類胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因AgCCD4調(diào)控芹菜不同組織的著色

王昊，尹蓮，劉潔霞，賈麗麗，丁旭，沈迪，馮凱，徐志勝，熊愛生

類胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因調(diào)控芹菜不同組織的著色

王昊，尹蓮，劉潔霞，賈麗麗，丁旭，沈迪，馮凱，徐志勝，熊愛生

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095

【】研究類胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因在不同顏色芹菜中的基因型及相對表達(dá)量，結(jié)合類胡蘿卜素含量測定，分析對芹菜組織中類胡蘿卜素積累的影響，為進(jìn)一步研究CCD亞家族基因在不同顏色芹菜組織著色中的作用奠定基礎(chǔ)。采用同源比對法檢索芹菜基因組中的CCD家族基因。從‘津南實(shí)芹’‘黃太極’‘紫桿一號’和‘賽雪’4種不同顏色芹菜中分別克隆獲得芹菜類胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因。對芹菜AgCCD4的蛋白氨基酸序列組成、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、親緣關(guān)系、空間結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析，預(yù)測其保守結(jié)構(gòu)域和二級結(jié)構(gòu)以及建立三級結(jié)構(gòu)模型。采用熒光定量PCR技術(shù)檢測在不同顏色芹菜不同組織中的表達(dá)水平。采用超高效液相色譜（UPLC）對4種顏色芹菜的葉片、葉柄和根中葉黃素和-胡蘿卜素的含量進(jìn)行測定。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)轉(zhuǎn)化法，研究AgCCD4蛋白在煙草表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。序列分析結(jié)果表明包含1個長度為1 779 bp的開放閱讀框（ORF），編碼592個氨基酸?！愌械暮塑账嵝蛄信c其他品種相比存在18個堿基和9個氨基酸位點(diǎn)的差異，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量分別為65.07 kD和65.12 kD，等電點(diǎn)分別為6.03和5.95。進(jìn)化樹分析表明，芹菜AgCCD4與菊科的向日葵和萵苣CCD4進(jìn)化關(guān)系較近。AgCCD4蛋白的二級結(jié)構(gòu)中包含多個-螺旋和無規(guī)則卷曲，三級結(jié)構(gòu)主要以-折疊為主。亞細(xì)胞定位分析表明AgCCD4是一個定位在葉綠體上的蛋白。對4種顏色芹菜葉片、葉柄和根中葉黃素和-胡蘿卜素的含量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示芹菜根中均未檢測到葉黃素和-胡蘿卜素，葉片中葉黃素和-胡蘿卜素含量均以‘津南實(shí)芹’最高，分別為1 102.58 μg?g-1DW和241.92 μg?g-1DW，‘紫桿一號’最低，分別為57.12 μg?g-1DW和45.65 μg?g-1DW。在葉柄中，僅在‘黃太極’中檢測到-胡蘿卜素，葉黃素也只在‘津南實(shí)芹’和‘黃太極’中被檢測到。熒光定量PCR結(jié)果顯示，在芹菜葉片中表達(dá)量最高，在根中最低?！蠗U一號’和‘賽雪’葉片中的相對表達(dá)量相似，都顯著高于‘津南實(shí)芹’和‘黃太極’。本研究從4種顏色芹菜中分別克隆得到，其中‘賽雪’的基因序列和其他品種存在差異，其蛋白均含有RPE65保守結(jié)構(gòu)域。表達(dá)量在芹菜不同組織中具有顯著差異。芹菜中表達(dá)量與類胡蘿卜素含量呈負(fù)相關(guān)。植物體中類胡蘿卜素的含量和種類影響植株的顏色變化，可能通過降解類胡蘿卜素來調(diào)控芹菜組織著色。

芹菜；類胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因；亞細(xì)胞定位；基因表達(dá)；類胡蘿卜素

0 引言

【研究意義】植物組織的顏色主要由植物體內(nèi)的色素種類和含量決定[1]。富含葉綠素的植物呈現(xiàn)綠色。黃酮類物質(zhì)如花青素，其顏色在植物細(xì)胞液呈酸性時偏紅色，呈堿性時偏藍(lán)色；花葵素在酸性條件下為橙色，中性條件下為無色，堿性條件下呈藍(lán)色。類胡蘿卜素是影響植物組織顏色形成的重要色素，不同種類類胡蘿卜素的積累可使植物呈現(xiàn)黃色、橙色和紅色等顏色。通過羥化酶途徑、雙加氧裂解途徑和氧化酶途徑可降低植物體內(nèi)類胡蘿卜素含量，從而導(dǎo)致植物組織的顏色發(fā)生變化[2]。類胡蘿卜素（carotenoids）是一類重要天然色素的總稱，在動物、高等植物、微生物中普遍存在。除抗氧化作用外，類胡蘿卜素還具有免疫調(diào)節(jié)、抗突變、抑制癌變、維護(hù)身體健康以及延緩細(xì)胞衰老等生理和藥理作用[3]。類胡蘿卜素經(jīng)類胡蘿卜素裂解雙加氧酶（carotenoid cleavage dixoygenases，CCDs）或非酶作用合成的阿樸類胡蘿卜素及其衍生物在植物中可以作為著色劑、植物激素、芳香物質(zhì)和信號物質(zhì)[4]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】CCD酶可以在特定位點(diǎn)裂解氧化類胡蘿卜素而形成多種脫輔基類胡蘿卜素[5]。擬南芥（）AtCCD1可將-阿樸-8'-胡蘿卜醛裂解產(chǎn)生-紫羅酮[6]；玉米（）ZmCCD1可將δ-胡蘿卜素裂解產(chǎn)生檸檬醛[7]。CCD家族可分為CCD和9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（nine- epoxycarotenoid dioxygenase，NCED）兩個亞家族[8]。NCED主要參與脫落酸的合成，其氧化裂解反應(yīng)是ABA合成的限速步驟[9]。CCD除了影響植物的花香和花色外，還參與獨(dú)腳金內(nèi)酯的合成。植物體內(nèi)CCD基因家族主要包括CCD1、CCD4、CCD7和CCD8[10]。CCD1蛋白的主要作用是催化類胡蘿卜素裂解生成香氣物質(zhì)[11]。CCD7和CCD8主要通過調(diào)控合成獨(dú)腳金內(nèi)酯來影響植物的生長發(fā)育[2]。CCD4可以分解C9-C10及C5-C6雙鍵[12]，通過裂解質(zhì)體中的類胡蘿卜素可以改變花瓣和果實(shí)的顏色，以及影響香氣物質(zhì)的合成[13]。如菊花（）的白色花瓣是由于的特異性表達(dá)形成的，抑制的表達(dá)量使白色花瓣變?yōu)辄S色[14]。Campbell等[15]在白色馬鈴薯（）成熟的塊莖中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)，利用RNAi技術(shù)下調(diào)的表達(dá)后，白色馬鈴薯塊莖和花瓣呈現(xiàn)黃色。此外，的高表達(dá)還可促進(jìn)植物發(fā)育，增強(qiáng)植株抗逆性，如轉(zhuǎn)入番紅花（）的擬南芥植株根系發(fā)育得到促進(jìn)，且對非生物脅迫的耐受性增強(qiáng)[16]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】CCD4在植物組織著色和生長發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，但在芹菜（）中的相關(guān)研究報(bào)道較少。且在不同顏色的芹菜品種中，的基因型還未得到鑒定，其表達(dá)量和類胡蘿卜素積累量之間的關(guān)系尚不清楚。在芹菜組織著色中的作用也未見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究分別以‘津南實(shí)芹’‘黃太極’‘紫桿一號’和‘賽雪’4種不同顏色的芹菜為材料，分別克隆獲得類胡蘿卜素裂解雙加酶基因，并對AgCCD4蛋白理化性質(zhì)、二級和三級結(jié)構(gòu)以及系統(tǒng)進(jìn)化等進(jìn)行分析。利用熒光定量PCR技術(shù)檢測在不同顏色芹菜不同組織中的表達(dá)，并對植株不同組織中葉黃素和-胡蘿卜素的含量進(jìn)行測定與分析。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2020年5月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)使用材料為‘津南實(shí)芹’‘黃太極’‘紫桿一號’和‘賽雪’，種質(zhì)資源保存于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室?！蚰蠈?shí)芹’由天津市津南區(qū)地方品種經(jīng)過多年提純選育而成，其顏色為綠色，纖維少，適應(yīng)性廣，耐寒耐熱；‘黃太極’為引進(jìn)國外資源新選育而成，屬早熟速生空心黃芹；‘紫桿一號’葉柄為紫色，能耐低溫弱光，商品性狀好；‘賽雪’為中晚熟品種，植株葉柄直立雪白，葉柄橫斷面實(shí)心（圖1）[17-18]。于2020年5月將其種子播種于穴盤中，每品種各15株，種植于人工氣候室。播種60 d后對不同品種芹菜的葉片、葉柄和根組織分別取樣，用錫紙包裹后立即放入液氮，于-80℃冰箱保存。不同品種的每個組織均取3個生物學(xué)重復(fù)。

大腸桿菌菌株DH5α、根癌農(nóng)桿菌GV3101和載體pCAMBIA1301由筆者實(shí)驗(yàn)室保存。DNA聚合酶、Prime Script RT reagent Kit試劑盒等均由大連TaKaRa公司生產(chǎn)；熒光定量PCR酶Hieff qPCR SYBR Green Master Mix采購于上海翊圣生物科技有限公司。葉黃素（純度≥90%）標(biāo)準(zhǔn)品購于上海源葉生物科技有限公司（上海，中國），-胡蘿卜素（純度≥95%）標(biāo)準(zhǔn)品購于和光純藥工業(yè)株式會社（大阪，日本）。

a：津南實(shí)芹；b：黃太極；c：紫桿一號；d：賽雪a: Jinnan Shiqin; b: Huangtaiji; c: Zigan NO.1; d: Saixue

1.2 AgCCD4的克隆

參照RNA Simple Total RNA Kit試劑盒（北京Tiangen）說明，分別提取‘津南實(shí)芹’‘黃太極’‘紫桿一號’和‘賽雪’芹菜樣品總RNA，檢測RNA濃度后按照Prime Script RT reagent Kit試劑盒說明，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

基于本課題組芹菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫和基因組數(shù)據(jù)庫檢索得到芹菜的基因序列[19-21]，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。正向序列為：5′-ATGGATGCTT TCTCATCTTCTT-3′；反向序列為：5′-TTATAGGTT GTTGAGTTCACT-3′。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括cDNA、正反向引物各1 μL，雙蒸水（ddH2O）7 μL和Prime STAR Max Premix（大連TaKaRa公司）10 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性10 s；98℃變性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，回收反應(yīng)產(chǎn)物連接至載體pCAMBIA 1301并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，過夜培養(yǎng)后挑取單菌落，搖混后送至安徽通用生物科技有限公司測序。

1.3 序列生物學(xué)分析

運(yùn)用BioXM 2.6軟件進(jìn)行核苷酸及氨基酸序列分析；利用DNAMAN 6.0軟件對芹菜與其他物種的CCD4進(jìn)行多序列比對；使用BLAST工具，獲得目的基因的保守域預(yù)測并進(jìn)行同源性分析；系統(tǒng)進(jìn)化樹通過MEGA 5.2軟件繪制而成；利用Prot Scale軟件分析蛋白的親疏水性；通過序列處理在線工具包（SMS）分析芹菜AgCCD4的相對分子質(zhì)量、氨基酸組成和理論等電點(diǎn)等理化性質(zhì)；利用NPS@在線網(wǎng)站（https:// npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和網(wǎng)站（http://www.cbs.dtu.dk/services/ CPHmodels/）分別預(yù)測芹菜AgCCD4的蛋白二級結(jié)構(gòu)以及建立三級結(jié)構(gòu)模型。利用Plant CARE在線分析網(wǎng)站對啟動子進(jìn)行順式作用元件分析。

1.4 AgCCD4的表達(dá)特性分析

采用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)熒光定量引物，正向引物為：5′-GGTGCGAATCCAGAGAAGGTTCC-3′，反向引物為：5′-TCACCACCGTATCTCCACCATCTT -3′。使用芹菜作為內(nèi)參基因[22]。采用實(shí)時熒光定量PCR分析該基因在不同顏色芹菜不同組織中的表達(dá)情況。反應(yīng)體系為20 μL，包括正、反引物各0.4 μL，SYBR Green I mix 10 μL，ddH2O 7.2 μL和cDNA 2 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火延伸30 s，共循環(huán)40次。使用Excel軟件，依據(jù)2-△△Ct方法[23]對的相對表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.5 芹菜組織中類胡蘿卜素的提取和含量的測定

參考李靜文[24]和Ma[25]等的方法，將芹菜葉片、葉柄和根組織經(jīng)液氮研磨后進(jìn)行冷凍抽干。稱取樣品，于避光環(huán)境下用丙酮提取類胡蘿卜素。提取液經(jīng)0.45 μm有機(jī)系濾頭過濾后定容，通過UPLC（超高效液相色譜儀）系統(tǒng)檢測類胡蘿卜素含量。UPLC檢測柱型：UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm；Waters，美國），檢測波長：450 nm，流動相為乙腈﹕甲醇=9﹕1，流速：0.25 mL·min-1，色譜柱溫：30℃。設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

1.6 AgCCD4的亞細(xì)胞定位

設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增片段，并將其克隆到pSPYE載體中，獲得AgCCD4-EGFP重組載體。通過電擊轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒AgCCD4-EGFP導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101中。將獲得的菌株在28℃培養(yǎng)過夜，4 000 r/min離心10 min收集菌株，使用緩沖液（10 mmol?L-1MES，10 mmol?L-1MgCl2，150 μmol?L-1乙酰丁香酮）洗滌并重懸，調(diào)節(jié)菌液OD600=0.8，將其用注射器滲入一月齡的煙草葉片中進(jìn)行瞬時表達(dá)。5 d后利用激光共聚焦掃描顯微鏡（Zeiss LSM 780，德國）觀察AgCCD4在煙草葉片細(xì)胞中的定位[26]。

1.7 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入整理和作圖，使用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性差異分析。

2 結(jié)果

2.1 芹菜AgCCD4的克隆與序列分析

從‘津南實(shí)芹’‘黃太極’‘紫桿一號’和‘賽雪’中分別克隆獲得，結(jié)果表明的開放閱讀框長度為1 779bp，編碼592個氨基酸。保守域預(yù)測結(jié)果表明（圖2-a），屬于RPE65亞家族，為一類包含CCD家族類胡蘿卜素裂解氧化酶特殊保守結(jié)構(gòu)域的亞家族[27]。將4個芹菜品種中的核苷酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明，‘津南實(shí)芹’‘黃太極’和‘紫桿一號’中的核苷酸序列（GenBank登錄號：MW271039）完全相同，而‘賽雪’中的核苷酸序列（GenBank登錄號：MW271040）與其他3個品種相比存在18個堿基位點(diǎn)的差異，導(dǎo)致其編碼的氨基酸序列與其他品種相比存在9個位點(diǎn)的差異。差異位點(diǎn)分別為第54位T/G（‘賽雪’/‘津南實(shí)芹’，下同），第62位T/C，第120位T/C，第214位T/C，第251位C/G，第291位A/T，第354位G/C，第385位G/A，第390位G/A，第495位T/G，第502位T/A，第507位T/C，第555位A/G，第618位G/A，第627位A/G，第639位C/A，第1500位C/G和第1560位A/G。氨基酸序列差異表現(xiàn)為第18位絲氨酸（Ser）/精氨酸（Arg），第21位亮氨酸（Leu）/脯氨酸（Pro），第57位異亮氨酸（Ile）/蘇氨酸（Thr），第72位絲氨酸（Ser）/脯氨酸（Pro），第84位蘇氨酸（Thr）/絲氨酸（Ser），第129位纈氨酸（Val）/異亮氨酸（Ile），第168位絲氨酸（Ser）/蘇氨酸（Thr），第507位丙氨酸（Ala）/甘氨酸（Gly）和第528位賴氨酸（Lys）/谷氨酸（Glu）。

2.2 芹菜與其他植物CCD4蛋白氨基酸序列的多重比對

利用DNAMAN 6.0軟件對芹菜及胡蘿卜（；XP_017227382.1）、哥倫比亞錦葵（；XP_021286209.1）、矮牽牛（；QBC36242.1）、煙草（；NP_001312446.1）、枸杞（；AIY62809.1）、黃連木（；XP_031272013.1）、甘薯（；AIZ09098.1）、辣椒（；PHU28865.1）、向日葵（；XP_021977754.1）、歐洲甜櫻桃（；XP_ 021809777.1）、銀白楊（；XP_034891069.1）、楊梅（；KAB1215613.1）、萵苣（；XP_023751666.1）、山杜鵑（；BBH75251.1）、克萊門柚（；XP_006437482.1）、蕪菁（；XP_009132578.1）、鹽芥（；XP_006414000.1）、蓖麻（；XP_002519944.1）的CCD4蛋白序列進(jìn)行比對（圖2-b），結(jié)果表明，以上植物的CCD4蛋白序列一致性為72.58%，表明CCD4蛋白序列在不同物種間具有高度保守性。

2.3 AgCCD4啟動子順式作用元件分析

除基本作用元件CAAT-box外，啟動子中還包含乙烯應(yīng)答元件ERE和赤霉素響應(yīng)元件F-box等激素響應(yīng)相關(guān)元件以及非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)元件（表1），如厭氧誘導(dǎo)必需順式作用元件ARE、參與防御和應(yīng)激反應(yīng)的順式作用元件TC-rich repeat、創(chuàng)傷誘導(dǎo)響應(yīng)元件WUN-motif（圖3）。此外，在啟動子中還發(fā)現(xiàn)了大量光響應(yīng)元件，包括TCT-motif、GT1-motif、Box 4和ACE，可見光誘導(dǎo)會影響啟動子的表達(dá)。

表1 AgCCD4啟動子區(qū)順式作用元件特性

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

為了進(jìn)一步探究CCD4蛋白的進(jìn)化關(guān)系，選取18個物種的CCD4氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行分析。結(jié)果表明，芹菜與菊科的向日葵和萵苣進(jìn)化關(guān)系較近，而與楊柳科的銀白楊和漆樹科的黃連木進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)（圖4）。

2.5 AgCCD4氨基酸的理化性質(zhì)和親/疏水性分析

‘賽雪’中AgCCD4的理論相對分子量為65.07 kD，理論等電點(diǎn)為6.03，‘津南實(shí)芹’‘黃太極’和‘紫桿一號’中AgCCD4的理論相對分子量為65.12 kD，理論等電點(diǎn)為5.95（表2）。芹菜和其他18種植物CCD4的氨基酸數(shù)目均在588—623，酸性氨基酸和堿性氨基酸的占比均約為12%。脂肪族氨基酸比例也在19%—21%，而芳香族氨基酸比例較低，約為9%。不同植物中CCD4蛋白的總平均疏水性均為負(fù)值，表明在不同物種內(nèi)編碼的氨基酸理化性質(zhì)相似。

利用Prot Scale 軟件獲得蛋白質(zhì)親疏水性圖（圖5），結(jié)果表明芹菜中AgCCD4蛋白為親水性蛋白，其中親水性最強(qiáng)的位置為第500位的天冬氨酸（Asp），疏水性最強(qiáng)的位置為第413位的纈氨酸（Val）。

2.6 芹菜AgCCD4蛋白二級與三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測及分析

‘賽雪’中AgCCD4蛋白二級結(jié)構(gòu)包括79個-螺旋（13.34%）、34個-折疊（5.74%）、128個延伸主鏈（21.62%）和351個無規(guī)則卷曲（59.29%）?！蚰蠈?shí)芹’‘黃太極’和‘紫桿一號’中AgCCD4蛋白二級結(jié)構(gòu)由88個-螺旋（14.86%）、26個-折疊（4.39%）、126個延伸主鏈（21.28%）和352個無規(guī)則卷曲（59.46%）組成。

圖5 ‘賽雪’和‘津南實(shí)芹’AgCCD4氨基酸序列親水性/疏水性分析

三級結(jié)構(gòu)模型（圖6）分析顯示，‘津南實(shí)芹’‘黃太極’‘紫桿一號’和‘賽雪’中AgCCD4蛋白的三級結(jié)構(gòu)中均包含2個-螺旋，而-折疊的數(shù)目有差異?！愌蠥gCCD4包含37個-折疊，而其他3個品種中AgCCD4蛋白-折疊的數(shù)量為36個。在含有高類胡蘿卜素的胡蘿卜中，CCD4蛋白包含38個-折疊、2個-螺旋。在類胡蘿卜素含量較低的香蕉（；AMS36849.1）中，CCD4包含40個-折疊和3個-螺旋。結(jié)合CCD4的保守結(jié)構(gòu)域分析，除香蕉CCD4蛋白中有一個-螺旋不在保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)外，其他物種中CCD4的-螺旋和-折疊都在保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)。不同物種間CCD4蛋白中-折疊的數(shù)量可能影響了蛋白的活性位點(diǎn)，導(dǎo)致對底物的裂解能力不同，進(jìn)而引起類胡蘿卜素含量的差異。

表2 芹菜與其他植物CCD4蛋白氨基酸組成成分及理化性質(zhì)分析

2.7 芹菜AgCCD4亞細(xì)胞定位

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)轉(zhuǎn)化方法，進(jìn)一步研究了綠色熒光蛋白（EGFP）標(biāo)記的AgCCD4蛋白在煙草葉片表皮細(xì)胞中的定位。在瞬時表達(dá)AgCCD4-EGFP融合蛋白的煙草葉片葉綠體中，檢測到明顯的GFP熒光，表明AgCCD4蛋白定位于葉綠體上（圖7）。

2.8 芹菜中葉黃素和β-胡蘿卜素的含量測定

通過UPLC分別測定4種顏色芹菜根、葉柄和葉片中的類胡蘿卜素含量，結(jié)果顯示芹菜中檢測到葉黃素和-胡蘿卜素兩種類胡蘿卜素（圖8）。在4種芹菜的根中均未檢測到葉黃素和-胡蘿卜素。葉片中均含有葉黃素，但含量有顯著差異?！蚰蠈?shí)芹’中葉黃素的含量最高，其次為‘賽雪’‘黃太極’和‘紫桿一號’，分別為1 102.58、690.58、450.16和57.12 μg?g-1DW。葉柄組織中只有‘津南實(shí)芹’和‘黃太極’檢測到葉黃素，二者中‘津南實(shí)芹’葉黃素含量顯著高于‘黃太極’，但都顯著低于同一品種葉片中葉黃素的積累量（圖8-A）。由-胡蘿卜素含量分析可知，只在‘津南實(shí)芹’的葉柄中檢測到241.92 μg?g-1DW的-胡蘿卜素，顯著低于葉片中-胡蘿卜素的含量。而在葉片組織中，‘津南實(shí)芹’-胡蘿卜素含量顯著高于其他3種芹菜，為504.37 μg?g-1DW，‘黃太極’和‘賽雪’中-胡蘿卜素含量無顯著差異，‘紫桿一號’中-胡蘿卜素含量最低，僅45.65 μg?g-1DW（圖8-B）。

圖6 芹菜（a, b）、胡蘿卜（c）和香蕉（d）CCD4蛋白三級結(jié)構(gòu)

a：GFP熒光；b：葉綠體；c：明場；d：疊加場 a: GFP flouorescence; b: Chloroplast; c: Bright field; d: Merged

2.9 芹菜AgCCD4在不同顏色芹菜中不同組織的表達(dá)分析

4種芹菜中，的相對表達(dá)量均在葉片中最高，葉柄次之，根中最低（圖9）。4種芹菜葉柄中的表達(dá)量均無顯著性差異。在根中，4種芹菜相對表達(dá)量雖也無顯著差異，但在‘津南實(shí)芹’中相對表達(dá)量最高，約為‘賽雪’的2.82倍。在4種芹菜葉片組織中的相對表達(dá)量差異最大，‘紫桿一號’和‘賽雪’2個品種中的表達(dá)量無顯著差異，但均顯著高于‘津南實(shí)芹’和‘黃太極’，為‘津南實(shí)芹’的1.72倍，‘黃太極’的1.43倍。‘黃太極’葉片中相對表達(dá)量也高于‘津南實(shí)芹’，約為其1.2倍。

a：葉黃素含量；b：β-胡蘿卜素含量；c：UPLC檢測的類胡蘿卜素含量色譜圖

圖9 AgCCD4在芹菜葉片、葉柄和根中的表達(dá)情況

3 討論

不同植物中CCD4蛋白編碼的氨基酸同源性較高，與其他物種的基因序列長度相似。不同物種中CCD4蛋白三級結(jié)構(gòu)都以-折疊為主，并且都位于基因的保守結(jié)構(gòu)域，只是數(shù)量存在差異?！蚰蠈?shí)芹’和‘賽雪’可能由于-折疊數(shù)量差異導(dǎo)致蛋白的活性位點(diǎn)不同，進(jìn)而影響了品種間CCD4蛋白的功能強(qiáng)弱。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)與芹菜AgCCD4親緣關(guān)系最近的不是同科植物，這與王贊[28]以及岳遠(yuǎn)征[29]的研究一致。

類胡蘿卜素作為主要的光合色素之一，在植物光收集和免受強(qiáng)光傷害等方面起著重要作用。因此，很多參與類胡蘿卜素代謝的關(guān)鍵酶都在葉綠體等質(zhì)體中發(fā)揮作用。編碼八氫番茄紅素脫氫酶的基因沉默時，葉綠體失去了這種酶的保護(hù)作用，導(dǎo)致葉綠素降解，出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象[30]。類胡蘿卜素裂解雙加氧酶作為類胡蘿卜素裂解途徑中的重要一員，其與葉綠體也有非常密切的聯(lián)系。小麥（）[31]和梔子（）[32]編碼的蛋白N-端均含有一個葉綠體定位的信號肽。在擬南芥突變體的葉綠體衰老過程中，類胡蘿卜素會在植物的質(zhì)體小球中積累[33]。研究表明CCD家族基因定位在細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)體上[34]，本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉片瞬時表達(dá)方法證明芹菜AgCCD4定位于葉綠體中。

高等植物的顏色主要受卟啉類、類黃酮類和類胡蘿卜素3類物質(zhì)影響[35]，園藝作物成熟常常伴隨著類胡蘿卜素的偏好性積累，類胡蘿卜素種類和含量與園藝植物中水果、蔬菜品質(zhì)和花卉觀賞價值密切相關(guān)[36]。植物色素形成具有復(fù)雜的分子機(jī)制，往往需要多個基因的調(diào)控，每個基因的改變都會導(dǎo)致色素含量改變，從而使植物顏色發(fā)生變化。辣椒被沉默時，植株葉綠素含量顯著下降，果實(shí)顏色由綠色變?yōu)榧t色[37]。蝴蝶蘭（）在矮牽?；ò甓说母弑磉_(dá)增加了二氫楊梅素和飛燕草素的含量，使花瓣顏色從粉紅色變?yōu)楦畹姆奂t色[38]。在煙草中過量表達(dá)激活了與花青素生物合成相關(guān)的內(nèi)源結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，提高了煙葉中花青素的濃度，葉片顏色由綠色變?yōu)樽霞t色[39]。CCD可以降低植物體內(nèi)類胡蘿卜素含量，從而影響植物顏色。桃子（）中差異表達(dá)，黃色突變體中類胡蘿卜素含量明顯高于對照[40]。根據(jù)在白色杜鵑花（）及其子代中的表達(dá)水平在所有發(fā)育階段均顯著高于黃色杜鵑花這一結(jié)果推斷，的高表達(dá)水平是導(dǎo)致子代類胡蘿卜素含量降低的主要因素[41]。芹菜依照葉柄顏色的不同，可分為紅芹菜、白芹菜、綠芹菜、黃芹菜和紫芹菜等[42]。本研究以‘津南實(shí)芹’‘黃太極’‘紫桿一號’和‘賽雪’為材料，通過測定分析類胡蘿卜素含量，發(fā)現(xiàn)4種芹菜中只在‘津南實(shí)芹’和‘黃太極’的葉柄中檢測到葉黃素，而在葉柄中-胡蘿卜素僅出現(xiàn)在‘津南實(shí)芹’中。‘賽雪’和‘紫桿一號’葉柄中沒有檢測到葉黃素和-胡蘿卜素，推測可能是被裂解氧化為其他物質(zhì)，導(dǎo)致葉柄變?yōu)榘咨?，但由于紫色芹菜中花青素的積累，所以呈現(xiàn)紫色[43-44]。‘黃太極’葉柄中只檢測到葉黃素，可以推測其葉柄顏色的形成受到葉黃素積累的影響?！蚰蠈?shí)芹’葉柄中不僅含有葉黃素，還有-胡蘿卜素，推測其顏色可能是由葉黃素和-胡蘿卜素共同作用形成。

CCD亞家族各成員作為類胡蘿卜素裂解氧化酶的重要一員，其編碼的酶在植物中參與香氣物質(zhì)的形成和色彩呈現(xiàn)，同時也參與特殊成分和植物激素的合成，對植物生長發(fā)育有重要的作用[4]。研究表明，CCD亞家族基因在植物不同組織和器官中的表達(dá)具有差異性，如藏紅花僅在柱頭中表達(dá)[45]，柑橘屬在葉中高表達(dá)，花、果肉、果皮中表達(dá)量低[46]。本研究結(jié)果顯示，4種芹菜在葉片中表達(dá)量都顯著高于葉柄和根，也呈現(xiàn)明顯的組織表達(dá)特異性。從蕓薹屬植物的花色[47]和桃的果肉顏色[48]調(diào)控中可以看出，CCD4與植物中的類胡蘿卜素積累密切相關(guān)，例如桂花（）中的表達(dá)量與類胡蘿卜素的積累呈負(fù)相關(guān)[49]。在本研究中，葉片類胡蘿卜素含量最高的是‘津南實(shí)芹’，其葉片是4種芹菜葉片中最綠的，并且葉脈也呈現(xiàn)綠色。類胡蘿卜素含量第二高的‘賽雪’，其葉片顏色是4種芹菜中最淺的，葉脈為白色。其次是葉片與綠芹相比明顯偏黃的‘黃太極’。類胡蘿卜素含量最低的是‘紫桿一號’，葉片顏色介于綠芹和黃芹之間，但其葉脈為紫色，越接近葉柄處顏色越深?！蚰蠈?shí)芹’中表達(dá)量最低，‘黃太極’次之，‘紫桿一號’和‘賽雪’的相對表達(dá)水平顯著高于其他兩種芹菜。可見相對表達(dá)量越高，其裂解的類胡蘿卜素就越多，植株體內(nèi)類胡蘿卜素積累量就越少。而‘賽雪’中葉黃素含量高于‘黃太極’和‘紫桿一號’，可能是因?yàn)槠涞幕蛐蛄胁町愒斐蓪Φ孜锶~黃素的降解能力下降。

類胡蘿卜素的重要性已經(jīng)引起人們的重視，對類胡蘿卜素降解途徑關(guān)鍵酶尤其是裂解雙加氧酶的研究也越來越多。在桂花[49]、石蒜（）[29]、萬壽菊（）[50]、番茄（）[51]和煙草[52]等植物中都已克隆出CCD亞家族基因，但在芹菜中的相關(guān)研究還比較匱乏。本研究對芹菜CCD亞家族關(guān)鍵基因進(jìn)行了深入的研究和分析，初步探討其在調(diào)控芹菜類胡蘿卜素代謝中的作用，將為進(jìn)一步研究CCD亞家族基因在參與不同芹菜組織色彩形成中的功能、調(diào)控機(jī)理提供借鑒和幫助。

4 結(jié)論

本研究從4種顏色芹菜中分別克隆獲得，其編碼的蛋白均含有RPE65保守結(jié)構(gòu)域，其中‘賽雪’的基因序列和其他品種存在差異。亞細(xì)胞定位顯示AgCCD4定位于葉綠體上。表達(dá)量在芹菜不同組織中具有顯著差異，在葉片中最高，根中最低。芹菜葉片中，‘紫桿一號’的表達(dá)量是‘津南實(shí)芹’的1.72倍，‘津南實(shí)芹’葉黃素和-胡蘿卜素含量分別是‘紫桿一號’的19.3和11.0倍?？梢姳磉_(dá)量和類胡蘿卜素含量呈負(fù)相關(guān)。植物體中類胡蘿卜素的含量和種類影響植株的顏色變化，推測可能通過降解類胡蘿卜素來調(diào)控植株著色，而基因序列的差異可能會影響對類胡蘿卜素降解的能力。

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The Carotenoid Cleavage Dioxygenases GeneRegulates the Pigmentation of Celery Tissues with Different Colors

WANG Hao, YIN Lian, LIU JieXia, JIA LiLi, Ding Xu, SHEN Di, FENG Kai, XU ZhiSheng, XIONG AiSheng

College of Horticulture, Nanjing Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement/Key Laboratory of Biology and Germplasm Enhancement of Horticultural Crops in East China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Nanjing 210095

【】The genotype and relative expression level of carotenoid cleavage dioxygenases genegene on carotenoids accumulation in celery tissues were preliminarily analyzed combined with the corresponding carotenoids level, which laid a foundation for further study on the roles of CCD subfamily genes in the pigmentation of different colored celery tissues. 【】The CCD family gene,, was obtained by homology search from genome of celery, and cloned from celery cvs. Jinnan Shiqin, Huangtaiji, Zigan NO.1, and Saixue, respectively. The composition of amino acids, physicochemical properties, genetic relationship, and spatial structure of proteins were analyzed by bioinformatics. The conservative domain and secondary structure were predicted and the tertiary structure model was established. Real-time quantitative PCR (RT-qPCR) was used to detect the expression levels of-carotene of leaf blades, petioles, and roots of celery were determined by ultra-performance liquid chromatography (UPLC). The subcellular localization of AgCCD4 protein in tobacco epidermal cells was performed by using-mediated transient expression system. 【】Sequence analysis results showed thatcontained an open reading frame (ORF) with the length of 1 779 bp, encoding 592 amino acids. A total of 18 nucleotides and 9 amino acids sites ofdiffered in the Saixue and other three celery varieties. The relative molecular weights of AgCCD4 from Saixue and other three celeries were 65.07 and 65.12 kD, and the theoreticalwere 6.03 and 5.95, respectively. Phylogenetic analysis demonstrated that the CCD4 in celery had the closest genetic relationship with sunflower and lettuce from Compositae family. The secondary structure of AgCCD4 contained multiple α helices and random coils, and the tertiary structure was mainly composed ofstrands. Lutein and-carotene were not detected in celery roots. The contents of lutein and-carotene in the leaf blades were the highest in Jinnan Shiqin (1 102.58 μg?g-1DW and 241.92 μg?g-1DW, resptectivey), whereas the lowest in Zigan NO.1 (57.12 μg?g-1DW and 45.65 μg?g-1DW, respectively). In petioles,-carotene was detected only in Huangtaiji, lutein only existed in Jinnan Shiqin and Huangtaiji. The expression level ofwas highest in celery leaf blades and lowest in roots, respectively. In leaf blades, the relative expression levels of【】In this study,gene was cloned from four celery varieties respectively, while the gene sequence of Saixue was different with other three varieties. AgCCD4 protein contained a RPE65 conserved domain. The expression ofwas remarkably varied in different celery tissues and was negatively correlated with the carotenoids content. The content and types of carotenoids affected the plants’ color, andmight regulate the pigmentation of celery tissues by degrading carotenoids.

; carotenoid cleavage dioxygenasesgene;subcellular localization; gene expression; carotenoids

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.15.012

2020-09-09；

2020-12-18

江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目（CX(18)2007）、江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（PAPD）

王昊，E-mail：2019104071@njau.edu.cn。通信作者熊愛生，E-mail：xiongaisheng@njau.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）