• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    甜瓜幼果果皮顏色基因GR的精細(xì)定位

    2021-08-20 01:36:08許昕陽(yáng)沈佳張躍建李國(guó)景牛曉偉壽偉松
    關(guān)鍵詞:幼果親本果皮

    許昕陽(yáng),沈佳,張躍建,李國(guó)景,牛曉偉,壽偉松

    甜瓜幼果果皮顏色基因的精細(xì)定位

    許昕陽(yáng),沈佳,張躍建,李國(guó)景,牛曉偉,壽偉松

    浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所,杭州 310021

    【】探究甜瓜幼果果皮顏色性狀的遺傳規(guī)律,精細(xì)定位目標(biāo)性狀基因,加深對(duì)甜瓜發(fā)育過(guò)程中果皮顏色轉(zhuǎn)變的認(rèn)知,為開(kāi)展甜瓜果皮顏色的分子設(shè)計(jì)育種奠定基礎(chǔ)。以幼果深綠皮的薄皮甜瓜純系‘MR-1’和幼果淺綠皮的厚皮甜瓜純系‘LGR’為親本,構(gòu)建F1正反交群體;以及利用F1與淺綠皮親本‘LGR’雜交構(gòu)建BC1F1回交群體,對(duì)甜瓜幼果果皮顏色基因()進(jìn)行遺傳分析。選取BC1F1群體中深綠皮和淺綠皮單株各20株,混池其DNA進(jìn)行BSA-seq以獲取初定位區(qū)間?;凇甅R-1’和‘LGR’兩親本的重測(cè)序數(shù)據(jù),開(kāi)發(fā)初定位區(qū)段內(nèi)特異性較好的分子標(biāo)記,鑒定篩選擴(kuò)大群體(BC1F1和F2)中的重組交換單株,驗(yàn)證和縮小定位區(qū)間,實(shí)現(xiàn)精細(xì)定位。將兩親本定位區(qū)段內(nèi)注釋基因的編碼區(qū)進(jìn)行測(cè)序以確定候選基因和關(guān)鍵變異位點(diǎn)。通過(guò)調(diào)查BC1F1回交群體中幼果果皮顏色和成熟果果皮顏色,利用相關(guān)性分析探究果皮顏色轉(zhuǎn)變?cè)谔鸸习l(fā)育過(guò)程中的內(nèi)在聯(lián)系。通過(guò)分析F1群體果皮顏色發(fā)現(xiàn)所有F1單株幼果都表現(xiàn)為深綠皮。另外,BC1F1群體單株幼果果皮顏色會(huì)發(fā)生分離,其中深綠皮單株數(shù)﹕淺綠皮單株數(shù)約等于1﹕1,以及F2群體中深綠皮植株與淺綠皮植株的分離比為3﹕1。這些分離比都符合孟德?tīng)栠z傳定律,表明幼果果皮顏色是受單個(gè)核基因控制的質(zhì)量性狀,并且深綠對(duì)淺綠為顯性。通過(guò)BSA-seq分析將基因初步定位于4號(hào)染色體長(zhǎng)臂,物理距離為1.8 Mb的范圍內(nèi)。利用開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記在擴(kuò)大的定位群體中共篩選到24個(gè)重組交換單株。經(jīng)過(guò)后代基因型和表型驗(yàn)證,最終將精細(xì)定位在標(biāo)記4-102和4-81之間約17.7 kb的范圍內(nèi),區(qū)段內(nèi)共包含4個(gè)注釋基因。經(jīng)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)一個(gè)編碼GLKs類轉(zhuǎn)錄因子CmAPRR2的基因在親本‘MR-1’和‘LGR’中存在多處變異,其中有3處發(fā)生了同義突變,1處錯(cuò)義突變和1處無(wú)義突變。無(wú)義突變出現(xiàn)在的編碼區(qū)第856位堿基處(由G變成T),導(dǎo)致親本‘LGR’中蛋白翻譯提前終止,其Myb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域大部分缺失,推測(cè)基因()即為影響甜瓜幼果果皮顏色的基因,而第856位的單堿基替換造成的無(wú)義突變即為關(guān)鍵變異位點(diǎn)。此外,BC1F1回交群體單株的表型調(diào)查結(jié)果顯示幼果與成熟果的果皮顏色之間存在顯著相關(guān)性。甜瓜幼果果皮顏色(深綠/淺綠)性狀為質(zhì)量性狀,受單個(gè)核基因控制。通過(guò)遺傳定位手段推斷()為最有可能影響甜瓜幼果果皮顏色的候選基因。

    甜瓜;幼果果皮顏色;基因定位;;()

    0 引言

    【研究意義】甜瓜(L.)是我國(guó)重要的園藝和經(jīng)濟(jì)作物。果皮顏色作為甜瓜最直觀的外觀品質(zhì)性狀,直接影響其商品價(jià)值和消費(fèi)者的選擇,開(kāi)展甜瓜果皮顏色性狀的遺傳研究對(duì)甜瓜育種有重要意義。【前人研究進(jìn)展】瓜類植物的果皮顏色調(diào)節(jié)開(kāi)始于果實(shí)發(fā)育的早期,在幼果期表現(xiàn)為綠色,反映的是葉綠素含量[1]。隨著果實(shí)發(fā)育的進(jìn)行,甜瓜外果皮顏色在成熟過(guò)程中會(huì)發(fā)生較大轉(zhuǎn)變[2]。成熟甜瓜果皮顏色豐富多樣,主要有白色、黃色、橙色、綠色以及多種顏色混雜或者斑紋類型。早期對(duì)甜瓜果皮顏色是由單基因或者多基因控制存在較大的爭(zhēng)議,但該爭(zhēng)議多基于不同品種間組合的差異[3-4]。KUBICKI[5]認(rèn)為幼果果皮白色對(duì)綠色為顯性,并且是受單基因遺傳控制。PEREIRA等[6]通過(guò)構(gòu)建‘Védrantais’和‘Piel de Sapo’的高密度GBS遺傳圖譜發(fā)現(xiàn)淺皮為顯性性狀,并且將該基因定位在7號(hào)染色體,該位置與相近,推測(cè)為同一個(gè)基因。BURGER等[7]利用兩個(gè)雜交群體:深皮‘Dulce’和淺皮‘TAM-Dew’,深綠‘Krymka’和淺綠‘Eshkolit Ha’Amaqim’探究甜瓜幼果果皮顏色遺傳模式時(shí)發(fā)現(xiàn)淺皮親本受隱性單基因控制,并且該基因與之前報(bào)道的淺皮顯性基因不等位。OREN等[8]利用‘Tam Dew’和‘Dulce’的重組自交系以及‘Dulce’和‘Noy Amid’的F3:4家系將一個(gè)影響甜瓜幼果果皮顏色的基因定位在4號(hào)染色體上290 kb的區(qū)段內(nèi),后通過(guò)差異性分析確定基因是影響該幼果果皮顏色的基因。在成熟果中,HUGHES[9]發(fā)現(xiàn)‘Honeydew’品種的白色相對(duì)于‘Smiths’ Perfect cantaloupe’品種的綠色為隱性。TADMOR等[1]在黃皮‘Noy Amid’和綠皮‘TVT’雜交的F2分離群體中發(fā)現(xiàn)柚皮素查爾酮含量的分離比符合孟德?tīng)?﹕1的遺傳定律,證實(shí)了該色素受單基因調(diào)控。FEDER等[10]進(jìn)一步利用該F2群體進(jìn)行了基因定位,并結(jié)合遺傳轉(zhuǎn)化鑒定出影響成熟果果皮顏色的基因。另外,利用‘Piel de Sapo’和‘PI 161375’的雜交組合,研究者們也鑒定了果皮顏色相關(guān)的QTLs[11-12]?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,許多甜瓜果皮顏色相關(guān)的QTLs和基因被分離和鑒定。但是,多數(shù)基因的精細(xì)定位仍存在定位區(qū)間較大、候選基因眾多等情況?!緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究構(gòu)建薄皮甜瓜兩個(gè)幼果果皮顏色差異的純系甜瓜‘MR-1’和厚皮甜瓜‘LGR’雜交組合,對(duì)其進(jìn)行表型觀察、群體構(gòu)建、遺傳模式分析、基因圖位克隆等,精細(xì)定位幼果果皮顏色基因,為深入揭示甜瓜幼果果皮顏色的形成機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    本研究所使用的材料‘MR-1’由國(guó)外引進(jìn),屬于薄皮甜瓜亞種泡瓜變種(var.),果實(shí)為近圓形;‘LGR’由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜所甜瓜研究室提供,屬于厚皮甜瓜亞種冬甜瓜變種(var.),果實(shí)為長(zhǎng)橢圓型(圖1),成熟果有網(wǎng)紋[13-14]。利用兩個(gè)材料雜交構(gòu)建了正反交F1群體、F1與‘LGR’回交BC1F1群體,主要用于遺傳分析;BC1F1和F2群體主要用于BSA-seq和遺傳定位。雜交和回交構(gòu)建于2017年春季,定位群體種植于2017年秋季、2018年春秋、2019年春秋以及2020年春季。所有材料均種植在浙江海寧甜瓜實(shí)驗(yàn)基地,采用常規(guī)大田生產(chǎn)管理。

    1.2 果皮顏色性狀調(diào)查

    兩親本甜瓜‘LGR’和‘MR-1’的幼果果皮顏色調(diào)查以花后10 d左右的果實(shí)為對(duì)象,利用目測(cè)對(duì)比顏色深淺,分別定為“淺綠色”和“深綠色”。遺傳分析和定位群體中單株的表型調(diào)查也以花后10 d左右的果實(shí)為對(duì)象,對(duì)照兩親本的幼果果皮顏色,經(jīng)3次不同時(shí)間(花后8、10和12 d)的目測(cè)定義表型。成熟果顏色調(diào)查和測(cè)色儀定量測(cè)定取自花后35 d左右的果實(shí)。利用美能達(dá)CR-400/410色彩色差計(jì)(Konica Minolta Camera Co., Ltd, Osaka, Japan)對(duì)果皮顏色定量,其中L*值代表亮度從黑(0)至白(100),a*值代表從紅(+a)至綠(-a),b*值代表從黃(+b)至藍(lán)(-b)。利用SPSS Statistics V21.0進(jìn)行相關(guān)性分析。

    1.3 BSA-seq分析

    從BC1F1群體中挑選深綠皮和淺綠皮植株各20株,利用CTAB法提取DNA。將20個(gè)深綠皮和20個(gè)淺綠皮單株DNA分別等量混合,形成兩個(gè)混池。2個(gè)混池和2個(gè)親本DNA按照樣品檢測(cè)、文庫(kù)構(gòu)建、質(zhì)量檢測(cè)以及上機(jī)測(cè)序等流程送由公司操作。參考基因組為甜瓜基因組Harukei3 genome reference ver1.41(http://melonet-db.dna.affrc.go.jp/ap/jbh)。

    1.4 分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)

    基于親本重測(cè)序信息,在初定位區(qū)段的雙側(cè)和內(nèi)部挑選有多態(tài)性的Indel標(biāo)記,利用凝膠電泳鑒定分子標(biāo)記的結(jié)合能力和特異性。后利用合適的引物對(duì)F2和BC1F1群體中的隱性單株個(gè)體進(jìn)行基因型鑒定,驗(yàn)證初步連鎖結(jié)果以及縮小定位區(qū)間。

    1.5 DNA提取、PCR擴(kuò)增與聚丙烯酰胺凝膠電泳

    取新鮮的甜瓜葉片于冷凍干燥機(jī)中放置1 d,采用CTAB法提取DNA:將葉片磨成粉末狀,加入600 μL預(yù)熱的CTAB提取液,搖勻,65℃水浴30 min;加入600 μL氯仿﹕異戊醇(24﹕1)抽提液,用力搖晃2 min后,12 000 r/min離心5 min;取上清液,加入360 μL(0.6倍體積上清液)-20℃預(yù)冷的異丙醇,-20℃中放置30 min;12 000 r/min離心5 min,棄上清液,加入700 μL 70%無(wú)水乙醇洗滌2次,晾干后溶于去離子水中,-20℃保存。

    PCR擴(kuò)增體系為10 μL,其中包括:2×buffer mix 5 μL,上下游引物各0.3 μL,DNA 2 μL,加去離子水2.4 μL。PCR反應(yīng)程序:98℃預(yù)變性2 min,然后擴(kuò)增33個(gè)循環(huán)(包括:94℃ 30 s;55℃ 30 s;72℃ 40 min),接著72℃ 5 min,4℃ 10 min。擴(kuò)增好的樣品于4℃保存。

    2 結(jié)果

    2.1 親本果皮顏色表型

    通過(guò)對(duì)花后10 d的果皮顏色觀察,發(fā)現(xiàn)薄皮甜瓜‘MR-1’幼果果皮表現(xiàn)為深綠色,花后35 d的成熟果果皮表現(xiàn)為亮黃色;而厚皮甜瓜‘LGR’幼果果皮表現(xiàn)為淺綠色,成熟果果皮表現(xiàn)為灰色有網(wǎng)紋(圖1)。

    2.2 幼果果皮顏色遺傳模式分析

    為探究幼果果皮顏色的遺傳規(guī)律,以‘MR-1’和‘LGR’為親本進(jìn)行正反交組配,所得F1代的幼果果皮顏色均與‘MR-1’表型相同,表明幼果果皮顏色受核基因控制,且深綠對(duì)淺綠為顯性(圖1)。F2群體植株的幼果果皮顏色發(fā)生分離,其中132個(gè)果實(shí)為深綠色果皮,44個(gè)果實(shí)為淺綠色果皮,符合3﹕1的孟德?tīng)栠z傳分離比,BC1F1代群體表現(xiàn)為1﹕1的分離比(表1)。這些結(jié)果表明幼果果皮顏色是受單基因控制的質(zhì)量性狀。因該基因主要控制果皮綠色的深淺,因此將其命名為()。

    圖1 親本以及正反交F1果皮顏色表型

    表1 幼果果皮顏色表型的遺傳學(xué)分析

    2.3 GR的初步定位

    為了分離和克隆,首先通過(guò)從BC1F1群體中挑選淺綠色和深綠色果皮植株各20株進(jìn)行DNA混池測(cè)序(BSA-seq)。參照兩親本的重測(cè)序信息,全基因組連鎖分析顯示4號(hào)染色體長(zhǎng)臂上存在一個(gè)目標(biāo)性狀區(qū)域(圖2)。該基因座的物理位置為203 744—1 974 725 bp,置信區(qū)間跨越1.8 Mb。

    圖2 GR的初定位(紅圈代表目的區(qū)段)

    2.4 GR的精細(xì)定位

    基于親本重測(cè)序得到的覆蓋了13條染色體,共1 320 497個(gè)多態(tài)性分子標(biāo)記,在4號(hào)染色體上開(kāi)發(fā)位于初定位區(qū)間兩側(cè)的標(biāo)記4-6和4-58,對(duì)BC1F1群體中的隱性單株(淺綠皮)進(jìn)行基因型鑒定。結(jié)果顯示淺綠皮單株與標(biāo)記4-6有十分明顯的共分離趨勢(shì)(圖3-A),證實(shí)了BSA初定位的結(jié)果。為了精細(xì)定位該基因,開(kāi)發(fā)了初定位結(jié)果內(nèi)特異性好的引物(圖3-B,表2),并對(duì)擴(kuò)大的BC1F1和F2群體共984株(BC1F1:877株,F(xiàn)2:107株)進(jìn)行基因型鑒定,結(jié)果共篩選出24個(gè)重組交換單株(圖4-B)。通過(guò)對(duì)重組交換單株進(jìn)行后代表型和基因型鑒定,最終將精細(xì)定位于標(biāo)記4-102和4-81之間,物理距離為17.7 kb(Chr04: 602468-620197)(圖4-A、B)。

    由于重組交換單株的缺乏,對(duì)17.7 kb區(qū)間內(nèi)包含的基因進(jìn)行序列比對(duì)分析。根據(jù)最新的甜瓜參考基因組的基因注釋發(fā)現(xiàn)該區(qū)間包含了4個(gè)基因:2個(gè)新注釋基因(和)、1個(gè)完整注釋基因()以及的一部分(圖4-C)。其中,編碼未知蛋白;預(yù)測(cè)編碼一個(gè)類生長(zhǎng)素蛋白;編碼一個(gè)雙組分反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白,該蛋白屬于Golden2-like類轉(zhuǎn)錄因子,故被命名為CmAPRR2;編碼一個(gè)煙草花葉病毒復(fù)制蛋白。通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)和等3個(gè)基因的編碼區(qū)序列在兩親本中存在差異(表3)。其中,僅存在由單堿基替換造成的錯(cuò)義變異,除了3處同義突變和1處錯(cuò)義突變,還存在1處單堿基替換造成的無(wú)義變異(表3)。通過(guò)對(duì)親本‘MR-1’和‘LGR’測(cè)序,證明‘LGR’中編碼區(qū)第856位堿基(G變?yōu)門)產(chǎn)生了終止密碼子,致使MELO3C003375蛋白翻譯提前終止,導(dǎo)致了Myb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域大部分缺失(圖5)。在黃瓜、番茄以及西瓜中,的同源基因、以及被報(bào)道參與葉綠素和類胡蘿卜素的合成以及質(zhì)體發(fā)育等過(guò)程[8,15-16]。由此推測(cè),()為控制甜瓜幼果果皮顏色的基因,而單堿基替換造成的無(wú)義突變?yōu)樵斐蓛捎H本幼果果皮顏色深淺的關(guān)鍵差異位點(diǎn)。

    A:隱性單株在分子標(biāo)記4-6的基因型。泳道1為‘MR-1’,2為‘LGR’,8、19、58為重組交換單株;B:引物多態(tài)性。上方標(biāo)記為引物名,每個(gè)引物左邊泳道為‘MR-1’,右邊為‘LGR’。M為DNA marker

    表2 定位所用引物序列

    A:GR初定位于4號(hào)染色體4-6和4-58標(biāo)記之間;B:利用984個(gè)單株精細(xì)定位GR于4-102和4-81標(biāo)記約17.7 kb范圍內(nèi)。標(biāo)記下面的數(shù)字代表交換單株數(shù);C:定位區(qū)間內(nèi)的候選基因

    2.5 幼果果皮顏色與成熟果皮顏色存在顯著相關(guān)性

    為探究甜瓜幼果果皮顏色與成熟果皮顏色之間的相關(guān)性,對(duì)BC1F1群體共153個(gè)單株的幼果進(jìn)行目測(cè),并對(duì)照親本將其劃分深綠(1)和淺綠(2)兩類。因成熟果果皮顏色變化差異較大,使用測(cè)色儀定量分析成熟果顏色變異(表4)。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析和相關(guān)性檢測(cè),發(fā)現(xiàn)幼果果皮顏色與成熟果皮顏色的亮度指標(biāo)和綠色強(qiáng)度指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)分別為0.849和0.857,呈極顯著相關(guān)。這說(shuō)明幼果果皮顏色與成熟果果皮顏色存在顯著相關(guān)性。

    表3 定位區(qū)段內(nèi)基因編碼區(qū)變異

    參考和比對(duì)分別代表‘MR-1’和‘LGR’中堿基和翻譯氨基酸REF and ALT represent the base and amino acid in ‘MR-1’ and ‘LGR’, respectively

    A:MELO3C003375的基因結(jié)構(gòu)。數(shù)字代表到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離。前面的堿基代表‘MR-1’中的堿基,后面代表‘LGR’中的堿基;B:引起LGR蛋白截短的變異位點(diǎn);C:‘MR-1’和‘LGR’中MELO3C003375的蛋白結(jié)構(gòu)域

    3 討論

    隨著甜瓜基因組研究的深入,功能基因組學(xué)取得了快速發(fā)展[17]。作為重要的農(nóng)藝性狀,果皮顏色的遺傳模式一直是研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。4號(hào)染色體長(zhǎng)臂被廣泛報(bào)道含有一個(gè)調(diào)控甜瓜果皮顏色的基因[8,18-20]。OREN等[8]利用3個(gè)親本‘Tam Dew’‘Dulce’和‘Noy Amid’將幼果果皮顏色基因定組位在4號(hào)染色體290 kb區(qū)段內(nèi);ZHAO等[18]利用全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)將果皮顏色基因定位于4號(hào)染色體500 kb的范圍內(nèi)。因該定位范圍內(nèi)含有一個(gè)編碼雙組分反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白CmAPRR2的基因,且該基因的同源基因曾在黃瓜、番茄和胡椒中被報(bào)道可調(diào)控果皮的葉綠素代謝和色素積累,因此()被前人認(rèn)定為候選基因[8,18]。有別于前人使用厚皮甜瓜進(jìn)行亞種內(nèi)組配,本研究利用厚皮與薄皮甜瓜開(kāi)展亞種間雜交;同時(shí),本研究的親本在果形、網(wǎng)紋以及成熟果果皮顏色等方面與前人選材存在較大差異,這不僅給該性狀的遺傳定位選材增添了新類型,也暗示了該基因功能在亞種間的保守性[8,13-14]。另外,本研究采用BSA-seq確定初定位區(qū)間、重測(cè)序開(kāi)發(fā)新標(biāo)記和圖位克隆縮小區(qū)段這一思路清晰且完整的研究方案,通過(guò)多代表型和基因型的驗(yàn)證,將精細(xì)定位在17.7 kb的區(qū)間內(nèi)。但重組交換單株的缺乏使該區(qū)間較難進(jìn)行進(jìn)一步的縮小。通過(guò)對(duì)區(qū)間內(nèi)注釋基因的測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)()在‘LGR’中存在1處無(wú)義變異,致使該轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游基因的重要結(jié)構(gòu)域(Myb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域)缺失,因此,()被認(rèn)為是最佳候選基因。相比以往報(bào)道,本研究極大地縮短了幼果果皮顏色性狀基因的定位區(qū)間,提高了()作為候選基因的可信度。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)‘MR-1’親本中第二個(gè)外顯子處的單堿基變異與已報(bào)道的材料都不相同,這也為甜瓜中的變異類型增添了新認(rèn)知。

    表4 BC1F1群體植株果皮顏色表型

    續(xù)表4 Continued table 4

    -a*/b*代表綠色的強(qiáng)度 -a*/b* represents the intensity of green color

    甜瓜果皮顏色豐富多樣,F(xiàn)ALLIK等[21]對(duì)不同成熟度的‘Galia’甜瓜進(jìn)行了果皮顏色變化調(diào)查并將其分成6個(gè)階段:(1)深綠色;(2)綠色;(3)淡黃色夾雜綠色;(4)淡黃色;(5)黃色;(6)深黃色至橙色。REID等[22]通過(guò)評(píng)估‘Crenshaw’‘Persian’和‘PMR45’3個(gè)甜瓜品種發(fā)現(xiàn)果實(shí)的成熟會(huì)伴隨著葉綠素含量的下降和類胡蘿卜素的上升。而FLüGEL和GROSS[23]在‘Galia’甜瓜中觀察到類胡蘿卜素含量在發(fā)育期間并沒(méi)有變化,外果皮變黃主要是因?yàn)樵诔墒爝^(guò)程中葉綠素的降解增加。因此,果皮顏色變化被認(rèn)為主要由葉綠素和類胡蘿卜素(主要是-胡蘿卜素)引起[24]。在本研究中,()作為調(diào)控甜瓜幼果果皮顏色的基因,其是否參與了單一色素或者組合色素的合成或者分解過(guò)程?在黃瓜中,被發(fā)現(xiàn)影響質(zhì)體發(fā)育和葉綠素的合成[15]。PAN等[16]發(fā)現(xiàn)番茄和辣椒果實(shí)中過(guò)表達(dá)APRR類轉(zhuǎn)錄因子會(huì)增加幼果的葉綠素和成熟果的類胡蘿卜素。OREN等[8]發(fā)現(xiàn)的表達(dá)與-類胡蘿卜素的含量存在緊密的相關(guān)性。另外,與APRR2相關(guān)的GLK2轉(zhuǎn)錄因子也曾被報(bào)道影響質(zhì)體的發(fā)育以及調(diào)節(jié)植物的葉綠素和類胡蘿卜素的含量[25-27]。這些報(bào)道都為下一步比較分析親本色素含量提供了依據(jù)和方向。

    作為雙組分反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(ARR)的一類,APRR2屬于B型響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白,該類型的蛋白被廣泛報(bào)道參與細(xì)胞分裂素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[28]。在的三突變體中,ARGYROS等[29]發(fā)現(xiàn)葉綠素的含量顯著減少并且大部分的細(xì)胞分裂素調(diào)節(jié)基因顯著下調(diào)。在擬南芥中,CHOI等[30]發(fā)現(xiàn)ARR2可通過(guò)Myb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與TGA3互作,進(jìn)而通過(guò)結(jié)合植物防御相關(guān)基因啟動(dòng)子的ACGTCATAGA基序來(lái)調(diào)控的表達(dá)。這些展現(xiàn)了ARRs類轉(zhuǎn)錄因子對(duì)下游基因的調(diào)控作用以及Myb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)RRs類轉(zhuǎn)錄因子功能的重要影響。在本研究中,‘LGR’與‘MR-1’的()共有5處SNP差異,其中僅有無(wú)義突變?cè)诘鞍坠δ芙Y(jié)構(gòu)域中發(fā)生,造成‘LGR’中MELO3C003375(CmAPRR2)的Myb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域大部分缺失。類似地,OREN等[8]在甜瓜‘Tam Dew’中也發(fā)現(xiàn)了相同的無(wú)義突變,并且通過(guò)等位性測(cè)驗(yàn)證實(shí)了該變異是造成‘Tam Dew’幼果淺色的原因?;贛yb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的功能特點(diǎn),猜測(cè)該無(wú)義突變會(huì)導(dǎo)致MELO3C003375(CmAPRR2)蛋白無(wú)法識(shí)別和結(jié)合下游基因,進(jìn)而無(wú)法調(diào)控色素代謝,以致產(chǎn)生淺綠色果皮。對(duì)于APRR2或者ARRs類轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控色素相關(guān)基因的方式(直接或者有其他基因介導(dǎo)),暫時(shí)未有相關(guān)深入的研究。鑒于擬南芥中轉(zhuǎn)座酶類的轉(zhuǎn)錄因子FHY3和FAR1,以及ABRE類轉(zhuǎn)錄因子ABF2、ABF3和ABF4常通過(guò)直接調(diào)節(jié)葉綠素代謝途徑中的結(jié)構(gòu)基因來(lái)影響葉綠素水平[31-32],推測(cè)()通過(guò)直接調(diào)控色素代謝途徑中的結(jié)構(gòu)基因來(lái)影響幼果果皮顏色,而缺失了Myb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的MELO3C003375(CmAPRR2)則極有可能因?yàn)闊o(wú)法直接識(shí)別與結(jié)合結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子,進(jìn)而無(wú)法調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因表達(dá),造成‘LGR’無(wú)法積累色素,產(chǎn)生淺綠色幼果。

    作為對(duì)消費(fèi)者有吸引力的性狀,果皮顏色一直是甜瓜育種的重要目標(biāo)。相較于成熟果,幼嫩果實(shí)顏色相對(duì)單一,主要由葉綠素影響。但成熟果與幼嫩果實(shí)之間是否存在關(guān)聯(lián)性,研究卻很少涉及。本研究中,兩親本幼嫩果果皮顏色差異明顯,定位群體(BC1F1)單株表型也分離顯著,隨著發(fā)育進(jìn)程,親本以及單株果皮顏色發(fā)生變化,但有趣的是,淺綠皮植株和深綠皮成熟果果皮顏色的綠色強(qiáng)度卻形成了顯著的差異分化,這表明即使果實(shí)在發(fā)育過(guò)程中會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)變,但成熟果果皮顏色仍然與幼嫩果果皮顏色存在緊密的相關(guān)性,該結(jié)論為未來(lái)進(jìn)行甜瓜外觀品質(zhì)育種提供了思路。另外,本研究發(fā)現(xiàn)在BC1F1群體幼果為深綠皮的植株中,部分單株的成熟果會(huì)表現(xiàn)出黃色,而部分單株仍然表現(xiàn)為深綠色。這表明雖然成熟果顏色與幼果顏色有顯著相關(guān)性,但兩者之間的內(nèi)在聯(lián)系以及它們與果實(shí)發(fā)育進(jìn)程之間的關(guān)系還需進(jìn)一步的探索和解析。這為后續(xù)進(jìn)行成熟果的相關(guān)研究提供了思路,也暗示選擇合適時(shí)期的材料對(duì)果實(shí)皮色的研究十分重要。

    4 結(jié)論

    甜瓜幼果果皮顏色(深綠和淺綠)是受單個(gè)核基因控制的質(zhì)量性狀,且深綠對(duì)淺綠為顯性。通過(guò)遺傳定位將該定位于4號(hào)染色體分子標(biāo)記4-102和4-81之間,物理距離約為17.7 kb。此區(qū)間內(nèi)()的第8個(gè)外顯子在‘LGR’中發(fā)生單堿基替換(G856T),造成蛋白翻譯提前終止,推測(cè)()即為調(diào)控甜瓜幼果果皮顏色的基因。

    [1] TADMOR Y, BURGER J, YAAKOV I, FEDER A, LIBHABER S E, PORTNOY V, MEIR A, TZURI G, SA’AR U, ROGACHEV I, AHARONI A, ABELIOVICH H, SCHAFFER A A, LEWINSOHN E, KATZIR N. Genetics of flavonoid, carotenoid, and chlorophyll pigments in melon fruit rinds. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(19): 10722-10728.

    [2] GUSMINI G, WEHNER T C. Genes determining rind pattern inheritance in watermelon: A review. HortScience, 2005, 40(6): 1928-1930.

    [3] WHITAKER T W, DAVIS G N. Cucurbits: Botany, cultivation and utilization. Journal of Association of Official Agricultural Chemists, 1962, 45(4): 1052.

    [4] PARTHASARATHY V A, SAMBANDAM C N. Inheritance in Indian melons. Indian Journal of Genetics and Plant Breeding, 1981, 41(1): 114-117.

    [5] KUBICKI B. Inheritance of some characters in muskmelons. Genetiea Polonlca, 1962, 3: 265-274.

    [6] PEREIRA L, RUGGIERI V, PéREZ S, ALEXIOU K G, FERNáNDEZ M, JAHRMANN T, PUJOL M, GARCIA-MAS J. QTL mapping of melon fruit quality traits using a high-density GBS-based genetic map. BMC Plant Biology, 2018, 18(1): 324.

    [7] BURGER Y, BHASTEKER D, SA’AR U, KATZIR N, PARIS H S. A recessive gene for light immature exterior color of melon. Cucurbit Genetics Cooperative Report, 2006, 28/29: 17-18.

    [8] OREN E, TZURI G, VEXLER L, DAFNA A, MEIR A, FAIGENBOIM A, KENIGSWALD M, PORTNOY V, SCHAFFER A A, LEVI A, BUCKLER E S, KATZIR N, BURGER J, TADMOR Y, GUR A. The multi-allelic APRR2 gene is associated with fruit pigment accumulation in melon and watermelon. Journal of Experimental Botany, 2019, 70(15): 3781-3794.

    [9] HUGHES M. The inheritance of two characters ofand their interrelationship. Journal of the American Aociety for Horticultural Science, 1948, 52: 399-402.

    [10] FEDER A, BURGER J, GAO S, LEWINSOHN E, KATZIR N, SCHAFFER A A, MEIR A, DAVIDOVICH-RIKANATI R, PORTNOY V, GAL-ON A, FEI Z J, KASHI Y, TADMOR Y. A kelch domain- containing F-box coding gene negatively regulates flavonoid accumulation in muskmelon. Plant Physiology, 2015, 169(3): 1714-1726.

    [11] EDUARDO I, ARúS P, MONFORTE A J, OBANDO J, FERNANDEZ-TRUJILLO J P, MARTINEZ J A, ALARCóN A L, ALVAREZ J M, VAN DER KNAAP E. Estimating the genetic architecture of fruit quality traits in melon (L.) using a genomic library of near-isogenic lines. Journal of the American Society for Horticultural Science, 2007, 132(1): 80-89.

    [12] OBANDO J, FERNáNDEZ-TRUJILLO J P, MARTíNEZ J A, ALARCóN A L, EDUARDO I, ARúS P, MONFORTE A J. Identification of melon fruit quality quantitative trait loci using near-isogenic lines. Journal of the American Society for Horticultural Science, 2008, 133(1): 139-151.

    [13] PITRAT M, HANELT P, HAMMER K. Some comments on infraspecific classification of cultivars of melon. Acta Horticulturae, 2000, 510: 29-36.

    [14] 林德佩. 中國(guó)栽培甜瓜植物的起源、分類及進(jìn)化. 中國(guó)瓜菜, 2010(4): 34-36.

    LIN D P. Origin classification and evolution for cultivated plants of Chinese melon. China Cucurbits and Vegetables, 2010(4): 34-36. (in Chinese)

    [15] LIU H Q, JIAO J Q, LIANG X J, LIU J, MENG H W, CHEN S X, LI Y H, CHENG Z H. Map-based cloning, identification and characterization of the w gene controlling white immature fruit color in cucumber (L.). Theoretical and Applied Genetics, 2016, 129(7): 1247-1256.

    [16] PAN Y, BRADLEY G, PYKE K, BALL G, LU C G, FRAY R, MARSHALL A, JAYASUTA S, BAXTER C, VAN WIJK R, BOYDEN L, CADE R, CHAPMAN N H, FRASER P D, HODGMAN C, SEYMOUR G B. Network inference analysis identifies an APRR2-like gene linked to pigment accumulation in tomato and pepper fruits. Plant Physiology, 2013, 161(3): 1476-1485.

    [17] 賈繼增, 高麗鋒, 趙光耀, 周文斌, 張衛(wèi)健. 作物基因組學(xué)與作物科學(xué)革命. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48(17): 3316-3332.

    JIA J Z, GAO L F, ZHAO G Y, ZHOU W B, ZHANG W J. Crop genomics and crop science revolutions. Scientia Agricultura Sinica, 2015, 48(17): 3316-3332. (in Chinese)

    [18] ZHAO G W, LIAN Q, ZHANG Z H, FU Q S, HE Y H, MA S W, RUGGIERI V, MONFORTE A J, WANG P Y, JULCA I, WANG H S, LIU J P, XU Y, WANG R Z, JI J B, XU Z H, KONG W H, ZHONG Y, SHANG J L, PEREIRA L, ARGYRIS J, ZHANG J A, MAYOBRE C, PUJOL M, OREN E, OU D D, WANG J M, SUN D X, ZHAO S J, ZHU Y C, LI N, KATZIR N, GUR A, DOGIMONT C, SCHAEFER H, FAN W, BENDAHMANE A, FEI Z J, PITRAT M, GABALDóN T, LIN T, GARCIA-MAS J, XU Y Y, HUANG S W. A comprehensive genome variation map of melon identifies multiple domestication events and loci influencing agronomic traits. Nature Genetics, 2019, 51(11): 1607-1615.

    [19] 楊光華, 范榮, 楊小鋒, 侯軍亮, 袁士臣, 曹明, 王學(xué)林, 李勁松. 甜瓜果實(shí)顏色3個(gè)質(zhì)量性狀基因的定位. 園藝學(xué)報(bào), 2014, 41(5): 898-906.

    YANG G H, FAN R, YANG X F, HOU J L, YUAN S C, CAO M, WANG X L, LI J S. Construction of a highly dense genetic map using SNP and mapping of three qualitative traits in. Acta Horticulturae Sinica, 2014, 41(5): 898-906. (in Chinese)

    [20] 歐點(diǎn)點(diǎn), 趙光偉, 賀玉花, 王平勇, 徐志紅, 孔維虎, 張健, 徐永陽(yáng). 甜瓜果皮顏色遺傳分析及基因定位. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2019, 35(13): 64-69.

    OU D D, ZHAO G W, HE Y H, WANG P Y, XU Z H, KONG W H, ZHANG J A, XU Y Y. Genetic analysis and gene mapping for melon rind color. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2019, 35(13): 64-69. (in Chinese)

    [21] FALLIK E, ALKALI-TUVIA S, HOREV B, COPEL A, RODOV V, AHARONI Y, ULRICH D, SCHULZ H. Characterization of ‘Galia’ melon aroma by GC and mass spectrometric sensor measurements after prolonged storage. Postharvest Biology and Technology, 2001, 22(1): 85-91.

    [22] REID M S, LEE T H, PRATT H K, CHICHESTER C O. Chlorophyll and carotenoid changes in developing muskmelons. Journal of the American Society for Horticultural Science, 1970, 95(6): 814-815.

    [23] FLüGEL M, GROSS J. Pigment and plastid changes in mesocarp and exocarp of ripening muskmeloncv. Galia. Angewandte Botanik, 1982, 56(5/6): 393-406.

    [24] LIGHTBOURN G J, GRIESBACH R J, NOVOTNY J A, CLEVIDENCE B A, RAO D D, STOMMEL J R. Effects of anthocyanin and carotenoid combinations on foliage and immature fruit color ofL. Journal of Heredity, 2008, 99(2): 105-111.

    [25] CHEN M, JI M L, WEN B B, LIU L, LI S X, CHEN X D, GAO D S, LI L. GOLDEN 2-LIKE transcription factors of plants. Frontiers in Plant Science, 2016, 7: 1509.

    [26] WATERS M T, MOYLAN E C, LANGDALE J A. GLK transcription factors regulate chloroplast development in a cell-autonomous manner. The Plant Journal, 2008, 56(3): 432-444.

    [27] WATERS M T, WANG P, KORKARIC M, CAPPER R G, SAUNDERS N J, LANGDALE J A. GLK transcription factors coordinate expression of the photosynthetic apparatus in. The Plant Cell, 2009, 21(4): 1109-1128.

    [28] MASON M G, MATHEWS D E, ARGYROS D A, MAXWELL B B, KIEBER J J, ALONSO J M, ECKER J R, SCHALLER G E. Multiple type-B response regulators mediate cytokinin signal transduction in. The Plant Cell, 2005, 17(11): 3007-3018.

    [29] ARGYROS R D, MATHEWS D E, CHIANG Y H, PALMER C M, THIBAULT D M, ETHERIDGE N, ARGYROS D A, MASON M G, KIEBER J J, SCHALLER G E. Type B response regulators ofplay key roles in cytokinin signaling and plant development. The Plant Cell, 2008, 20(8): 2102-2116.

    [30] CHOI J, HUH S U, KOJIMA M, SAKAKIBARA H, PAEK K H, HWANG I. The cytokinin-activated transcription factor ARR2 promotes plant immunity via TGA3/NPR1-dependent salicylic acid signaling in. Developmental Cell, 2010, 19: 284-295.

    [31] TANG W J, WANG W Q, CHEN D Q, JI Q A, JING Y J, WANG H Y, LIN R C. Transposase-derived proteins FHY3/FAR1 interact with PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR1 to regulate chlorophyll biosynthesis by modulating HEMB1 during deetiolation in. The Plant Cell, 2012, 24(5): 1984-2000.

    [32] GAO S, GAO J, ZHU X Y, SONG Y, LI Z P, REN G D, ZHOU X, KUAI B K. ABF2, ABF3, and ABF4promote ABA-mediated chlorophyll degradation and leaf senescence by transcriptional activation of chlorophyll catabolic genes and senescence-associated genes in. Molecular Plant, 2016, 9(9): 1272-1285.

    Fine Mapping of an Immature Rind Color Genein Melon

    XU XinYang, SHEN Jia, ZHANG YueJian, LI GuoJing, NIU XiaoWei, SHOU WeiSong

    Institute of Vegetables, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021

    【】The aim of this study was to explore the inheritance pattern of immature rind color of melon(L.), to fine map target gene, and to deepen the understanding of rind color change during fruit growth, so as to provide a guidance for the improvement of melon color with molecular design breeding.【】The dark-green rind line ‘MR-1’ (.ssp.) and the light-green rind line ‘LGR’ (C.ssp.) were used as parents to construct the F1hybrid population, and the BC1F1backcross population was constructed from crossing by F1and ‘LGR’ for genetic analysis of immature rind color. By selecting 20 dark-green and light-green plants each in BC1F1population, the DNA was mixed, respectively, and the BSA-seq was operated for initial mapping. Based on the resequencing of two parents, the molecular markers with better specificity were developed in the initial region and recombinant individuals were identified and selected to verify and narrow the interval for fine mapping thegene. By sequencing of coding regions between two parents according to the gene annotation, the candidate gene and key variant site were determined. Moreover, the phenotype of immature and mature fruit in the BC1F1backcross population was investigated and assessed by correlation analysis to explore the underlying mechanism of rind color transition in the fruit development.【】According to the investigation, the phenotype of all F1individual plants exhibited dark-green rind color. In addition, the immature rind color of BC1F1 backcross population was found to be separated, and the ratio of the number of dark-green to light-green was approximately 1﹕1. As well as, the ratio of the number of dark-green to light-green in the F2population was 3﹕1. These ratios corresponded to Mendel’s law of inheritance, indicating that the immature rind color of melon was a quality trait, controlled by a single nuclear gene, and the dark-green was dominant to light-green. Through BSA-seq, the gene was initially mapped to a 1.8 Mb interval on the long arm of chromosome 4. With developed molecular markers, 24 recombinant individuals were selected in expanded mapping population. The gene was further narrowed down to a region between markers 4-102 and 4-81 with a physical distance of 17.7 kb by genotype and phenotype verification of offspring, where were four predicted genes with latest annotation. Sequencing analysis revealed that a geneencoding GLKs transcription factor CmAPRR2 had several variations in ‘MR-1’ and ‘LGR’. Among them, there were three synonymous, a missense mutation, and a nonsense mutation. The nonsense mutation (G to T) appeared in the 856th base of the coding region led to premature translation termination and most of the Myb-DNA binding domain to be lost in ‘LGR’. Thus, the() was speculated to be thegene and the nonsense mutation was the key variation that affected the immature rind color of melon. It was found that there was a significant correlation between the rind color of immature fruit and mature fruit by investigating the phenotype of fruits in the BC1F1backcross population.【】Immature rind color (dark green/light green) of melon was a quality trait and controlled by a single nuclear gene. By mapping,() was presumed to be the candidate gene that affected immature rind color.

    melon; immature rind color; gene mapping;;()

    10.3864/j.issn.0578-1752.2021.15.014

    2020-09-20;

    2020-12-16

    浙江省第三次全國(guó)農(nóng)作物種質(zhì)資源普查與收集行動(dòng)(111821301354052030)、浙江省農(nóng)業(yè)(蔬菜)新品種選育重大科技專項(xiàng)(2016C02051-4-4)

    許昕陽(yáng),E-mail:shine2014201048@163.com。通信作者壽偉松,E-mail:shouws@zaas.ac.cn

    (責(zé)任編輯 趙伶俐)

    猜你喜歡
    幼果親本果皮
    果皮清新劑
    甘蔗親本農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)與分析
    果樹(shù)幼果期 注意防控這些病蟲(chóng)害
    梨幼果春季低溫霜凍調(diào)查
    別亂丟果皮
    幾種蘋果砧木實(shí)生后代與親本性狀的相關(guān)性
    不亂扔果皮
    云瑞10系列生產(chǎn)性創(chuàng)新親本2種方法評(píng)價(jià)
    蘋果幼果多酚對(duì)草魚片保鮮效果的研究
    油用向日葵親本繁殖及雜交制種技術(shù)
    在线观看一区二区三区激情| 日韩伦理黄色片| 色综合欧美亚洲国产小说| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 欧美成人午夜精品| 新久久久久国产一级毛片| 少妇被粗大的猛进出69影院| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 日韩大片免费观看网站| 亚洲精品av麻豆狂野| 一二三四在线观看免费中文在| 嫩草影视91久久| 久久av网站| 欧美在线一区亚洲| 精品欧美一区二区三区在线| 超碰成人久久| 在线观看一区二区三区激情| 久久中文字幕一级| 十分钟在线观看高清视频www| 久久青草综合色| 国产日韩欧美视频二区| kizo精华| 国产成人影院久久av| 亚洲av男天堂| 99九九在线精品视频| 午夜视频精品福利| 国产一区二区激情短视频 | 亚洲人成电影观看| 免费av中文字幕在线| 99国产精品一区二区三区| 国产爽快片一区二区三区| 黄片小视频在线播放| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产成人欧美在线观看 | 国产成人精品久久二区二区91| av片东京热男人的天堂| 一本久久精品| 99久久人妻综合| 亚洲精品美女久久av网站| 久久精品国产亚洲av高清一级| 亚洲熟女精品中文字幕| 桃花免费在线播放| 久久热在线av| 日本欧美国产在线视频| 国产在线一区二区三区精| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 91国产中文字幕| √禁漫天堂资源中文www| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 日日摸夜夜添夜夜爱| 热re99久久精品国产66热6| 赤兔流量卡办理| 国产av精品麻豆| bbb黄色大片| 校园人妻丝袜中文字幕| 在线观看www视频免费| 久久久欧美国产精品| 交换朋友夫妻互换小说| 欧美少妇被猛烈插入视频| 成年人午夜在线观看视频| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 2018国产大陆天天弄谢| 欧美精品亚洲一区二区| 国产不卡av网站在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 国产成人啪精品午夜网站| 老司机深夜福利视频在线观看 | 国产高清不卡午夜福利| 精品国产一区二区久久| 日日夜夜操网爽| 超碰97精品在线观看| 亚洲,欧美精品.| 亚洲人成电影观看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 在线观看www视频免费| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美日韩一级在线毛片| 国产99久久九九免费精品| 国产精品久久久久久精品古装| 午夜免费男女啪啪视频观看| 后天国语完整版免费观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 9热在线视频观看99| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产黄色免费在线视频| 国产高清国产精品国产三级| 中文字幕亚洲精品专区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产熟女午夜一区二区三区| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲少妇的诱惑av| 电影成人av| 色婷婷av一区二区三区视频| 脱女人内裤的视频| 丝袜在线中文字幕| 赤兔流量卡办理| 日韩人妻精品一区2区三区| 国产精品 欧美亚洲| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲国产日韩一区二区| 十分钟在线观看高清视频www| 色婷婷久久久亚洲欧美| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲天堂av无毛| 黄色毛片三级朝国网站| 日本欧美视频一区| 国产色视频综合| 免费在线观看日本一区| tube8黄色片| 国产福利在线免费观看视频| 我的亚洲天堂| 在线观看人妻少妇| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产1区2区3区精品| 亚洲精品国产区一区二| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 一级毛片女人18水好多 | 欧美日韩成人在线一区二区| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 日本五十路高清| 久久精品人人爽人人爽视色| 十八禁网站网址无遮挡| 少妇人妻 视频| 国产av国产精品国产| 免费看av在线观看网站| 国产成人一区二区在线| 波多野结衣一区麻豆| 精品国产一区二区久久| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲九九香蕉| 国产精品亚洲av一区麻豆| 日日摸夜夜添夜夜爱| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 2021少妇久久久久久久久久久| 涩涩av久久男人的天堂| 精品国产乱码久久久久久男人| bbb黄色大片| 久久国产亚洲av麻豆专区| 飞空精品影院首页| 视频区欧美日本亚洲| 操出白浆在线播放| 精品一区二区三区av网在线观看 | 欧美97在线视频| 国产高清不卡午夜福利| 精品国产乱码久久久久久男人| 精品国产一区二区久久| svipshipincom国产片| 91精品国产国语对白视频| 午夜两性在线视频| 国产精品二区激情视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 久久精品国产亚洲av涩爱| 十八禁人妻一区二区| 激情五月婷婷亚洲| 丰满饥渴人妻一区二区三| 蜜桃在线观看..| 亚洲精品自拍成人| 色视频在线一区二区三区| 久久久精品区二区三区| 国产一区二区激情短视频 | 中文字幕色久视频| 国产视频首页在线观看| 超碰97精品在线观看| 国产91精品成人一区二区三区 | 蜜桃在线观看..| 麻豆av在线久日| av又黄又爽大尺度在线免费看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 男女免费视频国产| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲专区中文字幕在线| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 欧美日韩亚洲高清精品| 成年美女黄网站色视频大全免费| 国产1区2区3区精品| 亚洲av在线观看美女高潮| 成在线人永久免费视频| 十分钟在线观看高清视频www| 老司机深夜福利视频在线观看 | 午夜福利一区二区在线看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 精品福利观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 十分钟在线观看高清视频www| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 丁香六月天网| 中文字幕人妻丝袜制服| 啦啦啦在线观看免费高清www| a 毛片基地| 国产精品久久久人人做人人爽| 久久99精品国语久久久| 丝袜美足系列| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲成人手机| 国产成人系列免费观看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 精品少妇久久久久久888优播| 乱人伦中国视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产在线一区二区三区精| 国产有黄有色有爽视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 日韩一区二区三区影片| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲欧洲国产日韩| 一本久久精品| 人妻 亚洲 视频| 婷婷色麻豆天堂久久| 91老司机精品| 国产亚洲精品第一综合不卡| 捣出白浆h1v1| 国产成人欧美在线观看 | 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲国产av新网站| 美国免费a级毛片| av线在线观看网站| 女性生殖器流出的白浆| 男女高潮啪啪啪动态图| 丝袜在线中文字幕| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 久久综合国产亚洲精品| 成人国产一区最新在线观看 | 在现免费观看毛片| 蜜桃在线观看..| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产av国产精品国产| 精品人妻一区二区三区麻豆| 超色免费av| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产亚洲一区二区精品| 中国美女看黄片| 亚洲精品久久午夜乱码| 嫩草影视91久久| 亚洲九九香蕉| svipshipincom国产片| 亚洲精品中文字幕在线视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 久久ye,这里只有精品| 啦啦啦啦在线视频资源| 大型av网站在线播放| 成人影院久久| 亚洲专区中文字幕在线| 成年美女黄网站色视频大全免费| 黄色怎么调成土黄色| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲av日韩在线播放| 日韩av免费高清视频| 久久久久久久国产电影| 成在线人永久免费视频| 最黄视频免费看| 永久免费av网站大全| 午夜福利免费观看在线| 国产有黄有色有爽视频| 国产男女超爽视频在线观看| 黄片小视频在线播放| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产伦理片在线播放av一区| 成年人免费黄色播放视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 三上悠亚av全集在线观看| 999精品在线视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产福利在线免费观看视频| 精品久久蜜臀av无| 亚洲欧美清纯卡通| 国产伦理片在线播放av一区| 久久久久视频综合| 久久久久久人人人人人| 日韩大码丰满熟妇| 午夜日韩欧美国产| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 69精品国产乱码久久久| 一本大道久久a久久精品| 免费看不卡的av| 免费高清在线观看视频在线观看| a 毛片基地| 99re6热这里在线精品视频| 七月丁香在线播放| 韩国高清视频一区二区三区| 51午夜福利影视在线观看| 欧美中文综合在线视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 日本a在线网址| 日本一本二区三区精品| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲精华国产精华精| 日日夜夜操网爽| 国产野战对白在线观看| 国产色视频综合| 日韩国内少妇激情av| 亚洲国产精品999在线| 午夜福利视频1000在线观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 最近在线观看免费完整版| 中出人妻视频一区二区| 日韩欧美在线二视频| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| www.精华液| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 久久九九热精品免费| 免费看日本二区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 99在线人妻在线中文字幕| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 天堂影院成人在线观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲五月婷婷丁香| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 在线永久观看黄色视频| 免费在线观看黄色视频的| 婷婷亚洲欧美| 久久久久久久午夜电影| 日本一本二区三区精品| 亚洲国产看品久久| 亚洲av电影不卡..在线观看| ponron亚洲| 18美女黄网站色大片免费观看| 色播在线永久视频| 国产av不卡久久| 制服人妻中文乱码| 久久久国产欧美日韩av| 欧美日韩一级在线毛片| 日韩欧美 国产精品| cao死你这个sao货| 日本熟妇午夜| 少妇被粗大的猛进出69影院| 美女扒开内裤让男人捅视频| 无遮挡黄片免费观看| 国产区一区二久久| www.自偷自拍.com| 亚洲欧美激情综合另类| 国产成人欧美| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产午夜福利久久久久久| 丰满的人妻完整版| 午夜免费观看网址| 欧美激情 高清一区二区三区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 波多野结衣高清无吗| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 操出白浆在线播放| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 午夜免费激情av| 国产精品久久电影中文字幕| 国产精品乱码一区二三区的特点| 久久久久亚洲av毛片大全| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 制服诱惑二区| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 老司机在亚洲福利影院| 色综合亚洲欧美另类图片| 中文字幕人妻熟女乱码| 免费观看精品视频网站| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 一a级毛片在线观看| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 首页视频小说图片口味搜索| 99精品在免费线老司机午夜| 国产av在哪里看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 久久人妻av系列| 波多野结衣av一区二区av| 香蕉国产在线看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 日韩视频一区二区在线观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 成在线人永久免费视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 欧美色欧美亚洲另类二区| 欧美一级a爱片免费观看看 | 国产熟女午夜一区二区三区| 人妻久久中文字幕网| 亚洲av五月六月丁香网| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 淫秽高清视频在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 成人精品一区二区免费| 欧美三级亚洲精品| 嫩草影院精品99| 婷婷丁香在线五月| 国产视频一区二区在线看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 中国美女看黄片| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲精品一区av在线观看| 久久久久久国产a免费观看| 国产成人欧美在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡| 亚洲第一青青草原| 中文字幕精品亚洲无线码一区 | 男女下面进入的视频免费午夜 | 露出奶头的视频| 亚洲男人天堂网一区| 国产亚洲欧美在线一区二区| 一级片免费观看大全| 国产在线精品亚洲第一网站| 黄色 视频免费看| 国产黄a三级三级三级人| www国产在线视频色| 欧美乱色亚洲激情| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 不卡av一区二区三区| 国产av不卡久久| 特大巨黑吊av在线直播 | 久久香蕉激情| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 欧美午夜高清在线| 热99re8久久精品国产| 久久久久久免费高清国产稀缺| 99国产综合亚洲精品| 亚洲免费av在线视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产单亲对白刺激| 精品久久久久久成人av| 女性被躁到高潮视频| 亚洲真实伦在线观看| 日本 欧美在线| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲国产精品sss在线观看| 欧美黑人巨大hd| 91大片在线观看| 97碰自拍视频| 男女视频在线观看网站免费 | 久久性视频一级片| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 给我免费播放毛片高清在线观看| 九色国产91popny在线| 波多野结衣高清无吗| 视频在线观看一区二区三区| 欧美一级a爱片免费观看看 | 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产成人啪精品午夜网站| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 香蕉av资源在线| 青草久久国产| 一级毛片精品| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 免费在线观看黄色视频的| 一本大道久久a久久精品| 91麻豆精品激情在线观看国产| 黄色片一级片一级黄色片| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲免费av在线视频| 亚洲五月色婷婷综合| 99在线人妻在线中文字幕| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 中文字幕av电影在线播放| 波多野结衣av一区二区av| 欧美成狂野欧美在线观看| 一本综合久久免费| 欧美黄色片欧美黄色片| 久久久国产成人精品二区| 亚洲三区欧美一区| 久久久久久大精品| 午夜久久久久精精品| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲人成77777在线视频| www.熟女人妻精品国产| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 99久久国产精品久久久| 老司机在亚洲福利影院| 国产成人精品无人区| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲欧美日韩无卡精品| 男人的好看免费观看在线视频 | 亚洲人成电影免费在线| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 特大巨黑吊av在线直播 | 一个人免费在线观看的高清视频| 看免费av毛片| av欧美777| 女人被狂操c到高潮| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲av电影在线进入| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 亚洲国产看品久久| 在线观看免费日韩欧美大片| 免费一级毛片在线播放高清视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲avbb在线观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 十八禁人妻一区二区| 欧美乱码精品一区二区三区| 精华霜和精华液先用哪个| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 国产伦在线观看视频一区| 日本精品一区二区三区蜜桃| 高清在线国产一区| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久久久国产精品麻豆| 两个人看的免费小视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 黄色 视频免费看| 黄色视频,在线免费观看| 久久伊人香网站| 成人国产一区最新在线观看| 人人妻人人澡人人看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 身体一侧抽搐| 51午夜福利影视在线观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 老汉色∧v一级毛片| 日本a在线网址| 一本综合久久免费| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲五月婷婷丁香| 国产精品综合久久久久久久免费| e午夜精品久久久久久久| 日本 av在线| 欧美中文综合在线视频| 久久久久久久久久黄片| 久久青草综合色| 久久久久久大精品| 成人精品一区二区免费| 久久精品成人免费网站| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲人成电影免费在线| 久久久国产欧美日韩av| 美女扒开内裤让男人捅视频| 深夜精品福利| 真人做人爱边吃奶动态| 免费观看人在逋| 欧美日韩精品网址| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 成人午夜高清在线视频 | 精品久久蜜臀av无| 在线天堂中文资源库| 免费无遮挡裸体视频| bbb黄色大片| 欧美黑人精品巨大| 亚洲av片天天在线观看| 中国美女看黄片| 国产亚洲精品第一综合不卡| 黄色a级毛片大全视频| 黄频高清免费视频| 黄色 视频免费看| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 久久香蕉国产精品| 人人妻人人看人人澡| 亚洲av熟女| 欧美+亚洲+日韩+国产| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 精品国产亚洲在线| 午夜福利在线观看吧| 91九色精品人成在线观看| 韩国精品一区二区三区| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲精品久久国产高清桃花| 动漫黄色视频在线观看| 男女视频在线观看网站免费 | 波多野结衣巨乳人妻| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久草成人影院| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 久久久久久久午夜电影| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 午夜免费激情av| 亚洲一区二区三区色噜噜| 桃红色精品国产亚洲av| 国产黄片美女视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产熟女xx| 色综合站精品国产| 成人精品一区二区免费| 久久中文看片网| 成人三级做爰电影| 美女大奶头视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 女警被强在线播放| 午夜福利高清视频| 十分钟在线观看高清视频www| 村上凉子中文字幕在线| 国产亚洲欧美98| 91成人精品电影| 在线av久久热| 18禁观看日本| 久久精品91无色码中文字幕|