LOD值為1.84—3.67。

2.4 RIL和CSSL群體QTL分析結(jié)果比較

2017—2018年RIL和CSSL群體共定位到54個(gè)QTL，分布在13個(gè)連鎖群上，在同一群體中被重復(fù)檢測(cè)到的QTL有10對(duì)，分別位于A1、B1、C2、D1a、D2、F、K和N連鎖群上（表4、表5和圖4）。在RILs群體中重復(fù)檢測(cè)到的QTL有6對(duì)，其中，在A1 和D2連鎖群上有2對(duì)QTL，均連續(xù)2年被重復(fù)檢測(cè)到與油酸相關(guān)，說明這是2對(duì)是油酸相關(guān)的穩(wěn)定QTL；在B1連鎖群上的1對(duì)QTL同樣連續(xù)2年被重復(fù)檢測(cè)到與亞麻酸相關(guān)，分別解釋了7.74%和9.89%的貢獻(xiàn)率，說明該QTL是與亞麻酸相關(guān)的穩(wěn)定QTL；另外在F連鎖群上定位到的3個(gè)QTL，與棕櫚酸、硬脂酸和油分均相關(guān)，定位在同一區(qū)間內(nèi)，且位置相同，說明為棕櫚酸、硬脂酸和油分含量重疊的QTL，可能調(diào)控多種脂肪酸的合成；定位在連鎖群K上的1對(duì)QTL，檢測(cè)與亞油酸、亞麻酸相關(guān)，說明該QTL可能會(huì)調(diào)控多種脂肪酸的合成；定位在連鎖群N上的1對(duì)QTL，檢測(cè)為油酸和亞油酸含量重疊的QTL，說明該QTL可能會(huì)調(diào)控多種脂肪酸的合成。

：2017年RIL群體定位到的QTL；：2018年RIL群體定位到的QTL；：2017年CSSL群體定位到的QTL；：2018年CSSL群體定位到的QTL

在CSSLs群體中被重復(fù)檢測(cè)的有4對(duì)。定位在N連鎖群上的3個(gè)QTL，其中和連續(xù)2年被重復(fù)檢測(cè)到并與棕櫚酸相關(guān)，說明可能是棕櫚酸相關(guān)的穩(wěn)定QTL，同時(shí)又與油分相關(guān)的為同一個(gè)QTL，說明其為棕櫚酸和油分含量重疊的QTL，并且能夠調(diào)控多種脂肪酸的合成，值得關(guān)注；定位在C2連鎖群上的1對(duì)QTL和定位在D1a連鎖群上的1對(duì)QTL，均為硬脂酸和油分含量重疊的QTL，說明可能是調(diào)控多種脂肪酸合成的QTL；在A1連鎖群上有3個(gè)QTL，其中和連續(xù)2年被檢測(cè)到并與亞油酸相關(guān)，并且在2017年表型貢獻(xiàn)率達(dá)到了22.09%，說明可能是亞油酸相關(guān)的穩(wěn)定QTL，同時(shí)又與油分相關(guān)的為同一個(gè)QTL，說明其為亞油酸和油分含量重疊的QTL，可能是控制大豆脂肪酸含量的重要位點(diǎn)。

對(duì)不同群體定位到的脂肪酸組分的QTL進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，N連鎖群上檢測(cè)到的QTL最多，并且5種脂肪酸的QTL均被檢測(cè)到，說明可能較多的與脂肪酸相關(guān)的QTL定位在該連鎖群上。RILs群體的與CSSLs群體的被檢測(cè)定位在A1連鎖群上，且區(qū)間較近，可能為同一個(gè)QTL，可能是一個(gè)在不同群體中能夠穩(wěn)定遺傳的QTL，定位結(jié)果需進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.5 候選基因挖掘及富集分析

通過對(duì)RILs和CSSLs群體的5種脂肪酸和油分總量進(jìn)行的QTL定位，定位到54個(gè)QTL，對(duì)QTL定位所獲得的區(qū)間進(jìn)行候選基因的挖掘及GO富集數(shù)據(jù)分析。從基因注釋數(shù)據(jù)集[35]中發(fā)現(xiàn)有9個(gè)區(qū)間不含基因，共篩選出485個(gè)候選基因，對(duì)具有GO注釋的候選基因進(jìn)行進(jìn)一步的GO富集數(shù)據(jù)分析，如表6所示，有15個(gè)基因與大豆脂肪酸的形成直接或間接相關(guān)。這15個(gè)候選基因都在脂肪酸的合成或分解過程中發(fā)揮重要作用。其中候選基因與酰基輔酶a/?；D(zhuǎn)移酶有關(guān)，能夠調(diào)節(jié)脂肪酸鏈的延伸，影響脂肪酸的合成[36-37]；編碼植物?；?酰基載體蛋白（acyl carrier protein，ACP）硫酯酶，ACP的特異性決定了大多數(shù)植物組織中飽和脂肪酸的水平[36,38]，候選基因?qū)χ舅岬男纬煞浅Ｖ匾@兩個(gè)基因都與脂肪酸合成的調(diào)控有關(guān)。候選基因編碼磷脂酶D1，已被證實(shí)磷脂酶D在甘油磷脂的代謝中起重要作用[39]；候選基因與二羥基丙酮激酶/FAD還原酶有關(guān)，是甘油醛生產(chǎn)的重要介質(zhì)，與脂類的甘油代謝過程有關(guān)[40]，這兩個(gè)基因主要影響脂質(zhì)代謝，從而調(diào)節(jié)植物組織中的脂肪酸含量。候選基因、和都與乙醇乙?；D(zhuǎn)移酶有關(guān)，是脂肪酸合成途徑中的重要催化劑[41]。候選基因編碼一種脂肪酸-羥化酶，通過介導(dǎo)長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)化為ω-羥基脂肪酸，影響角質(zhì)、軟木脂和蠟的生物合成[42]。是丙酮酸激酶家族蛋白成員，丙酮酸激酶是糖酵解途徑中的一種限速酶，能夠催化磷酸烯醇式丙酮酸生成ATP和丙酮酸的相關(guān)反應(yīng)，而丙酮酸又是三羧酸循環(huán)的前體物質(zhì)，參與物質(zhì)代謝和氨基酸合成等多種生理生化反應(yīng)[43]，有研究發(fā)現(xiàn)，丙酮酸激酶有調(diào)節(jié)與控制光合作用的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為油脂的作用[44]、是催化光合產(chǎn)物生成油脂的關(guān)鍵酶[45]。另外編碼脂肪酸去飽和酶，而與酮酸脫羧酶有關(guān)，、、和4個(gè)候選基因都與脂肪酶/?；饷赣嘘P(guān)，這幾個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)在幾個(gè)方面影響脂肪酸含量。

3 討論

本研究進(jìn)行基因精細(xì)定位所利用的染色體片段代換系（CSSLs）群體，已成功應(yīng)用在包括水稻、玉米等作物中[46-48]。CIM和ICIM是QTL定位的重要方法，廣泛應(yīng)用于大豆性狀的QTL定位中，CIM能夠克服區(qū)間作圖法連鎖背景的影響；而ICIM能夠解決QTL算法上的缺陷，充分利用所有標(biāo)記，本研究同時(shí)運(yùn)用了這兩種QTL定位方法，以期能獲得較為準(zhǔn)確的QTL[19-21]。對(duì)2個(gè)群體的5脂肪酸的相關(guān)性分析結(jié)果：棕櫚酸與硬脂酸、亞油酸、亞麻酸呈顯著正相關(guān)，而油酸與其余4種組分均呈顯著負(fù)相關(guān)；與于福寬[49]研究結(jié)果相同，說明5種脂肪酸之間的相關(guān)性穩(wěn)定，可以在以后的大豆品質(zhì)改良研究中作為參考。

表6 基因注釋候選基因

本研究于2017—2018年在2個(gè)群體中共定位到54個(gè)QTL，與目前報(bào)道的脂肪酸相關(guān)的QTL結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)2個(gè)群體可能共有5個(gè)QTL區(qū)間與前人結(jié)果相近，其中，在D1a連鎖群上定位到的區(qū)間與盛英華等[30]相近，但表型解釋率較低，為6.95%；在D2連鎖群上定位到的區(qū)間與盛英華等[30]、朱明月[50]的定位結(jié)果相近，這個(gè)區(qū)間存在2個(gè)與油酸相關(guān)的QTL，其中的表型解釋率較高，為9.4%，可能是一個(gè)穩(wěn)定的QTL區(qū)間且與油酸相關(guān)；在E連鎖群上定位到的區(qū)間與DIERS等[51]的相同，且位置相近可能是同一個(gè)QTL，其中和的表型解釋率較高，分別為13.5%和9.4%，可能是一個(gè)穩(wěn)定的QTL，并且該區(qū)間與多種脂肪酸相關(guān)；在L連鎖群上定位的區(qū)間與HYTEN等[52]的相近，但表型解釋率較低，為7.26%；在I連鎖群上定位到的區(qū)間在FAN等[29]定位的區(qū)間內(nèi)，推測(cè)有多種脂肪酸相關(guān)的QTL分布在這一區(qū)間內(nèi)。本研究定位到的QTL從貢獻(xiàn)率上來說，大部分是一些微效的QTL，可能是由于雙親與后代群體的脂肪酸各組分和油分的變異系數(shù)較小，最大變異系數(shù)僅為6.99%（表1），微效基因較多與雙親和后代群體的表型差異較小有關(guān)。除了部分QTL與已有的定位結(jié)果相近，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了一些新的QTL區(qū)間，并且2個(gè)群體中共有10對(duì)QTL被多次重復(fù)檢測(cè)到，表現(xiàn)穩(wěn)定；同時(shí)還有部分的QTL區(qū)間存在重疊，并與多種脂肪酸組分相關(guān)，可能是由于一個(gè)基因可以影響生物多種性狀的表型，也可能是由于脂肪酸各組分QTL之間的緊密連鎖[30]；但能在2個(gè)群體重復(fù)檢測(cè)到的QTL較少，僅有1對(duì)?？傊?，本研究檢測(cè)到的部分QTL與前人定位的QTL區(qū)間一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究的可靠性；另一方面能在不同年份、不同群體中被重復(fù)檢測(cè)到的QTL區(qū)間和新發(fā)現(xiàn)的區(qū)間均是與大豆脂肪酸含量相關(guān)的重要區(qū)段，具有更高的利用價(jià)值。

進(jìn)一步對(duì)所定位到的這些區(qū)間進(jìn)行候選基因的挖掘及富集分析，一共有15個(gè)候選基因與脂肪酸相關(guān)，這些候選基因主要分布在第2、3、5、6和17染色體上，其中，基因被許多學(xué)者研究報(bào)道[36]，編碼植物?；??；d體蛋白（ACP）硫酯酶，說明該基因?qū)χ舅岬男纬煞浅Ｖ匾℅O：0006633）[36]；是丙酮酸激酶家族蛋白成員，其家族成員已在甘藍(lán)和擬南芥中被報(bào)道與脂肪酸代謝相關(guān)[53]；與酰基輔酶a/?；D(zhuǎn)移酶有關(guān)，輔酶A已經(jīng)被多次報(bào)道參與飽和脂肪酸的生物合成[36-37,53]。此外，本研究在其他QTL的置信區(qū)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)許多未知功能基因，可能存在與大豆脂肪酸相關(guān)的基因，有待進(jìn)一步探索。

4 結(jié)論

2017—2018年在RILs群體和CSSLs群體中分別定位到34和20個(gè)與脂肪酸含量相關(guān)的QTL。其中，有10對(duì)QTL在不同年份的2個(gè)群體中被重復(fù)檢測(cè)到，在RILs群體重復(fù)檢測(cè)到6對(duì)，在CSSLs群體中重復(fù)檢測(cè)到4對(duì)，并且與多種脂肪酸相關(guān)。檢測(cè)到15個(gè)候選基因與脂肪酸相關(guān)。

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Mapping QTL for Soybean Fatty Acid Composition Based on RIL and CSSL Population

QU KeXin, HAN Lu, XIE JianGuo, PAN WenJing, ZHANG ZeXin, XIN DaWei, LIU ChunYan, CHEN QingShan, QI ZhaoMing

Soybean Genetic Improvement Laboratory, College of Agriculture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030

【】Soybeans () originated from China. High-quality soybeans are widely used in various processing industries such as food, feeding, textiles, etc. Therefore, high-quality soybean breeding is a key point for soybean breeders and producers. This study conducted QTL mapping of each component of soybean fatty acid and screening of candidate genes, which would lay the molecular foundation for soybean quality improvement. 【】A recombinant inbred lines (RILs) population crossed by Charleston (American soybean varieties ) and Dongnong 594, and a chromosome segment substitution lines (CSSLs) population crossed by Suinong 14 (cultivated soybean) and ZYD00006 (wild soybean) were used for QTL mapping. We used gas chromatography to determine the fatty acid content of these two populations. As the genetic maps have been published by the soybean genetic improvement laboratory of the Agricultural College of Northeast Agricultural University before, QTL mapping of soybean fatty acid components in RIL and CSL populations were performed by the Windows QTL Cartographer 2.5 and ICIMapping software. And the candidate genes were screened from the QTL interval. 【】Based on 2017 to 2018 years data, 34 and 20 QTLs related to fatty acid components were mapped in the RIL population and the CSSL population, respectively. These QTLs distribute in 13 linkage groups except B2, C1, G, H, J, M, and O. QTL mapping of the two populations was compared that ten pairs of QTLs were detected in the two populations. We found that QTLs distributed in the A1, C2, D1a, F, K, and N linkage groups were related to the content of multiple fatty acids components. An overlapping QTL related to linoleic acid and oil content was detected on the A1 linkage group, QTL related to stearic acid and oil content on the C2, QTL related to stearic acid and oil content on the D1a, QTLs related to palmitic acid, stearic acid and oil content on the F, QTLs related to linoleic acid and linolenic acid content on the K, QTLs related to palmitic acid and oil content, and QTL related to oleic acid and linoleic acid content on the N. Candidate genes were screened out from QTL intervals. In total, 485 candidate genes were screened from the gene annotation data set and 271 of them annotated within GO annotations. GO enrichment analysis showed that 15 candidate genes involved in fatty acids pathway. These genes affect synthesis of fatty acids mainly through encoding plant acyl carrier protein (ACP) thioesterase, fatty acid desaturase, phospholipase D1, fatty acid-hydroxylase and pyruvate kinase, participating in the biosynthesis of acyl-CoA, and regulating the extension of fatty acid chain. 【】54 QTLs related to soybean fatty acid were detected, and 10 pairs QTLs were stable detected from the two mapping populations. We used the confidence intervals from QTL mapping to screen candidate genes, and 15 candidate genes related to fatty acids pathway were screened out. These stable QTLs and candidate genes can be used for molecular marker-assisted selection of soybean fatty acid improvement.

soybean; introduction line; gas chromatography; QTL mapping; gene mining; enrichment analysis

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.15.003

2021-02-03；

2021-03-22

國家自然科學(xué)基金（31701449）、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)青年人才骨干項(xiàng)目（18XG01）

渠可心，E-mail：18145648226@163.com。通信作者陳慶山，E-mail：qshchen@126.com。通信作者齊照明，E-mail：qizhaoming1860@126.com

（責(zé)任編輯 李莉）