甜瓜幼果果皮顏色基因GR的精細(xì)定位

許昕陽(yáng)，沈佳，張躍建，李國(guó)景，牛曉偉，壽偉松

甜瓜幼果果皮顏色基因的精細(xì)定位

許昕陽(yáng)，沈佳，張躍建，李國(guó)景，牛曉偉，壽偉松

浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，杭州 310021

【】探究甜瓜幼果果皮顏色性狀的遺傳規(guī)律，精細(xì)定位目標(biāo)性狀基因，加深對(duì)甜瓜發(fā)育過(guò)程中果皮顏色轉(zhuǎn)變的認(rèn)知，為開(kāi)展甜瓜果皮顏色的分子設(shè)計(jì)育種奠定基礎(chǔ)。以幼果深綠皮的薄皮甜瓜純系‘MR-1’和幼果淺綠皮的厚皮甜瓜純系‘LGR’為親本，構(gòu)建F1正反交群體；以及利用F1與淺綠皮親本‘LGR’雜交構(gòu)建BC1F1回交群體，對(duì)甜瓜幼果果皮顏色基因（）進(jìn)行遺傳分析。選取BC1F1群體中深綠皮和淺綠皮單株各20株，混池其DNA進(jìn)行BSA-seq以獲取初定位區(qū)間?；凇甅R-1’和‘LGR’兩親本的重測(cè)序數(shù)據(jù)，開(kāi)發(fā)初定位區(qū)段內(nèi)特異性較好的分子標(biāo)記，鑒定篩選擴(kuò)大群體（BC1F1和F2）中的重組交換單株，驗(yàn)證和縮小定位區(qū)間，實(shí)現(xiàn)精細(xì)定位。將兩親本定位區(qū)段內(nèi)注釋基因的編碼區(qū)進(jìn)行測(cè)序以確定候選基因和關(guān)鍵變異位點(diǎn)。通過(guò)調(diào)查BC1F1回交群體中幼果果皮顏色和成熟果果皮顏色，利用相關(guān)性分析探究果皮顏色轉(zhuǎn)變?cè)谔鸸习l(fā)育過(guò)程中的內(nèi)在聯(lián)系。通過(guò)分析F1群體果皮顏色發(fā)現(xiàn)所有F1單株幼果都表現(xiàn)為深綠皮。另外，BC1F1群體單株幼果果皮顏色會(huì)發(fā)生分離，其中深綠皮單株數(shù)﹕淺綠皮單株數(shù)約等于1﹕1，以及F2群體中深綠皮植株與淺綠皮植株的分離比為3﹕1。這些分離比都符合孟德?tīng)栠z傳定律，表明幼果果皮顏色是受單個(gè)核基因控制的質(zhì)量性狀，并且深綠對(duì)淺綠為顯性。通過(guò)BSA-seq分析將基因初步定位于4號(hào)染色體長(zhǎng)臂，物理距離為1.8 Mb的范圍內(nèi)。利用開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記在擴(kuò)大的定位群體中共篩選到24個(gè)重組交換單株。經(jīng)過(guò)后代基因型和表型驗(yàn)證，最終將精細(xì)定位在標(biāo)記4-102和4-81之間約17.7 kb的范圍內(nèi)，區(qū)段內(nèi)共包含4個(gè)注釋基因。經(jīng)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)一個(gè)編碼GLKs類轉(zhuǎn)錄因子CmAPRR2的基因在親本‘MR-1’和‘LGR’中存在多處變異，其中有3處發(fā)生了同義突變，1處錯(cuò)義突變和1處無(wú)義突變。無(wú)義突變出現(xiàn)在的編碼區(qū)第856位堿基處（由G變成T），導(dǎo)致親本‘LGR’中蛋白翻譯提前終止，其Myb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域大部分缺失，推測(cè)基因（）即為影響甜瓜幼果果皮顏色的基因，而第856位的單堿基替換造成的無(wú)義突變即為關(guān)鍵變異位點(diǎn)。此外，BC1F1回交群體單株的表型調(diào)查結(jié)果顯示幼果與成熟果的果皮顏色之間存在顯著相關(guān)性。甜瓜幼果果皮顏色（深綠/淺綠）性狀為質(zhì)量性狀，受單個(gè)核基因控制。通過(guò)遺傳定位手段推斷（）為最有可能影響甜瓜幼果果皮顏色的候選基因。

甜瓜；幼果果皮顏色；基因定位；；（）

0 引言

【研究意義】甜瓜（L.）是我國(guó)重要的園藝和經(jīng)濟(jì)作物。果皮顏色作為甜瓜最直觀的外觀品質(zhì)性狀，直接影響其商品價(jià)值和消費(fèi)者的選擇，開(kāi)展甜瓜果皮顏色性狀的遺傳研究對(duì)甜瓜育種有重要意義。【前人研究進(jìn)展】瓜類植物的果皮顏色調(diào)節(jié)開(kāi)始于果實(shí)發(fā)育的早期，在幼果期表現(xiàn)為綠色，反映的是葉綠素含量[1]。隨著果實(shí)發(fā)育的進(jìn)行，甜瓜外果皮顏色在成熟過(guò)程中會(huì)發(fā)生較大轉(zhuǎn)變[2]。成熟甜瓜果皮顏色豐富多樣，主要有白色、黃色、橙色、綠色以及多種顏色混雜或者斑紋類型。早期對(duì)甜瓜果皮顏色是由單基因或者多基因控制存在較大的爭(zhēng)議，但該爭(zhēng)議多基于不同品種間組合的差異[3-4]。KUBICKI[5]認(rèn)為幼果果皮白色對(duì)綠色為顯性，并且是受單基因遺傳控制。PEREIRA等[6]通過(guò)構(gòu)建‘Védrantais’和‘Piel de Sapo’的高密度GBS遺傳圖譜發(fā)現(xiàn)淺皮為顯性性狀，并且將該基因定位在7號(hào)染色體，該位置與相近，推測(cè)為同一個(gè)基因。BURGER等[7]利用兩個(gè)雜交群體：深皮‘Dulce’和淺皮‘TAM-Dew’，深綠‘Krymka’和淺綠‘Eshkolit Ha’Amaqim’探究甜瓜幼果果皮顏色遺傳模式時(shí)發(fā)現(xiàn)淺皮親本受隱性單基因控制，并且該基因與之前報(bào)道的淺皮顯性基因不等位。OREN等[8]利用‘Tam Dew’和‘Dulce’的重組自交系以及‘Dulce’和‘Noy Amid’的F3:4家系將一個(gè)影響甜瓜幼果果皮顏色的基因定位在4號(hào)染色體上290 kb的區(qū)段內(nèi)，后通過(guò)差異性分析確定基因是影響該幼果果皮顏色的基因。在成熟果中，HUGHES[9]發(fā)現(xiàn)‘Honeydew’品種的白色相對(duì)于‘Smiths’ Perfect cantaloupe’品種的綠色為隱性。TADMOR等[1]在黃皮‘Noy Amid’和綠皮‘TVT’雜交的F2分離群體中發(fā)現(xiàn)柚皮素查爾酮含量的分離比符合孟德?tīng)?﹕1的遺傳定律，證實(shí)了該色素受單基因調(diào)控。FEDER等[10]進(jìn)一步利用該F2群體進(jìn)行了基因定位，并結(jié)合遺傳轉(zhuǎn)化鑒定出影響成熟果果皮顏色的基因。另外，利用‘Piel de Sapo’和‘PI 161375’的雜交組合，研究者們也鑒定了果皮顏色相關(guān)的QTLs[11-12]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，許多甜瓜果皮顏色相關(guān)的QTLs和基因被分離和鑒定。但是，多數(shù)基因的精細(xì)定位仍存在定位區(qū)間較大、候選基因眾多等情況?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究構(gòu)建薄皮甜瓜兩個(gè)幼果果皮顏色差異的純系甜瓜‘MR-1’和厚皮甜瓜‘LGR’雜交組合，對(duì)其進(jìn)行表型觀察、群體構(gòu)建、遺傳模式分析、基因圖位克隆等，精細(xì)定位幼果果皮顏色基因，為深入揭示甜瓜幼果果皮顏色的形成機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所使用的材料‘MR-1’由國(guó)外引進(jìn)，屬于薄皮甜瓜亞種泡瓜變種（var.），果實(shí)為近圓形；‘LGR’由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜所甜瓜研究室提供，屬于厚皮甜瓜亞種冬甜瓜變種（var.），果實(shí)為長(zhǎng)橢圓型（圖1），成熟果有網(wǎng)紋[13-14]。利用兩個(gè)材料雜交構(gòu)建了正反交F1群體、F1與‘LGR’回交BC1F1群體，主要用于遺傳分析；BC1F1和F2群體主要用于BSA-seq和遺傳定位。雜交和回交構(gòu)建于2017年春季，定位群體種植于2017年秋季、2018年春秋、2019年春秋以及2020年春季。所有材料均種植在浙江海寧甜瓜實(shí)驗(yàn)基地，采用常規(guī)大田生產(chǎn)管理。

1.2 果皮顏色性狀調(diào)查

兩親本甜瓜‘LGR’和‘MR-1’的幼果果皮顏色調(diào)查以花后10 d左右的果實(shí)為對(duì)象，利用目測(cè)對(duì)比顏色深淺，分別定為“淺綠色”和“深綠色”。遺傳分析和定位群體中單株的表型調(diào)查也以花后10 d左右的果實(shí)為對(duì)象，對(duì)照兩親本的幼果果皮顏色，經(jīng)3次不同時(shí)間（花后8、10和12 d）的目測(cè)定義表型。成熟果顏色調(diào)查和測(cè)色儀定量測(cè)定取自花后35 d左右的果實(shí)。利用美能達(dá)CR-400/410色彩色差計(jì)（Konica Minolta Camera Co., Ltd, Osaka, Japan）對(duì)果皮顏色定量，其中L*值代表亮度從黑（0）至白（100），a*值代表從紅（+a）至綠（-a），b*值代表從黃（+b）至藍(lán)（-b）。利用SPSS Statistics V21.0進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.3 BSA-seq分析

從BC1F1群體中挑選深綠皮和淺綠皮植株各20株，利用CTAB法提取DNA。將20個(gè)深綠皮和20個(gè)淺綠皮單株DNA分別等量混合，形成兩個(gè)混池。2個(gè)混池和2個(gè)親本DNA按照樣品檢測(cè)、文庫(kù)構(gòu)建、質(zhì)量檢測(cè)以及上機(jī)測(cè)序等流程送由公司操作。參考基因組為甜瓜基因組Harukei3 genome reference ver1.41（http://melonet-db.dna.affrc.go.jp/ap/jbh）。

1.4 分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)

基于親本重測(cè)序信息，在初定位區(qū)段的雙側(cè)和內(nèi)部挑選有多態(tài)性的Indel標(biāo)記，利用凝膠電泳鑒定分子標(biāo)記的結(jié)合能力和特異性。后利用合適的引物對(duì)F2和BC1F1群體中的隱性單株個(gè)體進(jìn)行基因型鑒定，驗(yàn)證初步連鎖結(jié)果以及縮小定位區(qū)間。

1.5 DNA提取、PCR擴(kuò)增與聚丙烯酰胺凝膠電泳

取新鮮的甜瓜葉片于冷凍干燥機(jī)中放置1 d，采用CTAB法提取DNA：將葉片磨成粉末狀，加入600 μL預(yù)熱的CTAB提取液，搖勻，65℃水浴30 min；加入600 μL氯仿﹕異戊醇（24﹕1）抽提液，用力搖晃2 min后，12 000 r/min離心5 min；取上清液，加入360 μL（0.6倍體積上清液）-20℃預(yù)冷的異丙醇，-20℃中放置30 min；12 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入700 μL 70%無(wú)水乙醇洗滌2次，晾干后溶于去離子水中，-20℃保存。

PCR擴(kuò)增體系為10 μL，其中包括：2×buffer mix 5 μL，上下游引物各0.3 μL，DNA 2 μL，加去離子水2.4 μL。PCR反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性2 min，然后擴(kuò)增33個(gè)循環(huán)（包括：94℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃ 40 min），接著72℃ 5 min，4℃ 10 min。擴(kuò)增好的樣品于4℃保存。

2 結(jié)果

2.1 親本果皮顏色表型

通過(guò)對(duì)花后10 d的果皮顏色觀察，發(fā)現(xiàn)薄皮甜瓜‘MR-1’幼果果皮表現(xiàn)為深綠色，花后35 d的成熟果果皮表現(xiàn)為亮黃色；而厚皮甜瓜‘LGR’幼果果皮表現(xiàn)為淺綠色，成熟果果皮表現(xiàn)為灰色有網(wǎng)紋（圖1）。

2.2 幼果果皮顏色遺傳模式分析

為探究幼果果皮顏色的遺傳規(guī)律，以‘MR-1’和‘LGR’為親本進(jìn)行正反交組配，所得F1代的幼果果皮顏色均與‘MR-1’表型相同，表明幼果果皮顏色受核基因控制，且深綠對(duì)淺綠為顯性（圖1）。F2群體植株的幼果果皮顏色發(fā)生分離，其中132個(gè)果實(shí)為深綠色果皮，44個(gè)果實(shí)為淺綠色果皮，符合3﹕1的孟德?tīng)栠z傳分離比，BC1F1代群體表現(xiàn)為1﹕1的分離比（表1）。這些結(jié)果表明幼果果皮顏色是受單基因控制的質(zhì)量性狀。因該基因主要控制果皮綠色的深淺，因此將其命名為（）。

圖1 親本以及正反交F1果皮顏色表型

表1 幼果果皮顏色表型的遺傳學(xué)分析

2.3 GR的初步定位

為了分離和克隆，首先通過(guò)從BC1F1群體中挑選淺綠色和深綠色果皮植株各20株進(jìn)行DNA混池測(cè)序（BSA-seq）。參照兩親本的重測(cè)序信息，全基因組連鎖分析顯示4號(hào)染色體長(zhǎng)臂上存在一個(gè)目標(biāo)性狀區(qū)域（圖2）。該基因座的物理位置為203 744—1 974 725 bp，置信區(qū)間跨越1.8 Mb。

圖2 GR的初定位（紅圈代表目的區(qū)段）

2.4 GR的精細(xì)定位

基于親本重測(cè)序得到的覆蓋了13條染色體，共1 320 497個(gè)多態(tài)性分子標(biāo)記，在4號(hào)染色體上開(kāi)發(fā)位于初定位區(qū)間兩側(cè)的標(biāo)記4-6和4-58，對(duì)BC1F1群體中的隱性單株（淺綠皮）進(jìn)行基因型鑒定。結(jié)果顯示淺綠皮單株與標(biāo)記4-6有十分明顯的共分離趨勢(shì)（圖3-A），證實(shí)了BSA初定位的結(jié)果。為了精細(xì)定位該基因，開(kāi)發(fā)了初定位結(jié)果內(nèi)特異性好的引物（圖3-B，表2），并對(duì)擴(kuò)大的BC1F1和F2群體共984株（BC1F1：877株，F(xiàn)2：107株）進(jìn)行基因型鑒定，結(jié)果共篩選出24個(gè)重組交換單株（圖4-B）。通過(guò)對(duì)重組交換單株進(jìn)行后代表型和基因型鑒定，最終將精細(xì)定位于標(biāo)記4-102和4-81之間，物理距離為17.7 kb（Chr04: 602468-620197）（圖4-A、B）。

由于重組交換單株的缺乏，對(duì)17.7 kb區(qū)間內(nèi)包含的基因進(jìn)行序列比對(duì)分析。根據(jù)最新的甜瓜參考基因組的基因注釋發(fā)現(xiàn)該區(qū)間包含了4個(gè)基因：2個(gè)新注釋基因（和）、1個(gè)完整注釋基因（）以及的一部分（圖4-C）。其中，編碼未知蛋白；預(yù)測(cè)編碼一個(gè)類生長(zhǎng)素蛋白；編碼一個(gè)雙組分反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，該蛋白屬于Golden2-like類轉(zhuǎn)錄因子，故被命名為CmAPRR2；編碼一個(gè)煙草花葉病毒復(fù)制蛋白。通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)和等3個(gè)基因的編碼區(qū)序列在兩親本中存在差異（表3）。其中，僅存在由單堿基替換造成的錯(cuò)義變異，除了3處同義突變和1處錯(cuò)義突變，還存在1處單堿基替換造成的無(wú)義變異（表3）。通過(guò)對(duì)親本‘MR-1’和‘LGR’測(cè)序，證明‘LGR’中編碼區(qū)第856位堿基（G變?yōu)門）產(chǎn)生了終止密碼子，致使MELO3C003375蛋白翻譯提前終止，導(dǎo)致了Myb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域大部分缺失（圖5）。在黃瓜、番茄以及西瓜中，的同源基因、以及被報(bào)道參與葉綠素和類胡蘿卜素的合成以及質(zhì)體發(fā)育等過(guò)程[8,15-16]。由此推測(cè)，（）為控制甜瓜幼果果皮顏色的基因，而單堿基替換造成的無(wú)義突變?yōu)樵斐蓛捎H本幼果果皮顏色深淺的關(guān)鍵差異位點(diǎn)。

A：隱性單株在分子標(biāo)記4-6的基因型。泳道1為‘MR-1’，2為‘LGR’，8、19、58為重組交換單株；B：引物多態(tài)性。上方標(biāo)記為引物名，每個(gè)引物左邊泳道為‘MR-1’，右邊為‘LGR’。M為DNA marker

表2 定位所用引物序列

A：GR初定位于4號(hào)染色體4-6和4-58標(biāo)記之間；B：利用984個(gè)單株精細(xì)定位GR于4-102和4-81標(biāo)記約17.7 kb范圍內(nèi)。標(biāo)記下面的數(shù)字代表交換單株數(shù)；C：定位區(qū)間內(nèi)的候選基因

2.5 幼果果皮顏色與成熟果皮顏色存在顯著相關(guān)性

為探究甜瓜幼果果皮顏色與成熟果皮顏色之間的相關(guān)性，對(duì)BC1F1群體共153個(gè)單株的幼果進(jìn)行目測(cè)，并對(duì)照親本將其劃分深綠（1）和淺綠（2）兩類。因成熟果果皮顏色變化差異較大，使用測(cè)色儀定量分析成熟果顏色變異（表4）。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析和相關(guān)性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)幼果果皮顏色與成熟果皮顏色的亮度指標(biāo)和綠色強(qiáng)度指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)分別為0.849和0.857，呈極顯著相關(guān)。這說(shuō)明幼果果皮顏色與成熟果果皮顏色存在顯著相關(guān)性。

表3 定位區(qū)段內(nèi)基因編碼區(qū)變異

參考和比對(duì)分別代表‘MR-1’和‘LGR’中堿基和翻譯氨基酸REF and ALT represent the base and amino acid in ‘MR-1’ and ‘LGR’, respectively

A：MELO3C003375的基因結(jié)構(gòu)。數(shù)字代表到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離。前面的堿基代表‘MR-1’中的堿基，后面代表‘LGR’中的堿基；B：引起LGR蛋白截短的變異位點(diǎn)；C：‘MR-1’和‘LGR’中MELO3C003375的蛋白結(jié)構(gòu)域

3 討論

隨著甜瓜基因組研究的深入，功能基因組學(xué)取得了快速發(fā)展[17]。作為重要的農(nóng)藝性狀，果皮顏色的遺傳模式一直是研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。4號(hào)染色體長(zhǎng)臂被廣泛報(bào)道含有一個(gè)調(diào)控甜瓜果皮顏色的基因[8,18-20]。OREN等[8]利用3個(gè)親本‘Tam Dew’‘Dulce’和‘Noy Amid’將幼果果皮顏色基因定組位在4號(hào)染色體290 kb區(qū)段內(nèi)；ZHAO等[18]利用全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）將果皮顏色基因定位于4號(hào)染色體500 kb的范圍內(nèi)。因該定位范圍內(nèi)含有一個(gè)編碼雙組分反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白CmAPRR2的基因，且該基因的同源基因曾在黃瓜、番茄和胡椒中被報(bào)道可調(diào)控果皮的葉綠素代謝和色素積累，因此（）被前人認(rèn)定為候選基因[8,18]。有別于前人使用厚皮甜瓜進(jìn)行亞種內(nèi)組配，本研究利用厚皮與薄皮甜瓜開(kāi)展亞種間雜交；同時(shí)，本研究的親本在果形、網(wǎng)紋以及成熟果果皮顏色等方面與前人選材存在較大差異，這不僅給該性狀的遺傳定位選材增添了新類型，也暗示了該基因功能在亞種間的保守性[8,13-14]。另外，本研究采用BSA-seq確定初定位區(qū)間、重測(cè)序開(kāi)發(fā)新標(biāo)記和圖位克隆縮小區(qū)段這一思路清晰且完整的研究方案，通過(guò)多代表型和基因型的驗(yàn)證，將精細(xì)定位在17.7 kb的區(qū)間內(nèi)。但重組交換單株的缺乏使該區(qū)間較難進(jìn)行進(jìn)一步的縮小。通過(guò)對(duì)區(qū)間內(nèi)注釋基因的測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)（）在‘LGR’中存在1處無(wú)義變異，致使該轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游基因的重要結(jié)構(gòu)域（Myb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域）缺失，因此，（）被認(rèn)為是最佳候選基因。相比以往報(bào)道，本研究極大地縮短了幼果果皮顏色性狀基因的定位區(qū)間，提高了（）作為候選基因的可信度。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)‘MR-1’親本中第二個(gè)外顯子處的單堿基變異與已報(bào)道的材料都不相同，這也為甜瓜中的變異類型增添了新認(rèn)知。

表4 BC1F1群體植株果皮顏色表型

續(xù)表4 Continued table 4

-a*/b*代表綠色的強(qiáng)度 -a*/b* represents the intensity of green color

甜瓜果皮顏色豐富多樣，F(xiàn)ALLIK等[21]對(duì)不同成熟度的‘Galia’甜瓜進(jìn)行了果皮顏色變化調(diào)查并將其分成6個(gè)階段：（1）深綠色；（2）綠色；（3）淡黃色夾雜綠色；（4）淡黃色；（5）黃色；（6）深黃色至橙色。REID等[22]通過(guò)評(píng)估‘Crenshaw’‘Persian’和‘PMR45’3個(gè)甜瓜品種發(fā)現(xiàn)果實(shí)的成熟會(huì)伴隨著葉綠素含量的下降和類胡蘿卜素的上升。而FLüGEL和GROSS[23]在‘Galia’甜瓜中觀察到類胡蘿卜素含量在發(fā)育期間并沒(méi)有變化，外果皮變黃主要是因?yàn)樵诔墒爝^(guò)程中葉綠素的降解增加。因此，果皮顏色變化被認(rèn)為主要由葉綠素和類胡蘿卜素（主要是-胡蘿卜素）引起[24]。在本研究中，（）作為調(diào)控甜瓜幼果果皮顏色的基因，其是否參與了單一色素或者組合色素的合成或者分解過(guò)程？在黃瓜中，被發(fā)現(xiàn)影響質(zhì)體發(fā)育和葉綠素的合成[15]。PAN等[16]發(fā)現(xiàn)番茄和辣椒果實(shí)中過(guò)表達(dá)APRR類轉(zhuǎn)錄因子會(huì)增加幼果的葉綠素和成熟果的類胡蘿卜素。OREN等[8]發(fā)現(xiàn)的表達(dá)與-類胡蘿卜素的含量存在緊密的相關(guān)性。另外，與APRR2相關(guān)的GLK2轉(zhuǎn)錄因子也曾被報(bào)道影響質(zhì)體的發(fā)育以及調(diào)節(jié)植物的葉綠素和類胡蘿卜素的含量[25-27]。這些報(bào)道都為下一步比較分析親本色素含量提供了依據(jù)和方向。

作為雙組分反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白（ARR）的一類，APRR2屬于B型響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，該類型的蛋白被廣泛報(bào)道參與細(xì)胞分裂素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[28]。在的三突變體中，ARGYROS等[29]發(fā)現(xiàn)葉綠素的含量顯著減少并且大部分的細(xì)胞分裂素調(diào)節(jié)基因顯著下調(diào)。在擬南芥中，CHOI等[30]發(fā)現(xiàn)ARR2可通過(guò)Myb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與TGA3互作，進(jìn)而通過(guò)結(jié)合植物防御相關(guān)基因啟動(dòng)子的ACGTCATAGA基序來(lái)調(diào)控的表達(dá)。這些展現(xiàn)了ARRs類轉(zhuǎn)錄因子對(duì)下游基因的調(diào)控作用以及Myb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)RRs類轉(zhuǎn)錄因子功能的重要影響。在本研究中，‘LGR’與‘MR-1’的（）共有5處SNP差異，其中僅有無(wú)義突變?cè)诘鞍坠δ芙Y(jié)構(gòu)域中發(fā)生，造成‘LGR’中MELO3C003375（CmAPRR2）的Myb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域大部分缺失。類似地，OREN等[8]在甜瓜‘Tam Dew’中也發(fā)現(xiàn)了相同的無(wú)義突變，并且通過(guò)等位性測(cè)驗(yàn)證實(shí)了該變異是造成‘Tam Dew’幼果淺色的原因?；贛yb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的功能特點(diǎn)，猜測(cè)該無(wú)義突變會(huì)導(dǎo)致MELO3C003375（CmAPRR2）蛋白無(wú)法識(shí)別和結(jié)合下游基因，進(jìn)而無(wú)法調(diào)控色素代謝，以致產(chǎn)生淺綠色果皮。對(duì)于APRR2或者ARRs類轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控色素相關(guān)基因的方式（直接或者有其他基因介導(dǎo)），暫時(shí)未有相關(guān)深入的研究。鑒于擬南芥中轉(zhuǎn)座酶類的轉(zhuǎn)錄因子FHY3和FAR1，以及ABRE類轉(zhuǎn)錄因子ABF2、ABF3和ABF4常通過(guò)直接調(diào)節(jié)葉綠素代謝途徑中的結(jié)構(gòu)基因來(lái)影響葉綠素水平[31-32]，推測(cè)（）通過(guò)直接調(diào)控色素代謝途徑中的結(jié)構(gòu)基因來(lái)影響幼果果皮顏色，而缺失了Myb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的MELO3C003375（CmAPRR2）則極有可能因?yàn)闊o(wú)法直接識(shí)別與結(jié)合結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子，進(jìn)而無(wú)法調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)，造成‘LGR’無(wú)法積累色素，產(chǎn)生淺綠色幼果。

作為對(duì)消費(fèi)者有吸引力的性狀，果皮顏色一直是甜瓜育種的重要目標(biāo)。相較于成熟果，幼嫩果實(shí)顏色相對(duì)單一，主要由葉綠素影響。但成熟果與幼嫩果實(shí)之間是否存在關(guān)聯(lián)性，研究卻很少涉及。本研究中，兩親本幼嫩果果皮顏色差異明顯，定位群體（BC1F1）單株表型也分離顯著，隨著發(fā)育進(jìn)程，親本以及單株果皮顏色發(fā)生變化，但有趣的是，淺綠皮植株和深綠皮成熟果果皮顏色的綠色強(qiáng)度卻形成了顯著的差異分化，這表明即使果實(shí)在發(fā)育過(guò)程中會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)變，但成熟果果皮顏色仍然與幼嫩果果皮顏色存在緊密的相關(guān)性，該結(jié)論為未來(lái)進(jìn)行甜瓜外觀品質(zhì)育種提供了思路。另外，本研究發(fā)現(xiàn)在BC1F1群體幼果為深綠皮的植株中，部分單株的成熟果會(huì)表現(xiàn)出黃色，而部分單株仍然表現(xiàn)為深綠色。這表明雖然成熟果顏色與幼果顏色有顯著相關(guān)性，但兩者之間的內(nèi)在聯(lián)系以及它們與果實(shí)發(fā)育進(jìn)程之間的關(guān)系還需進(jìn)一步的探索和解析。這為后續(xù)進(jìn)行成熟果的相關(guān)研究提供了思路，也暗示選擇合適時(shí)期的材料對(duì)果實(shí)皮色的研究十分重要。

4 結(jié)論

甜瓜幼果果皮顏色（深綠和淺綠）是受單個(gè)核基因控制的質(zhì)量性狀，且深綠對(duì)淺綠為顯性。通過(guò)遺傳定位將該定位于4號(hào)染色體分子標(biāo)記4-102和4-81之間，物理距離約為17.7 kb。此區(qū)間內(nèi)（）的第8個(gè)外顯子在‘LGR’中發(fā)生單堿基替換（G856T），造成蛋白翻譯提前終止，推測(cè)（）即為調(diào)控甜瓜幼果果皮顏色的基因。

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Fine Mapping of an Immature Rind Color Genein Melon

XU XinYang, SHEN Jia, ZHANG YueJian, LI GuoJing, NIU XiaoWei, SHOU WeiSong

Institute of Vegetables, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021

【】The aim of this study was to explore the inheritance pattern of immature rind color of melon(L.), to fine map target gene, and to deepen the understanding of rind color change during fruit growth, so as to provide a guidance for the improvement of melon color with molecular design breeding.【】The dark-green rind line ‘MR-1’ (.ssp.) and the light-green rind line ‘LGR’ (C.ssp.) were used as parents to construct the F1hybrid population, and the BC1F1backcross population was constructed from crossing by F1and ‘LGR’ for genetic analysis of immature rind color. By selecting 20 dark-green and light-green plants each in BC1F1population, the DNA was mixed, respectively, and the BSA-seq was operated for initial mapping. Based on the resequencing of two parents, the molecular markers with better specificity were developed in the initial region and recombinant individuals were identified and selected to verify and narrow the interval for fine mapping thegene. By sequencing of coding regions between two parents according to the gene annotation, the candidate gene and key variant site were determined. Moreover, the phenotype of immature and mature fruit in the BC1F1backcross population was investigated and assessed by correlation analysis to explore the underlying mechanism of rind color transition in the fruit development.【】According to the investigation, the phenotype of all F1individual plants exhibited dark-green rind color. In addition, the immature rind color of BC1F1 backcross population was found to be separated, and the ratio of the number of dark-green to light-green was approximately 1﹕1. As well as, the ratio of the number of dark-green to light-green in the F2population was 3﹕1. These ratios corresponded to Mendel’s law of inheritance, indicating that the immature rind color of melon was a quality trait, controlled by a single nuclear gene, and the dark-green was dominant to light-green. Through BSA-seq, the gene was initially mapped to a 1.8 Mb interval on the long arm of chromosome 4. With developed molecular markers, 24 recombinant individuals were selected in expanded mapping population. The gene was further narrowed down to a region between markers 4-102 and 4-81 with a physical distance of 17.7 kb by genotype and phenotype verification of offspring, where were four predicted genes with latest annotation. Sequencing analysis revealed that a geneencoding GLKs transcription factor CmAPRR2 had several variations in ‘MR-1’ and ‘LGR’. Among them, there were three synonymous, a missense mutation, and a nonsense mutation. The nonsense mutation (G to T) appeared in the 856th base of the coding region led to premature translation termination and most of the Myb-DNA binding domain to be lost in ‘LGR’. Thus, the() was speculated to be thegene and the nonsense mutation was the key variation that affected the immature rind color of melon. It was found that there was a significant correlation between the rind color of immature fruit and mature fruit by investigating the phenotype of fruits in the BC1F1backcross population.【】Immature rind color (dark green/light green) of melon was a quality trait and controlled by a single nuclear gene. By mapping,() was presumed to be the candidate gene that affected immature rind color.

melon; immature rind color; gene mapping;;()

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.15.014

2020-09-20；

2020-12-16

浙江省第三次全國(guó)農(nóng)作物種質(zhì)資源普查與收集行動(dòng)（111821301354052030）、浙江省農(nóng)業(yè)（蔬菜）新品種選育重大科技專項(xiàng)（2016C02051-4-4）

許昕陽(yáng)，E-mail：shine2014201048@163.com。通信作者壽偉松，E-mail：shouws@zaas.ac.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）