• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    甜瓜幼果果皮顏色基因GR的精細(xì)定位

    2021-08-20 01:36:08許昕陽(yáng)沈佳張躍建李國(guó)景牛曉偉壽偉松
    關(guān)鍵詞:幼果親本果皮

    許昕陽(yáng),沈佳,張躍建,李國(guó)景,牛曉偉,壽偉松

    甜瓜幼果果皮顏色基因的精細(xì)定位

    許昕陽(yáng),沈佳,張躍建,李國(guó)景,牛曉偉,壽偉松

    浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所,杭州 310021

    【】探究甜瓜幼果果皮顏色性狀的遺傳規(guī)律,精細(xì)定位目標(biāo)性狀基因,加深對(duì)甜瓜發(fā)育過(guò)程中果皮顏色轉(zhuǎn)變的認(rèn)知,為開(kāi)展甜瓜果皮顏色的分子設(shè)計(jì)育種奠定基礎(chǔ)。以幼果深綠皮的薄皮甜瓜純系‘MR-1’和幼果淺綠皮的厚皮甜瓜純系‘LGR’為親本,構(gòu)建F1正反交群體;以及利用F1與淺綠皮親本‘LGR’雜交構(gòu)建BC1F1回交群體,對(duì)甜瓜幼果果皮顏色基因()進(jìn)行遺傳分析。選取BC1F1群體中深綠皮和淺綠皮單株各20株,混池其DNA進(jìn)行BSA-seq以獲取初定位區(qū)間?;凇甅R-1’和‘LGR’兩親本的重測(cè)序數(shù)據(jù),開(kāi)發(fā)初定位區(qū)段內(nèi)特異性較好的分子標(biāo)記,鑒定篩選擴(kuò)大群體(BC1F1和F2)中的重組交換單株,驗(yàn)證和縮小定位區(qū)間,實(shí)現(xiàn)精細(xì)定位。將兩親本定位區(qū)段內(nèi)注釋基因的編碼區(qū)進(jìn)行測(cè)序以確定候選基因和關(guān)鍵變異位點(diǎn)。通過(guò)調(diào)查BC1F1回交群體中幼果果皮顏色和成熟果果皮顏色,利用相關(guān)性分析探究果皮顏色轉(zhuǎn)變?cè)谔鸸习l(fā)育過(guò)程中的內(nèi)在聯(lián)系。通過(guò)分析F1群體果皮顏色發(fā)現(xiàn)所有F1單株幼果都表現(xiàn)為深綠皮。另外,BC1F1群體單株幼果果皮顏色會(huì)發(fā)生分離,其中深綠皮單株數(shù)﹕淺綠皮單株數(shù)約等于1﹕1,以及F2群體中深綠皮植株與淺綠皮植株的分離比為3﹕1。這些分離比都符合孟德?tīng)栠z傳定律,表明幼果果皮顏色是受單個(gè)核基因控制的質(zhì)量性狀,并且深綠對(duì)淺綠為顯性。通過(guò)BSA-seq分析將基因初步定位于4號(hào)染色體長(zhǎng)臂,物理距離為1.8 Mb的范圍內(nèi)。利用開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記在擴(kuò)大的定位群體中共篩選到24個(gè)重組交換單株。經(jīng)過(guò)后代基因型和表型驗(yàn)證,最終將精細(xì)定位在標(biāo)記4-102和4-81之間約17.7 kb的范圍內(nèi),區(qū)段內(nèi)共包含4個(gè)注釋基因。經(jīng)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)一個(gè)編碼GLKs類轉(zhuǎn)錄因子CmAPRR2的基因在親本‘MR-1’和‘LGR’中存在多處變異,其中有3處發(fā)生了同義突變,1處錯(cuò)義突變和1處無(wú)義突變。無(wú)義突變出現(xiàn)在的編碼區(qū)第856位堿基處(由G變成T),導(dǎo)致親本‘LGR’中蛋白翻譯提前終止,其Myb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域大部分缺失,推測(cè)基因()即為影響甜瓜幼果果皮顏色的基因,而第856位的單堿基替換造成的無(wú)義突變即為關(guān)鍵變異位點(diǎn)。此外,BC1F1回交群體單株的表型調(diào)查結(jié)果顯示幼果與成熟果的果皮顏色之間存在顯著相關(guān)性。甜瓜幼果果皮顏色(深綠/淺綠)性狀為質(zhì)量性狀,受單個(gè)核基因控制。通過(guò)遺傳定位手段推斷()為最有可能影響甜瓜幼果果皮顏色的候選基因。

    甜瓜;幼果果皮顏色;基因定位;;()

    0 引言

    【研究意義】甜瓜(L.)是我國(guó)重要的園藝和經(jīng)濟(jì)作物。果皮顏色作為甜瓜最直觀的外觀品質(zhì)性狀,直接影響其商品價(jià)值和消費(fèi)者的選擇,開(kāi)展甜瓜果皮顏色性狀的遺傳研究對(duì)甜瓜育種有重要意義。【前人研究進(jìn)展】瓜類植物的果皮顏色調(diào)節(jié)開(kāi)始于果實(shí)發(fā)育的早期,在幼果期表現(xiàn)為綠色,反映的是葉綠素含量[1]。隨著果實(shí)發(fā)育的進(jìn)行,甜瓜外果皮顏色在成熟過(guò)程中會(huì)發(fā)生較大轉(zhuǎn)變[2]。成熟甜瓜果皮顏色豐富多樣,主要有白色、黃色、橙色、綠色以及多種顏色混雜或者斑紋類型。早期對(duì)甜瓜果皮顏色是由單基因或者多基因控制存在較大的爭(zhēng)議,但該爭(zhēng)議多基于不同品種間組合的差異[3-4]。KUBICKI[5]認(rèn)為幼果果皮白色對(duì)綠色為顯性,并且是受單基因遺傳控制。PEREIRA等[6]通過(guò)構(gòu)建‘Védrantais’和‘Piel de Sapo’的高密度GBS遺傳圖譜發(fā)現(xiàn)淺皮為顯性性狀,并且將該基因定位在7號(hào)染色體,該位置與相近,推測(cè)為同一個(gè)基因。BURGER等[7]利用兩個(gè)雜交群體:深皮‘Dulce’和淺皮‘TAM-Dew’,深綠‘Krymka’和淺綠‘Eshkolit Ha’Amaqim’探究甜瓜幼果果皮顏色遺傳模式時(shí)發(fā)現(xiàn)淺皮親本受隱性單基因控制,并且該基因與之前報(bào)道的淺皮顯性基因不等位。OREN等[8]利用‘Tam Dew’和‘Dulce’的重組自交系以及‘Dulce’和‘Noy Amid’的F3:4家系將一個(gè)影響甜瓜幼果果皮顏色的基因定位在4號(hào)染色體上290 kb的區(qū)段內(nèi),后通過(guò)差異性分析確定基因是影響該幼果果皮顏色的基因。在成熟果中,HUGHES[9]發(fā)現(xiàn)‘Honeydew’品種的白色相對(duì)于‘Smiths’ Perfect cantaloupe’品種的綠色為隱性。TADMOR等[1]在黃皮‘Noy Amid’和綠皮‘TVT’雜交的F2分離群體中發(fā)現(xiàn)柚皮素查爾酮含量的分離比符合孟德?tīng)?﹕1的遺傳定律,證實(shí)了該色素受單基因調(diào)控。FEDER等[10]進(jìn)一步利用該F2群體進(jìn)行了基因定位,并結(jié)合遺傳轉(zhuǎn)化鑒定出影響成熟果果皮顏色的基因。另外,利用‘Piel de Sapo’和‘PI 161375’的雜交組合,研究者們也鑒定了果皮顏色相關(guān)的QTLs[11-12]?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,許多甜瓜果皮顏色相關(guān)的QTLs和基因被分離和鑒定。但是,多數(shù)基因的精細(xì)定位仍存在定位區(qū)間較大、候選基因眾多等情況?!緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究構(gòu)建薄皮甜瓜兩個(gè)幼果果皮顏色差異的純系甜瓜‘MR-1’和厚皮甜瓜‘LGR’雜交組合,對(duì)其進(jìn)行表型觀察、群體構(gòu)建、遺傳模式分析、基因圖位克隆等,精細(xì)定位幼果果皮顏色基因,為深入揭示甜瓜幼果果皮顏色的形成機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    本研究所使用的材料‘MR-1’由國(guó)外引進(jìn),屬于薄皮甜瓜亞種泡瓜變種(var.),果實(shí)為近圓形;‘LGR’由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜所甜瓜研究室提供,屬于厚皮甜瓜亞種冬甜瓜變種(var.),果實(shí)為長(zhǎng)橢圓型(圖1),成熟果有網(wǎng)紋[13-14]。利用兩個(gè)材料雜交構(gòu)建了正反交F1群體、F1與‘LGR’回交BC1F1群體,主要用于遺傳分析;BC1F1和F2群體主要用于BSA-seq和遺傳定位。雜交和回交構(gòu)建于2017年春季,定位群體種植于2017年秋季、2018年春秋、2019年春秋以及2020年春季。所有材料均種植在浙江海寧甜瓜實(shí)驗(yàn)基地,采用常規(guī)大田生產(chǎn)管理。

    1.2 果皮顏色性狀調(diào)查

    兩親本甜瓜‘LGR’和‘MR-1’的幼果果皮顏色調(diào)查以花后10 d左右的果實(shí)為對(duì)象,利用目測(cè)對(duì)比顏色深淺,分別定為“淺綠色”和“深綠色”。遺傳分析和定位群體中單株的表型調(diào)查也以花后10 d左右的果實(shí)為對(duì)象,對(duì)照兩親本的幼果果皮顏色,經(jīng)3次不同時(shí)間(花后8、10和12 d)的目測(cè)定義表型。成熟果顏色調(diào)查和測(cè)色儀定量測(cè)定取自花后35 d左右的果實(shí)。利用美能達(dá)CR-400/410色彩色差計(jì)(Konica Minolta Camera Co., Ltd, Osaka, Japan)對(duì)果皮顏色定量,其中L*值代表亮度從黑(0)至白(100),a*值代表從紅(+a)至綠(-a),b*值代表從黃(+b)至藍(lán)(-b)。利用SPSS Statistics V21.0進(jìn)行相關(guān)性分析。

    1.3 BSA-seq分析

    從BC1F1群體中挑選深綠皮和淺綠皮植株各20株,利用CTAB法提取DNA。將20個(gè)深綠皮和20個(gè)淺綠皮單株DNA分別等量混合,形成兩個(gè)混池。2個(gè)混池和2個(gè)親本DNA按照樣品檢測(cè)、文庫(kù)構(gòu)建、質(zhì)量檢測(cè)以及上機(jī)測(cè)序等流程送由公司操作。參考基因組為甜瓜基因組Harukei3 genome reference ver1.41(http://melonet-db.dna.affrc.go.jp/ap/jbh)。

    1.4 分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)

    基于親本重測(cè)序信息,在初定位區(qū)段的雙側(cè)和內(nèi)部挑選有多態(tài)性的Indel標(biāo)記,利用凝膠電泳鑒定分子標(biāo)記的結(jié)合能力和特異性。后利用合適的引物對(duì)F2和BC1F1群體中的隱性單株個(gè)體進(jìn)行基因型鑒定,驗(yàn)證初步連鎖結(jié)果以及縮小定位區(qū)間。

    1.5 DNA提取、PCR擴(kuò)增與聚丙烯酰胺凝膠電泳

    取新鮮的甜瓜葉片于冷凍干燥機(jī)中放置1 d,采用CTAB法提取DNA:將葉片磨成粉末狀,加入600 μL預(yù)熱的CTAB提取液,搖勻,65℃水浴30 min;加入600 μL氯仿﹕異戊醇(24﹕1)抽提液,用力搖晃2 min后,12 000 r/min離心5 min;取上清液,加入360 μL(0.6倍體積上清液)-20℃預(yù)冷的異丙醇,-20℃中放置30 min;12 000 r/min離心5 min,棄上清液,加入700 μL 70%無(wú)水乙醇洗滌2次,晾干后溶于去離子水中,-20℃保存。

    PCR擴(kuò)增體系為10 μL,其中包括:2×buffer mix 5 μL,上下游引物各0.3 μL,DNA 2 μL,加去離子水2.4 μL。PCR反應(yīng)程序:98℃預(yù)變性2 min,然后擴(kuò)增33個(gè)循環(huán)(包括:94℃ 30 s;55℃ 30 s;72℃ 40 min),接著72℃ 5 min,4℃ 10 min。擴(kuò)增好的樣品于4℃保存。

    2 結(jié)果

    2.1 親本果皮顏色表型

    通過(guò)對(duì)花后10 d的果皮顏色觀察,發(fā)現(xiàn)薄皮甜瓜‘MR-1’幼果果皮表現(xiàn)為深綠色,花后35 d的成熟果果皮表現(xiàn)為亮黃色;而厚皮甜瓜‘LGR’幼果果皮表現(xiàn)為淺綠色,成熟果果皮表現(xiàn)為灰色有網(wǎng)紋(圖1)。

    2.2 幼果果皮顏色遺傳模式分析

    為探究幼果果皮顏色的遺傳規(guī)律,以‘MR-1’和‘LGR’為親本進(jìn)行正反交組配,所得F1代的幼果果皮顏色均與‘MR-1’表型相同,表明幼果果皮顏色受核基因控制,且深綠對(duì)淺綠為顯性(圖1)。F2群體植株的幼果果皮顏色發(fā)生分離,其中132個(gè)果實(shí)為深綠色果皮,44個(gè)果實(shí)為淺綠色果皮,符合3﹕1的孟德?tīng)栠z傳分離比,BC1F1代群體表現(xiàn)為1﹕1的分離比(表1)。這些結(jié)果表明幼果果皮顏色是受單基因控制的質(zhì)量性狀。因該基因主要控制果皮綠色的深淺,因此將其命名為()。

    圖1 親本以及正反交F1果皮顏色表型

    表1 幼果果皮顏色表型的遺傳學(xué)分析

    2.3 GR的初步定位

    為了分離和克隆,首先通過(guò)從BC1F1群體中挑選淺綠色和深綠色果皮植株各20株進(jìn)行DNA混池測(cè)序(BSA-seq)。參照兩親本的重測(cè)序信息,全基因組連鎖分析顯示4號(hào)染色體長(zhǎng)臂上存在一個(gè)目標(biāo)性狀區(qū)域(圖2)。該基因座的物理位置為203 744—1 974 725 bp,置信區(qū)間跨越1.8 Mb。

    圖2 GR的初定位(紅圈代表目的區(qū)段)

    2.4 GR的精細(xì)定位

    基于親本重測(cè)序得到的覆蓋了13條染色體,共1 320 497個(gè)多態(tài)性分子標(biāo)記,在4號(hào)染色體上開(kāi)發(fā)位于初定位區(qū)間兩側(cè)的標(biāo)記4-6和4-58,對(duì)BC1F1群體中的隱性單株(淺綠皮)進(jìn)行基因型鑒定。結(jié)果顯示淺綠皮單株與標(biāo)記4-6有十分明顯的共分離趨勢(shì)(圖3-A),證實(shí)了BSA初定位的結(jié)果。為了精細(xì)定位該基因,開(kāi)發(fā)了初定位結(jié)果內(nèi)特異性好的引物(圖3-B,表2),并對(duì)擴(kuò)大的BC1F1和F2群體共984株(BC1F1:877株,F(xiàn)2:107株)進(jìn)行基因型鑒定,結(jié)果共篩選出24個(gè)重組交換單株(圖4-B)。通過(guò)對(duì)重組交換單株進(jìn)行后代表型和基因型鑒定,最終將精細(xì)定位于標(biāo)記4-102和4-81之間,物理距離為17.7 kb(Chr04: 602468-620197)(圖4-A、B)。

    由于重組交換單株的缺乏,對(duì)17.7 kb區(qū)間內(nèi)包含的基因進(jìn)行序列比對(duì)分析。根據(jù)最新的甜瓜參考基因組的基因注釋發(fā)現(xiàn)該區(qū)間包含了4個(gè)基因:2個(gè)新注釋基因(和)、1個(gè)完整注釋基因()以及的一部分(圖4-C)。其中,編碼未知蛋白;預(yù)測(cè)編碼一個(gè)類生長(zhǎng)素蛋白;編碼一個(gè)雙組分反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白,該蛋白屬于Golden2-like類轉(zhuǎn)錄因子,故被命名為CmAPRR2;編碼一個(gè)煙草花葉病毒復(fù)制蛋白。通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)和等3個(gè)基因的編碼區(qū)序列在兩親本中存在差異(表3)。其中,僅存在由單堿基替換造成的錯(cuò)義變異,除了3處同義突變和1處錯(cuò)義突變,還存在1處單堿基替換造成的無(wú)義變異(表3)。通過(guò)對(duì)親本‘MR-1’和‘LGR’測(cè)序,證明‘LGR’中編碼區(qū)第856位堿基(G變?yōu)門)產(chǎn)生了終止密碼子,致使MELO3C003375蛋白翻譯提前終止,導(dǎo)致了Myb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域大部分缺失(圖5)。在黃瓜、番茄以及西瓜中,的同源基因、以及被報(bào)道參與葉綠素和類胡蘿卜素的合成以及質(zhì)體發(fā)育等過(guò)程[8,15-16]。由此推測(cè),()為控制甜瓜幼果果皮顏色的基因,而單堿基替換造成的無(wú)義突變?yōu)樵斐蓛捎H本幼果果皮顏色深淺的關(guān)鍵差異位點(diǎn)。

    A:隱性單株在分子標(biāo)記4-6的基因型。泳道1為‘MR-1’,2為‘LGR’,8、19、58為重組交換單株;B:引物多態(tài)性。上方標(biāo)記為引物名,每個(gè)引物左邊泳道為‘MR-1’,右邊為‘LGR’。M為DNA marker

    表2 定位所用引物序列

    A:GR初定位于4號(hào)染色體4-6和4-58標(biāo)記之間;B:利用984個(gè)單株精細(xì)定位GR于4-102和4-81標(biāo)記約17.7 kb范圍內(nèi)。標(biāo)記下面的數(shù)字代表交換單株數(shù);C:定位區(qū)間內(nèi)的候選基因

    2.5 幼果果皮顏色與成熟果皮顏色存在顯著相關(guān)性

    為探究甜瓜幼果果皮顏色與成熟果皮顏色之間的相關(guān)性,對(duì)BC1F1群體共153個(gè)單株的幼果進(jìn)行目測(cè),并對(duì)照親本將其劃分深綠(1)和淺綠(2)兩類。因成熟果果皮顏色變化差異較大,使用測(cè)色儀定量分析成熟果顏色變異(表4)。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析和相關(guān)性檢測(cè),發(fā)現(xiàn)幼果果皮顏色與成熟果皮顏色的亮度指標(biāo)和綠色強(qiáng)度指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)分別為0.849和0.857,呈極顯著相關(guān)。這說(shuō)明幼果果皮顏色與成熟果果皮顏色存在顯著相關(guān)性。

    表3 定位區(qū)段內(nèi)基因編碼區(qū)變異

    參考和比對(duì)分別代表‘MR-1’和‘LGR’中堿基和翻譯氨基酸REF and ALT represent the base and amino acid in ‘MR-1’ and ‘LGR’, respectively

    A:MELO3C003375的基因結(jié)構(gòu)。數(shù)字代表到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離。前面的堿基代表‘MR-1’中的堿基,后面代表‘LGR’中的堿基;B:引起LGR蛋白截短的變異位點(diǎn);C:‘MR-1’和‘LGR’中MELO3C003375的蛋白結(jié)構(gòu)域

    3 討論

    隨著甜瓜基因組研究的深入,功能基因組學(xué)取得了快速發(fā)展[17]。作為重要的農(nóng)藝性狀,果皮顏色的遺傳模式一直是研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。4號(hào)染色體長(zhǎng)臂被廣泛報(bào)道含有一個(gè)調(diào)控甜瓜果皮顏色的基因[8,18-20]。OREN等[8]利用3個(gè)親本‘Tam Dew’‘Dulce’和‘Noy Amid’將幼果果皮顏色基因定組位在4號(hào)染色體290 kb區(qū)段內(nèi);ZHAO等[18]利用全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)將果皮顏色基因定位于4號(hào)染色體500 kb的范圍內(nèi)。因該定位范圍內(nèi)含有一個(gè)編碼雙組分反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白CmAPRR2的基因,且該基因的同源基因曾在黃瓜、番茄和胡椒中被報(bào)道可調(diào)控果皮的葉綠素代謝和色素積累,因此()被前人認(rèn)定為候選基因[8,18]。有別于前人使用厚皮甜瓜進(jìn)行亞種內(nèi)組配,本研究利用厚皮與薄皮甜瓜開(kāi)展亞種間雜交;同時(shí),本研究的親本在果形、網(wǎng)紋以及成熟果果皮顏色等方面與前人選材存在較大差異,這不僅給該性狀的遺傳定位選材增添了新類型,也暗示了該基因功能在亞種間的保守性[8,13-14]。另外,本研究采用BSA-seq確定初定位區(qū)間、重測(cè)序開(kāi)發(fā)新標(biāo)記和圖位克隆縮小區(qū)段這一思路清晰且完整的研究方案,通過(guò)多代表型和基因型的驗(yàn)證,將精細(xì)定位在17.7 kb的區(qū)間內(nèi)。但重組交換單株的缺乏使該區(qū)間較難進(jìn)行進(jìn)一步的縮小。通過(guò)對(duì)區(qū)間內(nèi)注釋基因的測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)()在‘LGR’中存在1處無(wú)義變異,致使該轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游基因的重要結(jié)構(gòu)域(Myb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域)缺失,因此,()被認(rèn)為是最佳候選基因。相比以往報(bào)道,本研究極大地縮短了幼果果皮顏色性狀基因的定位區(qū)間,提高了()作為候選基因的可信度。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)‘MR-1’親本中第二個(gè)外顯子處的單堿基變異與已報(bào)道的材料都不相同,這也為甜瓜中的變異類型增添了新認(rèn)知。

    表4 BC1F1群體植株果皮顏色表型

    續(xù)表4 Continued table 4

    -a*/b*代表綠色的強(qiáng)度 -a*/b* represents the intensity of green color

    甜瓜果皮顏色豐富多樣,F(xiàn)ALLIK等[21]對(duì)不同成熟度的‘Galia’甜瓜進(jìn)行了果皮顏色變化調(diào)查并將其分成6個(gè)階段:(1)深綠色;(2)綠色;(3)淡黃色夾雜綠色;(4)淡黃色;(5)黃色;(6)深黃色至橙色。REID等[22]通過(guò)評(píng)估‘Crenshaw’‘Persian’和‘PMR45’3個(gè)甜瓜品種發(fā)現(xiàn)果實(shí)的成熟會(huì)伴隨著葉綠素含量的下降和類胡蘿卜素的上升。而FLüGEL和GROSS[23]在‘Galia’甜瓜中觀察到類胡蘿卜素含量在發(fā)育期間并沒(méi)有變化,外果皮變黃主要是因?yàn)樵诔墒爝^(guò)程中葉綠素的降解增加。因此,果皮顏色變化被認(rèn)為主要由葉綠素和類胡蘿卜素(主要是-胡蘿卜素)引起[24]。在本研究中,()作為調(diào)控甜瓜幼果果皮顏色的基因,其是否參與了單一色素或者組合色素的合成或者分解過(guò)程?在黃瓜中,被發(fā)現(xiàn)影響質(zhì)體發(fā)育和葉綠素的合成[15]。PAN等[16]發(fā)現(xiàn)番茄和辣椒果實(shí)中過(guò)表達(dá)APRR類轉(zhuǎn)錄因子會(huì)增加幼果的葉綠素和成熟果的類胡蘿卜素。OREN等[8]發(fā)現(xiàn)的表達(dá)與-類胡蘿卜素的含量存在緊密的相關(guān)性。另外,與APRR2相關(guān)的GLK2轉(zhuǎn)錄因子也曾被報(bào)道影響質(zhì)體的發(fā)育以及調(diào)節(jié)植物的葉綠素和類胡蘿卜素的含量[25-27]。這些報(bào)道都為下一步比較分析親本色素含量提供了依據(jù)和方向。

    作為雙組分反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(ARR)的一類,APRR2屬于B型響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白,該類型的蛋白被廣泛報(bào)道參與細(xì)胞分裂素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[28]。在的三突變體中,ARGYROS等[29]發(fā)現(xiàn)葉綠素的含量顯著減少并且大部分的細(xì)胞分裂素調(diào)節(jié)基因顯著下調(diào)。在擬南芥中,CHOI等[30]發(fā)現(xiàn)ARR2可通過(guò)Myb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與TGA3互作,進(jìn)而通過(guò)結(jié)合植物防御相關(guān)基因啟動(dòng)子的ACGTCATAGA基序來(lái)調(diào)控的表達(dá)。這些展現(xiàn)了ARRs類轉(zhuǎn)錄因子對(duì)下游基因的調(diào)控作用以及Myb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)RRs類轉(zhuǎn)錄因子功能的重要影響。在本研究中,‘LGR’與‘MR-1’的()共有5處SNP差異,其中僅有無(wú)義突變?cè)诘鞍坠δ芙Y(jié)構(gòu)域中發(fā)生,造成‘LGR’中MELO3C003375(CmAPRR2)的Myb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域大部分缺失。類似地,OREN等[8]在甜瓜‘Tam Dew’中也發(fā)現(xiàn)了相同的無(wú)義突變,并且通過(guò)等位性測(cè)驗(yàn)證實(shí)了該變異是造成‘Tam Dew’幼果淺色的原因?;贛yb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的功能特點(diǎn),猜測(cè)該無(wú)義突變會(huì)導(dǎo)致MELO3C003375(CmAPRR2)蛋白無(wú)法識(shí)別和結(jié)合下游基因,進(jìn)而無(wú)法調(diào)控色素代謝,以致產(chǎn)生淺綠色果皮。對(duì)于APRR2或者ARRs類轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控色素相關(guān)基因的方式(直接或者有其他基因介導(dǎo)),暫時(shí)未有相關(guān)深入的研究。鑒于擬南芥中轉(zhuǎn)座酶類的轉(zhuǎn)錄因子FHY3和FAR1,以及ABRE類轉(zhuǎn)錄因子ABF2、ABF3和ABF4常通過(guò)直接調(diào)節(jié)葉綠素代謝途徑中的結(jié)構(gòu)基因來(lái)影響葉綠素水平[31-32],推測(cè)()通過(guò)直接調(diào)控色素代謝途徑中的結(jié)構(gòu)基因來(lái)影響幼果果皮顏色,而缺失了Myb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的MELO3C003375(CmAPRR2)則極有可能因?yàn)闊o(wú)法直接識(shí)別與結(jié)合結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子,進(jìn)而無(wú)法調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因表達(dá),造成‘LGR’無(wú)法積累色素,產(chǎn)生淺綠色幼果。

    作為對(duì)消費(fèi)者有吸引力的性狀,果皮顏色一直是甜瓜育種的重要目標(biāo)。相較于成熟果,幼嫩果實(shí)顏色相對(duì)單一,主要由葉綠素影響。但成熟果與幼嫩果實(shí)之間是否存在關(guān)聯(lián)性,研究卻很少涉及。本研究中,兩親本幼嫩果果皮顏色差異明顯,定位群體(BC1F1)單株表型也分離顯著,隨著發(fā)育進(jìn)程,親本以及單株果皮顏色發(fā)生變化,但有趣的是,淺綠皮植株和深綠皮成熟果果皮顏色的綠色強(qiáng)度卻形成了顯著的差異分化,這表明即使果實(shí)在發(fā)育過(guò)程中會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)變,但成熟果果皮顏色仍然與幼嫩果果皮顏色存在緊密的相關(guān)性,該結(jié)論為未來(lái)進(jìn)行甜瓜外觀品質(zhì)育種提供了思路。另外,本研究發(fā)現(xiàn)在BC1F1群體幼果為深綠皮的植株中,部分單株的成熟果會(huì)表現(xiàn)出黃色,而部分單株仍然表現(xiàn)為深綠色。這表明雖然成熟果顏色與幼果顏色有顯著相關(guān)性,但兩者之間的內(nèi)在聯(lián)系以及它們與果實(shí)發(fā)育進(jìn)程之間的關(guān)系還需進(jìn)一步的探索和解析。這為后續(xù)進(jìn)行成熟果的相關(guān)研究提供了思路,也暗示選擇合適時(shí)期的材料對(duì)果實(shí)皮色的研究十分重要。

    4 結(jié)論

    甜瓜幼果果皮顏色(深綠和淺綠)是受單個(gè)核基因控制的質(zhì)量性狀,且深綠對(duì)淺綠為顯性。通過(guò)遺傳定位將該定位于4號(hào)染色體分子標(biāo)記4-102和4-81之間,物理距離約為17.7 kb。此區(qū)間內(nèi)()的第8個(gè)外顯子在‘LGR’中發(fā)生單堿基替換(G856T),造成蛋白翻譯提前終止,推測(cè)()即為調(diào)控甜瓜幼果果皮顏色的基因。

    [1] TADMOR Y, BURGER J, YAAKOV I, FEDER A, LIBHABER S E, PORTNOY V, MEIR A, TZURI G, SA’AR U, ROGACHEV I, AHARONI A, ABELIOVICH H, SCHAFFER A A, LEWINSOHN E, KATZIR N. Genetics of flavonoid, carotenoid, and chlorophyll pigments in melon fruit rinds. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(19): 10722-10728.

    [2] GUSMINI G, WEHNER T C. Genes determining rind pattern inheritance in watermelon: A review. HortScience, 2005, 40(6): 1928-1930.

    [3] WHITAKER T W, DAVIS G N. Cucurbits: Botany, cultivation and utilization. Journal of Association of Official Agricultural Chemists, 1962, 45(4): 1052.

    [4] PARTHASARATHY V A, SAMBANDAM C N. Inheritance in Indian melons. Indian Journal of Genetics and Plant Breeding, 1981, 41(1): 114-117.

    [5] KUBICKI B. Inheritance of some characters in muskmelons. Genetiea Polonlca, 1962, 3: 265-274.

    [6] PEREIRA L, RUGGIERI V, PéREZ S, ALEXIOU K G, FERNáNDEZ M, JAHRMANN T, PUJOL M, GARCIA-MAS J. QTL mapping of melon fruit quality traits using a high-density GBS-based genetic map. BMC Plant Biology, 2018, 18(1): 324.

    [7] BURGER Y, BHASTEKER D, SA’AR U, KATZIR N, PARIS H S. A recessive gene for light immature exterior color of melon. Cucurbit Genetics Cooperative Report, 2006, 28/29: 17-18.

    [8] OREN E, TZURI G, VEXLER L, DAFNA A, MEIR A, FAIGENBOIM A, KENIGSWALD M, PORTNOY V, SCHAFFER A A, LEVI A, BUCKLER E S, KATZIR N, BURGER J, TADMOR Y, GUR A. The multi-allelic APRR2 gene is associated with fruit pigment accumulation in melon and watermelon. Journal of Experimental Botany, 2019, 70(15): 3781-3794.

    [9] HUGHES M. The inheritance of two characters ofand their interrelationship. Journal of the American Aociety for Horticultural Science, 1948, 52: 399-402.

    [10] FEDER A, BURGER J, GAO S, LEWINSOHN E, KATZIR N, SCHAFFER A A, MEIR A, DAVIDOVICH-RIKANATI R, PORTNOY V, GAL-ON A, FEI Z J, KASHI Y, TADMOR Y. A kelch domain- containing F-box coding gene negatively regulates flavonoid accumulation in muskmelon. Plant Physiology, 2015, 169(3): 1714-1726.

    [11] EDUARDO I, ARúS P, MONFORTE A J, OBANDO J, FERNANDEZ-TRUJILLO J P, MARTINEZ J A, ALARCóN A L, ALVAREZ J M, VAN DER KNAAP E. Estimating the genetic architecture of fruit quality traits in melon (L.) using a genomic library of near-isogenic lines. Journal of the American Society for Horticultural Science, 2007, 132(1): 80-89.

    [12] OBANDO J, FERNáNDEZ-TRUJILLO J P, MARTíNEZ J A, ALARCóN A L, EDUARDO I, ARúS P, MONFORTE A J. Identification of melon fruit quality quantitative trait loci using near-isogenic lines. Journal of the American Society for Horticultural Science, 2008, 133(1): 139-151.

    [13] PITRAT M, HANELT P, HAMMER K. Some comments on infraspecific classification of cultivars of melon. Acta Horticulturae, 2000, 510: 29-36.

    [14] 林德佩. 中國(guó)栽培甜瓜植物的起源、分類及進(jìn)化. 中國(guó)瓜菜, 2010(4): 34-36.

    LIN D P. Origin classification and evolution for cultivated plants of Chinese melon. China Cucurbits and Vegetables, 2010(4): 34-36. (in Chinese)

    [15] LIU H Q, JIAO J Q, LIANG X J, LIU J, MENG H W, CHEN S X, LI Y H, CHENG Z H. Map-based cloning, identification and characterization of the w gene controlling white immature fruit color in cucumber (L.). Theoretical and Applied Genetics, 2016, 129(7): 1247-1256.

    [16] PAN Y, BRADLEY G, PYKE K, BALL G, LU C G, FRAY R, MARSHALL A, JAYASUTA S, BAXTER C, VAN WIJK R, BOYDEN L, CADE R, CHAPMAN N H, FRASER P D, HODGMAN C, SEYMOUR G B. Network inference analysis identifies an APRR2-like gene linked to pigment accumulation in tomato and pepper fruits. Plant Physiology, 2013, 161(3): 1476-1485.

    [17] 賈繼增, 高麗鋒, 趙光耀, 周文斌, 張衛(wèi)健. 作物基因組學(xué)與作物科學(xué)革命. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48(17): 3316-3332.

    JIA J Z, GAO L F, ZHAO G Y, ZHOU W B, ZHANG W J. Crop genomics and crop science revolutions. Scientia Agricultura Sinica, 2015, 48(17): 3316-3332. (in Chinese)

    [18] ZHAO G W, LIAN Q, ZHANG Z H, FU Q S, HE Y H, MA S W, RUGGIERI V, MONFORTE A J, WANG P Y, JULCA I, WANG H S, LIU J P, XU Y, WANG R Z, JI J B, XU Z H, KONG W H, ZHONG Y, SHANG J L, PEREIRA L, ARGYRIS J, ZHANG J A, MAYOBRE C, PUJOL M, OREN E, OU D D, WANG J M, SUN D X, ZHAO S J, ZHU Y C, LI N, KATZIR N, GUR A, DOGIMONT C, SCHAEFER H, FAN W, BENDAHMANE A, FEI Z J, PITRAT M, GABALDóN T, LIN T, GARCIA-MAS J, XU Y Y, HUANG S W. A comprehensive genome variation map of melon identifies multiple domestication events and loci influencing agronomic traits. Nature Genetics, 2019, 51(11): 1607-1615.

    [19] 楊光華, 范榮, 楊小鋒, 侯軍亮, 袁士臣, 曹明, 王學(xué)林, 李勁松. 甜瓜果實(shí)顏色3個(gè)質(zhì)量性狀基因的定位. 園藝學(xué)報(bào), 2014, 41(5): 898-906.

    YANG G H, FAN R, YANG X F, HOU J L, YUAN S C, CAO M, WANG X L, LI J S. Construction of a highly dense genetic map using SNP and mapping of three qualitative traits in. Acta Horticulturae Sinica, 2014, 41(5): 898-906. (in Chinese)

    [20] 歐點(diǎn)點(diǎn), 趙光偉, 賀玉花, 王平勇, 徐志紅, 孔維虎, 張健, 徐永陽(yáng). 甜瓜果皮顏色遺傳分析及基因定位. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2019, 35(13): 64-69.

    OU D D, ZHAO G W, HE Y H, WANG P Y, XU Z H, KONG W H, ZHANG J A, XU Y Y. Genetic analysis and gene mapping for melon rind color. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2019, 35(13): 64-69. (in Chinese)

    [21] FALLIK E, ALKALI-TUVIA S, HOREV B, COPEL A, RODOV V, AHARONI Y, ULRICH D, SCHULZ H. Characterization of ‘Galia’ melon aroma by GC and mass spectrometric sensor measurements after prolonged storage. Postharvest Biology and Technology, 2001, 22(1): 85-91.

    [22] REID M S, LEE T H, PRATT H K, CHICHESTER C O. Chlorophyll and carotenoid changes in developing muskmelons. Journal of the American Society for Horticultural Science, 1970, 95(6): 814-815.

    [23] FLüGEL M, GROSS J. Pigment and plastid changes in mesocarp and exocarp of ripening muskmeloncv. Galia. Angewandte Botanik, 1982, 56(5/6): 393-406.

    [24] LIGHTBOURN G J, GRIESBACH R J, NOVOTNY J A, CLEVIDENCE B A, RAO D D, STOMMEL J R. Effects of anthocyanin and carotenoid combinations on foliage and immature fruit color ofL. Journal of Heredity, 2008, 99(2): 105-111.

    [25] CHEN M, JI M L, WEN B B, LIU L, LI S X, CHEN X D, GAO D S, LI L. GOLDEN 2-LIKE transcription factors of plants. Frontiers in Plant Science, 2016, 7: 1509.

    [26] WATERS M T, MOYLAN E C, LANGDALE J A. GLK transcription factors regulate chloroplast development in a cell-autonomous manner. The Plant Journal, 2008, 56(3): 432-444.

    [27] WATERS M T, WANG P, KORKARIC M, CAPPER R G, SAUNDERS N J, LANGDALE J A. GLK transcription factors coordinate expression of the photosynthetic apparatus in. The Plant Cell, 2009, 21(4): 1109-1128.

    [28] MASON M G, MATHEWS D E, ARGYROS D A, MAXWELL B B, KIEBER J J, ALONSO J M, ECKER J R, SCHALLER G E. Multiple type-B response regulators mediate cytokinin signal transduction in. The Plant Cell, 2005, 17(11): 3007-3018.

    [29] ARGYROS R D, MATHEWS D E, CHIANG Y H, PALMER C M, THIBAULT D M, ETHERIDGE N, ARGYROS D A, MASON M G, KIEBER J J, SCHALLER G E. Type B response regulators ofplay key roles in cytokinin signaling and plant development. The Plant Cell, 2008, 20(8): 2102-2116.

    [30] CHOI J, HUH S U, KOJIMA M, SAKAKIBARA H, PAEK K H, HWANG I. The cytokinin-activated transcription factor ARR2 promotes plant immunity via TGA3/NPR1-dependent salicylic acid signaling in. Developmental Cell, 2010, 19: 284-295.

    [31] TANG W J, WANG W Q, CHEN D Q, JI Q A, JING Y J, WANG H Y, LIN R C. Transposase-derived proteins FHY3/FAR1 interact with PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR1 to regulate chlorophyll biosynthesis by modulating HEMB1 during deetiolation in. The Plant Cell, 2012, 24(5): 1984-2000.

    [32] GAO S, GAO J, ZHU X Y, SONG Y, LI Z P, REN G D, ZHOU X, KUAI B K. ABF2, ABF3, and ABF4promote ABA-mediated chlorophyll degradation and leaf senescence by transcriptional activation of chlorophyll catabolic genes and senescence-associated genes in. Molecular Plant, 2016, 9(9): 1272-1285.

    Fine Mapping of an Immature Rind Color Genein Melon

    XU XinYang, SHEN Jia, ZHANG YueJian, LI GuoJing, NIU XiaoWei, SHOU WeiSong

    Institute of Vegetables, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021

    【】The aim of this study was to explore the inheritance pattern of immature rind color of melon(L.), to fine map target gene, and to deepen the understanding of rind color change during fruit growth, so as to provide a guidance for the improvement of melon color with molecular design breeding.【】The dark-green rind line ‘MR-1’ (.ssp.) and the light-green rind line ‘LGR’ (C.ssp.) were used as parents to construct the F1hybrid population, and the BC1F1backcross population was constructed from crossing by F1and ‘LGR’ for genetic analysis of immature rind color. By selecting 20 dark-green and light-green plants each in BC1F1population, the DNA was mixed, respectively, and the BSA-seq was operated for initial mapping. Based on the resequencing of two parents, the molecular markers with better specificity were developed in the initial region and recombinant individuals were identified and selected to verify and narrow the interval for fine mapping thegene. By sequencing of coding regions between two parents according to the gene annotation, the candidate gene and key variant site were determined. Moreover, the phenotype of immature and mature fruit in the BC1F1backcross population was investigated and assessed by correlation analysis to explore the underlying mechanism of rind color transition in the fruit development.【】According to the investigation, the phenotype of all F1individual plants exhibited dark-green rind color. In addition, the immature rind color of BC1F1 backcross population was found to be separated, and the ratio of the number of dark-green to light-green was approximately 1﹕1. As well as, the ratio of the number of dark-green to light-green in the F2population was 3﹕1. These ratios corresponded to Mendel’s law of inheritance, indicating that the immature rind color of melon was a quality trait, controlled by a single nuclear gene, and the dark-green was dominant to light-green. Through BSA-seq, the gene was initially mapped to a 1.8 Mb interval on the long arm of chromosome 4. With developed molecular markers, 24 recombinant individuals were selected in expanded mapping population. The gene was further narrowed down to a region between markers 4-102 and 4-81 with a physical distance of 17.7 kb by genotype and phenotype verification of offspring, where were four predicted genes with latest annotation. Sequencing analysis revealed that a geneencoding GLKs transcription factor CmAPRR2 had several variations in ‘MR-1’ and ‘LGR’. Among them, there were three synonymous, a missense mutation, and a nonsense mutation. The nonsense mutation (G to T) appeared in the 856th base of the coding region led to premature translation termination and most of the Myb-DNA binding domain to be lost in ‘LGR’. Thus, the() was speculated to be thegene and the nonsense mutation was the key variation that affected the immature rind color of melon. It was found that there was a significant correlation between the rind color of immature fruit and mature fruit by investigating the phenotype of fruits in the BC1F1backcross population.【】Immature rind color (dark green/light green) of melon was a quality trait and controlled by a single nuclear gene. By mapping,() was presumed to be the candidate gene that affected immature rind color.

    melon; immature rind color; gene mapping;;()

    10.3864/j.issn.0578-1752.2021.15.014

    2020-09-20;

    2020-12-16

    浙江省第三次全國(guó)農(nóng)作物種質(zhì)資源普查與收集行動(dòng)(111821301354052030)、浙江省農(nóng)業(yè)(蔬菜)新品種選育重大科技專項(xiàng)(2016C02051-4-4)

    許昕陽(yáng),E-mail:shine2014201048@163.com。通信作者壽偉松,E-mail:shouws@zaas.ac.cn

    (責(zé)任編輯 趙伶俐)

    猜你喜歡
    幼果親本果皮
    果皮清新劑
    甘蔗親本農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)與分析
    果樹(shù)幼果期 注意防控這些病蟲(chóng)害
    梨幼果春季低溫霜凍調(diào)查
    別亂丟果皮
    幾種蘋果砧木實(shí)生后代與親本性狀的相關(guān)性
    不亂扔果皮
    云瑞10系列生產(chǎn)性創(chuàng)新親本2種方法評(píng)價(jià)
    蘋果幼果多酚對(duì)草魚片保鮮效果的研究
    油用向日葵親本繁殖及雜交制種技術(shù)
    国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产精品 国内视频| 久99久视频精品免费| 高清在线国产一区| 美女国产高潮福利片在线看| 美女大奶头视频| 女性生殖器流出的白浆| 精品欧美国产一区二区三| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 一级黄色大片毛片| 香蕉av资源在线| 日韩av在线大香蕉| 久久伊人香网站| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 一区二区三区高清视频在线| 国产亚洲欧美在线一区二区| 宅男免费午夜| 久久久久久久精品吃奶| 日本三级黄在线观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 在线观看一区二区三区| 搡老妇女老女人老熟妇| 两人在一起打扑克的视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产黄a三级三级三级人| 成年人黄色毛片网站| 中文在线观看免费www的网站 | 日韩欧美一区二区三区在线观看| 日韩高清综合在线| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 一进一出好大好爽视频| 成年人黄色毛片网站| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 欧美性猛交黑人性爽| 中文字幕人妻熟女乱码| 看黄色毛片网站| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 人人妻人人澡人人看| 脱女人内裤的视频| 韩国精品一区二区三区| 国产亚洲欧美在线一区二区| 欧美黄色淫秽网站| av电影中文网址| 国产av在哪里看| 亚洲av电影在线进入| 久久这里只有精品19| 看黄色毛片网站| 久久久久亚洲av毛片大全| 色综合站精品国产| 成人国语在线视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 婷婷亚洲欧美| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 曰老女人黄片| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 色播亚洲综合网| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产精品98久久久久久宅男小说| 婷婷六月久久综合丁香| 香蕉国产在线看| 两个人看的免费小视频| 亚洲专区中文字幕在线| 欧美日韩乱码在线| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产精品免费视频内射| 长腿黑丝高跟| 免费在线观看亚洲国产| 欧美国产精品va在线观看不卡| 精华霜和精华液先用哪个| 精品免费久久久久久久清纯| 色尼玛亚洲综合影院| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产主播在线观看一区二区| 成年人黄色毛片网站| 免费观看精品视频网站| 亚洲精品在线观看二区| 成人午夜高清在线视频 | 在线天堂中文资源库| 国产极品粉嫩免费观看在线| 欧美乱色亚洲激情| 日韩精品免费视频一区二区三区| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 十分钟在线观看高清视频www| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 欧美三级亚洲精品| 成人亚洲精品一区在线观看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 久久香蕉精品热| 深夜精品福利| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 757午夜福利合集在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 又大又爽又粗| 麻豆一二三区av精品| 欧美又色又爽又黄视频| a级毛片在线看网站| 91大片在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| www日本黄色视频网| 在线永久观看黄色视频| 欧美又色又爽又黄视频| av在线播放免费不卡| 成人亚洲精品一区在线观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 久热这里只有精品99| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 99国产极品粉嫩在线观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 99国产精品一区二区蜜桃av| 午夜免费鲁丝| 99国产极品粉嫩在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 精品久久久久久成人av| 悠悠久久av| 日韩视频一区二区在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 午夜激情av网站| 国产一卡二卡三卡精品| 一进一出抽搐动态| 日本熟妇午夜| 久久中文看片网| 亚洲人成电影免费在线| 超碰成人久久| 国产精品av久久久久免费| 麻豆国产av国片精品| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲精品在线观看二区| 这个男人来自地球电影免费观看| 成人精品一区二区免费| 男人舔女人下体高潮全视频| 真人一进一出gif抽搐免费| 99国产精品99久久久久| 一区二区日韩欧美中文字幕| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 这个男人来自地球电影免费观看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲av片天天在线观看| 黄色片一级片一级黄色片| 村上凉子中文字幕在线| 在线永久观看黄色视频| 一夜夜www| 精品一区二区三区四区五区乱码| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国语自产精品视频在线第100页| 色在线成人网| 啪啪无遮挡十八禁网站| 日韩大尺度精品在线看网址| 男女午夜视频在线观看| 国产精品久久视频播放| 精品国产国语对白av| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 欧美zozozo另类| 久久人妻av系列| 波多野结衣高清无吗| 亚洲七黄色美女视频| 精品久久久久久久久久久久久 | 这个男人来自地球电影免费观看| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 一本一本综合久久| 色老头精品视频在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 成人国语在线视频| 国产高清视频在线播放一区| 午夜福利在线观看吧| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产av一区二区精品久久| 99在线视频只有这里精品首页| 国产精品野战在线观看| 精品电影一区二区在线| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 麻豆国产av国片精品| 国产精品一区二区免费欧美| 国产精品免费视频内射| 一区福利在线观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 少妇的丰满在线观看| 精品高清国产在线一区| 女同久久另类99精品国产91| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产黄色小视频在线观看| 国产97色在线日韩免费| 亚洲国产欧美网| 欧美av亚洲av综合av国产av| 老鸭窝网址在线观看| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 黄色成人免费大全| 国产精品精品国产色婷婷| 国产精品久久电影中文字幕| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产精品久久久久久精品电影 | 男女做爰动态图高潮gif福利片| 中文字幕人妻熟女乱码| 熟女电影av网| 色播亚洲综合网| 国产1区2区3区精品| av欧美777| 女警被强在线播放| 熟女电影av网| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 久久人妻av系列| 无遮挡黄片免费观看| 十八禁人妻一区二区| 国产亚洲精品一区二区www| 久久天堂一区二区三区四区| 女人被狂操c到高潮| 亚洲三区欧美一区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 国产av在哪里看| 俺也久久电影网| 国产亚洲精品av在线| 国产精品久久久久久精品电影 | 国产精品久久久人人做人人爽| 99热6这里只有精品| 精品不卡国产一区二区三区| 午夜亚洲福利在线播放| 成人欧美大片| 国产一区在线观看成人免费| 国产精品九九99| 亚洲av五月六月丁香网| 国产精品国产高清国产av| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 女性生殖器流出的白浆| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 精品卡一卡二卡四卡免费| 手机成人av网站| 无遮挡黄片免费观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产日本99.免费观看| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 黄色成人免费大全| 午夜免费观看网址| 国产色视频综合| 九色国产91popny在线| 国产三级在线视频| 久久午夜亚洲精品久久| 国产乱人伦免费视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | www.精华液| 日本五十路高清| 成人手机av| 亚洲一区中文字幕在线| 色在线成人网| 一级作爱视频免费观看| 国产一区二区三区视频了| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 亚洲av成人一区二区三| 久久久久久国产a免费观看| 日韩欧美国产在线观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 在线观看免费午夜福利视频| 动漫黄色视频在线观看| 麻豆av在线久日| 91九色精品人成在线观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲第一电影网av| 一区二区日韩欧美中文字幕| 色av中文字幕| 亚洲欧美日韩无卡精品| 成年免费大片在线观看| www.自偷自拍.com| 国产真实乱freesex| 一二三四在线观看免费中文在| 91av网站免费观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产成人啪精品午夜网站| 村上凉子中文字幕在线| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 免费人成视频x8x8入口观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 91成年电影在线观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 成人三级黄色视频| a在线观看视频网站| 国产精品精品国产色婷婷| 国产高清有码在线观看视频 | 成人国语在线视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 一级作爱视频免费观看| 成人av一区二区三区在线看| 精品欧美国产一区二区三| 麻豆成人av在线观看| 成人午夜高清在线视频 | 一边摸一边抽搐一进一小说| av免费在线观看网站| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲人成77777在线视频| 久久青草综合色| 久久精品国产清高在天天线| 在线播放国产精品三级| 欧美在线黄色| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 最好的美女福利视频网| 国产日本99.免费观看| 午夜福利高清视频| av福利片在线| 少妇粗大呻吟视频| 久99久视频精品免费| 国产一区二区三区视频了| 高清毛片免费观看视频网站| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 中文资源天堂在线| 日韩视频一区二区在线观看| 中文资源天堂在线| 香蕉丝袜av| 欧美日本视频| 听说在线观看完整版免费高清| 一级毛片高清免费大全| 久久久久久久午夜电影| 午夜日韩欧美国产| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 韩国av一区二区三区四区| 久久久久久国产a免费观看| 脱女人内裤的视频| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 欧美最黄视频在线播放免费| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 看免费av毛片| 在线天堂中文资源库| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 日韩欧美三级三区| 免费观看精品视频网站| 亚洲中文av在线| 久久青草综合色| 亚洲av成人av| 国产激情欧美一区二区| 久久久久久大精品| 一本综合久久免费| 成人午夜高清在线视频 | 1024手机看黄色片| 久久久久久人人人人人| 国产成人av教育| 18禁观看日本| 国产视频内射| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产精品亚洲av一区麻豆| av天堂在线播放| 美女 人体艺术 gogo| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 99久久精品国产亚洲精品| 国产男靠女视频免费网站| 久久这里只有精品19| 国产精品影院久久| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲欧美激情综合另类| 成人三级黄色视频| www.精华液| 久久99热这里只有精品18| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产91精品成人一区二区三区| 黄色丝袜av网址大全| 一进一出好大好爽视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 亚洲av第一区精品v没综合| 不卡av一区二区三区| 亚洲av熟女| 欧美不卡视频在线免费观看 | 欧美大码av| 一进一出好大好爽视频| 精品日产1卡2卡| 久久久久久人人人人人| 国内精品久久久久久久电影| 久久精品人妻少妇| 国产精华一区二区三区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产精品久久视频播放| 不卡一级毛片| 女警被强在线播放| 波多野结衣av一区二区av| 国产日本99.免费观看| 精品久久久久久,| 特大巨黑吊av在线直播 | 在线观看日韩欧美| 一本大道久久a久久精品| 国产免费av片在线观看野外av| 国产精华一区二区三区| 一本大道久久a久久精品| 十八禁网站免费在线| 欧美成人免费av一区二区三区| 好男人电影高清在线观看| 男人的好看免费观看在线视频 | 亚洲在线自拍视频| 99re在线观看精品视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 欧美成人性av电影在线观看| 国产黄片美女视频| 男人的好看免费观看在线视频 | 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲国产欧美网| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 日韩欧美 国产精品| 国产成人av教育| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲精品色激情综合| 一级毛片女人18水好多| 淫秽高清视频在线观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 午夜免费激情av| 欧美亚洲日本最大视频资源| 99久久国产精品久久久| 亚洲国产精品999在线| www.精华液| 99热只有精品国产| 成人精品一区二区免费| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产区一区二久久| 男人舔女人下体高潮全视频| 男女那种视频在线观看| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 欧美一级a爱片免费观看看 | 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产真人三级小视频在线观看| 成人18禁在线播放| 在线天堂中文资源库| 在线观看舔阴道视频| а√天堂www在线а√下载| 久久国产精品影院| 亚洲成人久久爱视频| 久久国产乱子伦精品免费另类| 老司机福利观看| 91麻豆精品激情在线观看国产| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 哪里可以看免费的av片| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲国产精品成人综合色| 午夜两性在线视频| 中文字幕精品亚洲无线码一区 | 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 美女午夜性视频免费| 久久人妻av系列| 久久久久久久午夜电影| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 韩国精品一区二区三区| 美女扒开内裤让男人捅视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| videosex国产| 亚洲中文日韩欧美视频| 一二三四社区在线视频社区8| 男女那种视频在线观看| 1024香蕉在线观看| 久久 成人 亚洲| 日本免费a在线| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 日本一区二区免费在线视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 怎么达到女性高潮| 性色av乱码一区二区三区2| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 欧美日韩福利视频一区二区| 美女大奶头视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产精品99久久99久久久不卡| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲美女黄片视频| 九色国产91popny在线| 亚洲av电影在线进入| 老司机在亚洲福利影院| 欧美日韩福利视频一区二区| 精品国产一区二区三区四区第35| 日韩大尺度精品在线看网址| 51午夜福利影视在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 免费在线观看亚洲国产| 丰满的人妻完整版| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 亚洲第一电影网av| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产乱人伦免费视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产在线观看jvid| 91老司机精品| 性色av乱码一区二区三区2| 一区二区三区激情视频| 在线看三级毛片| 丰满的人妻完整版| 亚洲午夜理论影院| 日韩高清综合在线| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 亚洲无线在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 麻豆国产av国片精品| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 精品一区二区三区av网在线观看| 午夜亚洲福利在线播放| 国产一区二区三区视频了| 久久久国产成人精品二区| 日韩欧美三级三区| 国产免费男女视频| 欧美乱妇无乱码| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 淫妇啪啪啪对白视频| 丝袜美腿诱惑在线| 日韩中文字幕欧美一区二区| 女人被狂操c到高潮| 国产一卡二卡三卡精品| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 精品国产乱子伦一区二区三区| 日本a在线网址| 妹子高潮喷水视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 在线天堂中文资源库| 手机成人av网站| 日本一区二区免费在线视频| 黄色女人牲交| 午夜日韩欧美国产| 午夜免费激情av| 久久国产乱子伦精品免费另类| 久久久久久久久免费视频了| 欧美日韩乱码在线| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 精品福利观看| 亚洲欧美激情综合另类| 在线免费观看的www视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲欧美日韩无卡精品| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲一码二码三码区别大吗| 好男人电影高清在线观看| 黄色丝袜av网址大全| 俄罗斯特黄特色一大片| 精品国产亚洲在线| 人妻久久中文字幕网| 国产午夜精品久久久久久| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲,欧美精品.| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 午夜福利欧美成人| 热re99久久国产66热| 这个男人来自地球电影免费观看| 无遮挡黄片免费观看| 免费观看精品视频网站| a级毛片在线看网站| 国产男靠女视频免费网站| 精品久久久久久久久久免费视频| 99国产精品一区二区蜜桃av| 男人舔奶头视频| 中文字幕最新亚洲高清| 精品免费久久久久久久清纯| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 久久久久国产一级毛片高清牌| 久久精品影院6| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产视频内射| 老汉色av国产亚洲站长工具| av免费在线观看网站| 十分钟在线观看高清视频www| 国产av不卡久久| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 成年免费大片在线观看| 国产av不卡久久| 少妇 在线观看| 亚洲成国产人片在线观看| 久久香蕉国产精品| 一边摸一边做爽爽视频免费| 精品午夜福利视频在线观看一区| 91成年电影在线观看| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲avbb在线观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产成人欧美| 日本在线视频免费播放| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 日韩精品免费视频一区二区三区| 9191精品国产免费久久| 最近在线观看免费完整版| 丰满的人妻完整版| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 三级毛片av免费| 国产精品二区激情视频| 亚洲色图av天堂| 欧美中文日本在线观看视频|