大麗輪枝菌木糖苷酶基因的鑒定及基于HIGS技術(shù)的功能分析

張小雪，孫天歌，張迎春，陳麗華，張新宇，李艷軍，孫杰

大麗輪枝菌木糖苷酶基因的鑒定及基于HIGS技術(shù)的功能分析

張小雪，孫天歌，張迎春，陳麗華，張新宇，李艷軍，孫杰

石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆石河子 832003

【】從大麗輪枝菌（）中鑒定木糖苷酶基因，研究其與大麗輪枝菌致病力的關(guān)系，為解析大麗輪枝菌致病分子機(jī)制提供理論依據(jù)，同時(shí)為制定更好的棉花黃萎病防治策略提供科學(xué)依據(jù)。利用生物信息學(xué)方法從大麗輪枝菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定全部木糖苷酶基因，并對(duì)基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域、基因的染色體定位及進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行分析。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)木糖苷酶基因在不同抗/感棉花品種根系分泌物培養(yǎng)0、6、12、24和48 h大麗輪枝菌中的表達(dá)量。利用寄主誘導(dǎo)的基因沉默（host-induced gene silencing，HIGS）技術(shù)對(duì)木糖苷酶基因在大麗輪枝菌侵染過(guò)程中的功能進(jìn)行初步分析。將的目標(biāo)片段轉(zhuǎn)化棉花，采用傷根法接種大麗輪枝菌Vd991，觀察轉(zhuǎn)化植株的表型，調(diào)查病情指數(shù)，同時(shí)利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)植株中真菌生物量和的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。利用生物信息學(xué)方法從大麗輪枝菌中查找出13個(gè)木糖苷酶基因（—），其編碼序列長(zhǎng)度介于1 461—2 544 bp，蛋白質(zhì)分子量介于38.78—90.97 kD，理論等電點(diǎn)介于4.67—5.89。結(jié)構(gòu)域和進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)13個(gè)木糖苷酶基因中包括9個(gè)糖苷水解酶43家族成員、1個(gè)3家族成員和3個(gè)31家族成員。染色體定位分析發(fā)現(xiàn)13個(gè)基因分布在6條染色體上，未形成基因簇。qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)選取的6個(gè)基因均受到根系分泌物的誘導(dǎo)，在一種或多種根系分泌物中培養(yǎng)6 h或12 h后，表達(dá)量均明顯升高，然后降低。其中受海島棉根系分泌物誘導(dǎo)后表達(dá)量明顯升高，表明該基因的表達(dá)明顯受海島棉根系分泌物的誘導(dǎo)。HIGS研究結(jié)果表明，接菌14 d和21 d后轉(zhuǎn)化基因干擾片段的棉花發(fā)病明顯較重，其病情指數(shù)（33.3和83.9）明顯高于空載體對(duì)照（21.7和66.1）。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化基因干擾片段的棉花植株莖中的表達(dá)量明顯低于空載體對(duì)照，真菌生物量顯著多于對(duì)照。利用HIGS技術(shù)將基因沉默后，棉株的抗病性明顯降低，表明在大麗輪枝菌致病及宿主-病原體互作過(guò)程中可能發(fā)揮著重要的作用。

棉花；大麗輪枝菌；黃萎??；；木糖苷酶；寄主誘導(dǎo)的基因沉默

0 引言

【研究意義】我國(guó)是世界上主要的棉花生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)，新疆是最大的植棉省區(qū)，已連續(xù)25年保持單產(chǎn)、總產(chǎn)和調(diào)出量全國(guó)第一。2019年新疆棉花播種面積254.05萬(wàn)公頃，皮棉產(chǎn)量500.2萬(wàn)噸，分別占全國(guó)的76.1%和84.9%，棉花產(chǎn)業(yè)已成為新疆的重要經(jīng)濟(jì)支柱和農(nóng)民收入的主要來(lái)源。棉花黃萎病是一種土傳性維管束真菌病害[1]，嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量和纖維品質(zhì)[2]。我國(guó)棉區(qū)的黃萎病主要是由大麗輪枝菌（）引起[3]。大麗輪枝菌入侵寄主后，其菌絲體大量生長(zhǎng)阻礙植物木質(zhì)部對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸[4]，同時(shí)產(chǎn)生水解酶和毒素等物質(zhì)作用于寄主，最終導(dǎo)致植株死亡[1,5]。由于大麗輪枝菌具有穩(wěn)定存在的微菌核結(jié)構(gòu)以及多變的生理型，棉花黃萎病至今難以防治。挖掘大麗輪枝菌致病相關(guān)基因并進(jìn)行功能驗(yàn)證，對(duì)揭示大麗輪枝菌的致病分子機(jī)制以及制定更好的棉花黃萎病防治策略具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)，隨著大麗輪枝菌全基因組測(cè)序的完成和生物信息學(xué)工具的發(fā)展，其致病相關(guān)基因的挖掘及功能研究已取得較大進(jìn)展[6-10]，但由于大麗輪枝菌致病機(jī)制非常復(fù)雜，其研究仍處于探索階段。大麗輪枝菌入侵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生胞外分泌蛋白，其中含有大量的植物細(xì)胞壁降解酶，能夠降解寄主植物的細(xì)胞壁多糖以達(dá)到入侵和定殖的目的[1,5,11]。植物細(xì)胞壁的橫向結(jié)構(gòu)主要由半纖維素和木質(zhì)素結(jié)合而成。木聚糖是半纖維素的主要成分，最高可占細(xì)胞干重的35%，是植物中第二豐富的生物聚合物，僅次于纖維素。木聚糖的降解在大麗輪枝菌的致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12]。木聚糖酶和木糖苷酶是降解木聚糖的關(guān)鍵酶，前者將木聚糖降解成小片段，后者則利用外切的性質(zhì)將小片段水解釋放木糖[13-14]。已有多種病原菌分泌的木聚糖酶被發(fā)現(xiàn)與其致病力密切相關(guān)[15-16]，然而木糖苷酶與致病力的關(guān)系尚不清楚。依據(jù)木糖苷酶水解的糖苷鍵不同，可分為-木糖苷酶和-木糖苷酶兩種類(lèi)型。依據(jù)氨基酸序列相似性，在Carbohydrate Active Enzymes數(shù)據(jù)庫(kù)（CAZy，http://www.cazy.org/）中-木糖苷酶被劃分為GH31家族，-木糖苷酶被歸類(lèi)于糖苷水解酶GH3、GH30、GH39、GH43、GH52、GH54和GH120家族。-木糖苷酶的相關(guān)報(bào)道較多，目前狹義的木糖苷酶一般指的是-木糖苷酶。-木糖苷酶在自然界中廣泛存在，在高等植物和微生物中均已得到分離，在能源工業(yè)、造紙工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)中已得到廣泛應(yīng)用[17-18]。【本研究切入點(diǎn)】真菌中已有多個(gè)木糖苷酶基因被克隆[19-20]，大麗輪枝菌中木糖苷酶基因的鑒定及功能研究尚未見(jiàn)報(bào)道。實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)對(duì)不同抗性棉花品種的根系分泌物培養(yǎng)大麗輪枝菌的轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)一個(gè)木糖苷酶基因（VDAG_01866）能夠響應(yīng)感病棉花品種的根系分泌物，暗示其在大麗輪枝菌早期寄主識(shí)別和侵染過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[21]。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】對(duì)大麗輪枝菌木糖苷酶基因進(jìn)行全基因組鑒定和生物信息學(xué)分析，并利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)木糖苷酶基因在3種根系分泌物培養(yǎng)不同時(shí)間大麗輪枝菌中的表達(dá)量。利用寄主誘導(dǎo)的基因沉默（host-induced gene silencing，HIGS）技術(shù)對(duì)在棉花致病過(guò)程中的功能進(jìn)行分析，探討木糖苷酶基因與大麗輪枝菌致病力的關(guān)系。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2019—2020年在石河子大學(xué)完成。

1.1 供試材料及處理

供試材料為陸地棉（）新陸早8號(hào)（感病品種）、中植棉2號(hào)（耐病品種）和海島棉（）海7124（抗病品種），均由石河子大學(xué)棉花研究所提供。大麗輪枝菌強(qiáng)致病菌株Vd991由石河子大學(xué)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.1 棉苗的種植 將棉種在溫水中浸泡8—12 h后，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽，挑選發(fā)芽整齊一致的種子均勻種植在霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液中，每盆種植18棵棉苗，每3 d添加一次霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液使總體積保持5 L，培養(yǎng)30 d后收集根系分泌物。先用濾紙對(duì)每盆中液體進(jìn)行過(guò)濾，再用細(xì)菌過(guò)濾器（直徑0.22 μm）進(jìn)行過(guò)濾，然后在冷凍干燥機(jī)中將過(guò)濾后的溶液濃縮至1 L，放置在4℃冰箱備用。另外，挑選發(fā)芽整齊一致的種子均勻種在等體積混合的營(yíng)養(yǎng)土與蛭石中，培養(yǎng)溫度26℃，相對(duì)濕度80%，光周期16 h光照/8 h黑暗，待植株長(zhǎng)出2片真葉后用于農(nóng)桿菌的注射和大麗輪枝菌的脅迫處理。

1.1.2 大麗輪枝菌樣本的制備 挑取PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)10 d左右的菌塊接種于200 mL查氏液體培養(yǎng)基中，26℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)5—7 d，分裝入50 mL離心管中，12 000 r/min收集Vd991菌體。每份稱(chēng)取0.5 g菌體，分別加入10 mL根系分泌物，培養(yǎng)0、6、12、24和48 h后收集菌體，設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，共收集45份菌體。

1.2 方法

1.2.1木糖苷酶基因的鑒定及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) 從大麗輪枝菌數(shù)據(jù)（https://fungi.ensembl.org/ Verticillium_ dahliae/Search/ Results?Species=Verticillium%20dahliae; idx=;q=arabinosidase;site=ensemblthis）網(wǎng)站下載Verticillium_dahliae. ASM15067v2. GFF3、CDS、genomic和protein序列文件，利用TBtools軟件對(duì)GFF3文件中所有木糖苷酶基因進(jìn)行搜索，初步獲得大麗輪枝菌木糖苷酶基因，同時(shí)在CDS、蛋白質(zhì)、全基因組序列文件中獲取基因?qū)?yīng)的cDNA序列、蛋白質(zhì)序列以及基因組序列。利用SMART在線軟件（http://smart.Emblh eidelberg.de/）進(jìn)一步分析基因是否具有糖苷水解酶家族的主結(jié)構(gòu)域，去除不完整的短片段和重復(fù)的序列，最終確定大麗輪枝菌中全部木糖苷酶基因。利用在線軟件ExPASy-ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）分析氨基酸序列的蛋白質(zhì)殘基數(shù)（aa）、分子量（kD）和等電點(diǎn)（pI）。利用在線軟件ProtComp9.0（http://www.softberry.com/ berry.phtml?topic=protcomppl&group=programs&subgroup =proloc）對(duì)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.2 木糖苷酶基因的生物信息學(xué)分析 利用SMART在線軟件預(yù)測(cè)木糖苷酶基因蛋白信號(hào)肽和結(jié)構(gòu)域，利用DOG2.0軟件繪制蛋白的結(jié)構(gòu)域圖。以13個(gè)木糖苷酶基因蛋白序列的主結(jié)構(gòu)域?yàn)樘结樞蛄?，利用NCBI Blast P（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行序列比對(duì)，從搜索結(jié)果中選擇E值小、Score值大的來(lái)自其他物種的木糖苷酶基因序列。利用MEGA6.0提供的ClustalW程序?qū)Υ篼愝喼捌渌锓N中的木糖苷酶基因蛋白序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，然后通過(guò)臨位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。從大麗輪枝菌數(shù)據(jù)庫(kù)下載木糖苷酶基因的CDS、基因組序列，利用在線軟件Gene Structure Display Server（GSDS）（http://gsds.cbi.pku.edu.cn）分析木糖苷酶基因外顯子-內(nèi)含子的數(shù)目及分布。從大麗輪枝菌全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得木糖苷酶基因染色體分布以及長(zhǎng)度信息，利用Map Inspect繪制木糖苷酶基因染色體定位圖。

1.2.3 大麗輪枝菌總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 利用Fungal RNA Kit（OMEGA）提取大麗輪枝菌樣本總RNA，用DNase Ⅰ消解DNA后，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，利用NanoDrop 2000 DNA濃度測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度和OD260nm/ OD280 nm值。用MMLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，保存于-20℃冰箱備用。

1.2.4 木糖苷酶基因的表達(dá)分析 依據(jù)進(jìn)化樹(shù)分類(lèi)結(jié)果及實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[21]，從GH3、GH31和GH43 3個(gè)糖苷水解酶家族中挑選6個(gè)基因（、、、、和），其中來(lái)自GH3家族，和來(lái)自GH43家族，、和來(lái)自GH31家族。設(shè)計(jì)這6個(gè)木糖苷酶基因的特異性引物（表1），以培養(yǎng)0、6、12、24和48 h大麗輪枝菌的cDNA為模板，利用qRT-PCR對(duì)基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，大麗輪枝菌微管蛋白基因作為內(nèi)參基因。qRT-PCR反應(yīng)在美國(guó)羅氏 LightCycler? 480系統(tǒng)上進(jìn)行，反應(yīng)參數(shù)：94℃ 1 min；94℃ 15 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s；40次循環(huán)，所有反應(yīng)設(shè)置3次重復(fù)，按照 2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

劃線部分為酶切位點(diǎn)The underlined part is the restriction site.R I: GAATTC;I: GGTACC

1.2.5 基于HIGS技術(shù)的基因沉默 木糖苷酶基因干擾片段的克隆：根據(jù)NCBI網(wǎng)站Primer3-Blast在線設(shè)計(jì)的特異引物-F/R，在上下游引物中分別引入R I和I酶切位點(diǎn)（表1），以大麗輪枝菌cDNA為模板擴(kuò)增的干擾片段。PCR反應(yīng)體系（20 μL）：ddH2O 13.2 μL，10×Ex Taq Buffer 2 μL，dNTP Mix（2.5 mmol·L-1）1.6 μL，cDNA模板1 μL；上游引物-F1（10 μmol·L-1）1 μL，下游引物-R1（10 μmol·L-1）1 μL，Ex Taq（5 U·μL-1）0.2 μL。擴(kuò)增條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，29次循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)回收后，連接至pMD19-T simple載體轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆送至深圳華大基因科技有限公司測(cè)序，獲得T-重組質(zhì)粒。

HIGS載體的構(gòu)建：提取pTRV2空載體質(zhì)粒和T-重組質(zhì)粒，分別用R I和I進(jìn)行雙酶切，回收pTRV2載體線性化片段和干擾片段，采用T4DNA連接酶連接回收的兩個(gè)片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落搖培后提取質(zhì)粒，利用PCR和雙酶切對(duì)重組質(zhì)粒pTRV2-進(jìn)行鑒定。

棉花的注射及侵染：用電擊轉(zhuǎn)化法將pTRV1、pTRV2-、空載體pTRV2-和對(duì)照載體pTRV2-（該基因突變使葉片失綠）分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。待棉苗兩片子葉平展時(shí)，挑取含pTRV1、pTRV2-、pTRV2-和pTRV2-的農(nóng)桿菌單菌落加入30 mL LB液體培養(yǎng)基（卡那霉素50 mg·L-1，利福平25 mg·L-1）中，28℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。將搖培的菌液放入4℃離心機(jī)5 000 r/min離心10 min收集菌體，加入孢子懸浮液（10 mmol·L-1MgCl2、10 mmol·L-1MES（2-（N-嗎啡啉）乙磺酸）和200 pmol·L-1AS（乙酰丁香酮），重懸后將菌液的濃度調(diào)至OD600=0.8。將準(zhǔn)備好的含pTRV2-、pTRV2-和pTRV2-的重懸液分別與含pTRV1的重懸液按照1﹕1的比例混合，室溫靜置3 h后注射棉花。用1 mL無(wú)針頭注射器采用壓迫法注射生長(zhǎng)10 d的棉苗，將菌液注入展平的子葉中，使菌液充滿(mǎn)整個(gè)子葉。含pTRV2-和pTRV2-的重懸液分別注射80棵棉苗，將注射后的棉花放置于22—25℃條件下暗培養(yǎng)12 h，然后恢復(fù)至正常光照培養(yǎng)。

1.2.6 抗病性鑒定 大麗輪枝菌孢子懸浮液的制備：挑取PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)10 d左右的菌塊接種于200 mL查氏液體培養(yǎng)基中，26℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)5—7 d，用滅菌的紗布過(guò)濾菌液后獲得孢子懸浮液，在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將孢子懸浮液調(diào)至1.0×107cfu/mL。

病情指數(shù)調(diào)查：注射農(nóng)桿菌菌液后7—10 d，待pTRV2-處理的棉苗真葉完全呈現(xiàn)黃白色時(shí)，制備濃度為1×107cfu/mL的大麗輪枝菌孢子懸浮液，采用傷根法侵染棉花感病品種新陸早8號(hào)，每株接種20 mL孢子懸浮液。選取20株pTRV2-處理過(guò)的棉苗作為水處理對(duì)照（Mock）。侵染15—30 d后，對(duì)新陸早8號(hào)的感病情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)[22]。

真菌生物量檢測(cè)：接Vd991后14 d，分別采集pTRV2-和pTRV2-處理棉株的莖，提取總DNA（CTAB法），利用棉花內(nèi)參基因（DQ116441.1）和黃萎病特異引物ITS1-F和ST-Ve1- R[23]進(jìn)行qRT-PCR，測(cè)定其中大麗輪枝菌的生物量。

目標(biāo)基因表達(dá)量檢測(cè)：采用EASYspinPlus植物RNA提取試劑盒（Aidlab，北京，中國(guó)）提取接菌后14 d棉株莖的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以為內(nèi)參基因，-F和-R為引物，利用qRT-PCR對(duì)的表達(dá)量進(jìn)行分析。

大麗輪枝菌恢復(fù)培養(yǎng)：接菌后14 d，隨機(jī)選取pTRV2-和pTRV2處理棉苗各10株，用于大麗輪枝菌的恢復(fù)試驗(yàn)。從暴露于蛭石表面的莖基部切斷植株，向上每隔2 cm取一個(gè)莖段，每個(gè)植株取3段。將莖段放入75%酒精浸泡30 s，然后在0.1%的升汞溶液中浸泡消毒5 min，無(wú)菌水沖洗3—5次，將處理的莖段均勻擺放在PDA平板上，25℃培養(yǎng)7—10 d。待大麗輪枝菌菌落長(zhǎng)出后，觀察菌落的生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果

2.1 大麗輪枝菌木糖苷酶基因的鑒定

通過(guò)大麗輪枝菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索結(jié)合在線工具SMART結(jié)構(gòu)域分析，共鑒定出13個(gè)木糖苷酶基因，定名為—（表2）。這些木糖苷酶基因的編碼序列（coding sequence，CDS）長(zhǎng)度為1 461— 2 544 bp，編碼的氨基酸為335—834個(gè)，蛋白質(zhì)分子量介于38.78—90.97 kD，理論等電點(diǎn)介于4.67—5.89。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)這些基因大多是細(xì)胞膜外的蛋白質(zhì)，部分定位于細(xì)胞質(zhì)、膜結(jié)合的溶酶體、細(xì)胞核或膜結(jié)合高爾基體上。13個(gè)基因中包含4個(gè)木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶基因（），1個(gè)-葡糖苷酶/-木糖苷酶（），5個(gè)-木糖苷酶基因（）和3個(gè)-木糖苷酶基因（）。

2.2 大麗輪枝菌木糖苷酶基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域分析

利用SMART在線工具（http://smart.embl-heidelberg. de/smart/batch.pl）對(duì)13個(gè)木糖苷酶基因編碼蛋白進(jìn)行了信號(hào)肽和結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，分析發(fā)現(xiàn)VdxyL6含有糖苷水解酶Glyco_hydro_3（紅色）和Glyco_hydro_3_C結(jié)構(gòu)域（黃色）；VdxyL4、VdxyL8和VdxyL12均含有糖苷水解酶Glyco_hydro_31結(jié)構(gòu)域（綠色）；其中VdxyL8還含有Gal_mutarotas_2結(jié)構(gòu)域（橙色）；VdxyL1、VdxyL2、VdxyL3、VdxyL5、VdxyL7、VdxyL9、VdxyL10、VdxyL11和VdxyL13均含有糖苷水解酶Glyco_hydro_43結(jié)構(gòu)域（藍(lán)色）；其中VdxyL3含有兩個(gè)Glyco_hydro_43結(jié)構(gòu)域。13個(gè)基因編碼的蛋白中VdxyL3、VdxyL6、VdxyL7、VdxyL9和VdxyL11含有不同長(zhǎng)度的信號(hào)肽（黑色）（圖1）。

表2 大麗輪枝菌中木糖苷酶基因的鑒定

黑色表示信號(hào)肽；藍(lán)色表示Glyco_hydro 43結(jié)構(gòu)域；綠色表示Glyco_hydro 31結(jié)構(gòu)域；紅色表示Glyco_hydro 3結(jié)構(gòu)域；黃色表示Glyco_hydro 3_C結(jié)構(gòu)域；橙色表示Gal_mutarotas_2結(jié)構(gòu)域Black indicates the signal peptide; Blue indicates the Glyco_hydro 43 domain; Green indicates the Glyco_hydro 31 domain; Red indicates the Glyco_hydro 3 domain; Yellow indicates the Glyco_hydro 3_C domain; Orange indicates the Gal_mutarotas_2 domain

2.3 木糖苷酶基因多重序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

通過(guò)在線軟件NCBI中多序列比對(duì)查找并選取其他物種中12個(gè)木糖苷酶基因編碼的蛋白序列，其中XP 018236340.1（尖鐮孢）、RMZ44074.1（黃曲霉）、TFL04453.1（細(xì)翼蕨）、TDZ59664.1（三葉炭疽菌）、TEA21443.1（紫蘇炭疽菌）和THX71209.1（出芽短梗霉菌）屬于糖苷水解酶43家族；CVK94262.1（芒果鐮孢）和CVL11996.1（層出鐮孢）屬于糖苷水解酶3家族；RKK75644.1（尖鐮孢）、KPM38392.1（新蜜環(huán)菌）、XP 003721488.1（稻瘟病菌）和XP 028469785.1（堿性鈉酵母菌）屬于糖苷水解酶31家族；將12個(gè)木糖苷酶基因與大麗輪枝菌13個(gè)木糖苷酶基因編碼的蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析（圖2），25個(gè)蛋白被清晰地分成3組。VdxyL1、VdxyL2、VdxyL3、VdxyL5、VdxyL7、VdxyL9、VdxyL10、VdxyL11和VdxyL13與其他物種中43家族成員聚為一類(lèi)；VdxyL6與其他物種中3家族成員聚為一類(lèi)；VdxyL4、VdxyL12、VdxyL8與其他物種中31家族成員聚為一類(lèi)；該結(jié)果與結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果一致，表明大麗輪枝菌13個(gè)木糖苷酶基因中，包括9個(gè)糖苷水解酶43家族成員，1個(gè)糖苷水解酶3家族成員和3個(gè)31家族成員。

紅色表示Glyco_hydro 3家族；紫色表示Glyco_hydro 31家族；藍(lán)色表示Glyco_hydro 43家族

2.4 木糖苷酶基因結(jié)構(gòu)分析

利用在線軟件GSDS對(duì)13個(gè)木糖苷酶基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示和含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子；含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子；、和含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子；、、、和含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子；和含有1個(gè)外顯子，無(wú)內(nèi)含子。

2.5 大麗輪枝菌木糖苷酶基因染色體分布

大麗輪枝菌共有8條染色體，13個(gè)木糖苷酶基因分布在6條染色體上。Chr02、Chr03和Chr07上分別含有3個(gè)木糖苷酶基因，Chr02上分布的基因?yàn)?、和，Chr03上分布的基因?yàn)?、和，Chr07上分布的基因?yàn)椤⒑?。Chr04上分布2個(gè)基因和。Chr01和Chr08上各含有一個(gè)木糖苷酶基因，分別為和（圖4）。根據(jù)200 kb核苷酸中含3個(gè)以上基因?yàn)?個(gè)基因簇的定義，木糖苷酶基因沒(méi)有形成基因簇。

圖3 大麗輪枝菌木糖苷酶基因結(jié)構(gòu)分析

圖4 大麗輪枝菌木糖苷酶基因在染色體上的分布

2.6 木糖苷酶基因在根系分泌物誘導(dǎo)下的表達(dá)分析

qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)6個(gè)基因均受到根系分泌物的誘導(dǎo)，在一種或多種根系分泌物中培養(yǎng)6 h或12 h后，表達(dá)量均明顯升高，然后降低。在海7124根系分泌物誘導(dǎo)6 h的表達(dá)量明顯高于其他樣本，表明該基因的表達(dá)明顯受海島棉根系分泌物的誘導(dǎo)。、、、和在耐病品種（中植棉2號(hào)）根系分泌物誘導(dǎo)6 h樣本中的表達(dá)量明顯高于其他樣本，其中的表達(dá)僅受到耐病品種根系分泌物的誘導(dǎo)，的表達(dá)也受感病陸地棉品種（新陸早8號(hào)）根系分泌物的誘導(dǎo)，、和受3種不同抗/感品種根系分泌物的誘導(dǎo)（圖5）。該研究結(jié)果表明大麗輪枝菌木糖苷酶基因在響應(yīng)棉花根系分泌物的過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用。根據(jù)qRT-PCR結(jié)果結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，選取用于進(jìn)一步的功能研究。

圖5 木糖苷酶基因在不同棉花品種根系分泌物培養(yǎng)的大麗輪枝菌中表達(dá)模式

2.7 HIGS沉默效果檢測(cè)

選取進(jìn)行HIGS沉默研究。將注射pTRV2-的棉花作為陰性對(duì)照，注射pTRV2-的棉花為陽(yáng)性對(duì)照。注射10 d后，pTRV2-處理植株真葉出現(xiàn)黃化現(xiàn)象（圖6-A），表明HIGS體系可以成功抑制目標(biāo)基因表達(dá)。制備濃度為1.0× 107cfu/mL大麗輪枝菌孢子懸浮液，采用傷根法侵染棉花。接菌14 d后，采集pTRV2-和pTRV2-處理的棉花莖，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以-F/R為引物，利用qRT-PCR分析的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pTRV2-處理的棉花莖中的表達(dá)量明顯低于pTRV2-（圖6-B），表明pTRV2-處理棉株中大麗輪枝菌的表達(dá)成功受到抑制。

A：注射pTRV2-GhCHLI 10 d后感病品種新陸早8號(hào)的表型Phenotypes ofsusceptible variety Xinluzao 8 after 10 days of injection with pTRV2-GhCHLI；B：qRT-PCR 檢測(cè)VdxyL3在pTRV2-00 和pTRV2-VdxyL3處理植株中的表達(dá)量。從接菌14 d后植株莖稈中提取棉花總RNA。tubulin為內(nèi)參基因qRT-PCR analysis of VdxyL3 expression in the pTRV2-00 and pTRV2-VdxyL3 treated plants. Total RNA was isolated from stems at 14 dpi. tubulin was used as the control

2.8 病情調(diào)查

接菌后14 d和21 d，分別對(duì)pTRV2-和pTRV2-處理植株的發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查。接菌后14 d，pTRV2-處理植株出現(xiàn)輕微的葉片黃化現(xiàn)象，而pTRV2-處理植株呈現(xiàn)明顯的黃化和萎蔫現(xiàn)象；接菌后21 d，pTRV2-處理植株葉片出現(xiàn)明顯的黃化、萎蔫和脫落現(xiàn)象，而pTRV2-處理植株發(fā)病嚴(yán)重，葉片脫落較多（圖7-A）。兩種處理植株的正常生長(zhǎng)均受到影響，但pTRV2-處理植株的株高略矮于pTRV2-處理植株（圖7-B）。病情指數(shù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)pTRV2-處理植株在接菌14 d和21 d的病情指數(shù)（33.3和83.9）均顯著高于pTRV2-植株14 d和21 d（21.7和66.1）（圖7-C）。剖桿試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)pTRV2-處理植株褐化程度明顯較高（圖7-D）。

2.9 大麗輪枝菌恢復(fù)培養(yǎng)和真菌相對(duì)生物量檢測(cè)

接菌后14 d，分別采集pTRV2-和pTRV2-處理棉株的莖，提取總DNA，利用qRT-PCR檢測(cè)真菌生物量。同時(shí)，收取pTRV2-和pTRV2-處理棉苗的莖用于大麗輪枝菌的恢復(fù)試驗(yàn)。大麗輪枝菌恢復(fù)培養(yǎng)和真菌生物量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)pTRV2-處理植株莖中的真菌生物量顯著多于pTRV2-處理植株（圖8-A、8-B），表明抑制的表達(dá)增強(qiáng)了大麗輪枝菌的致病力。

3 討論

木糖苷酶基因?qū)τ诮到庵参锛?xì)胞壁中的木聚糖至關(guān)重要，篩選大麗輪枝菌致病相關(guān)木糖苷酶基因，可為防治由該菌引起的植物黃萎病提供理論依據(jù)。木糖苷酶基因?qū)儆谔擒账饷福╣lycoside hydrolases，GH）家族，該家族編碼的酶能夠以?xún)?nèi)切或外切的方式水解含糖化合物中的糖苷鍵。根據(jù)CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)依據(jù)氨基酸序列相似性對(duì)于糖苷水解家族的分類(lèi)，共有168個(gè)公認(rèn)的家族（GH1-168）。本研究從大麗輪枝菌中鑒定了13個(gè)木糖苷酶基因，它們分別屬于GH3、GH31和GH43家族。真菌的-木糖苷酶大都屬于GH3家族糖苷水解酶[24]。與前人研究不同，本研究13個(gè)基因中大多數(shù)（、、、、、、、和）屬于GH43家族，僅有1個(gè)（）屬于GH3家族。有的-木糖苷酶是雙功能酶，具有雙重酶催化活性[25-26]，本研究中和具有-木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶雙重酶活性，具有-葡糖苷酶/-木糖苷酶活性。-木糖苷酶在低聚木糖的末端還原端催化末端未經(jīng)取代的木糖甙水解，13個(gè)基因中包括3個(gè)-木糖苷酶基因（、和），均屬于GH31家族成員。

A：pTRV2-00和pTRV2-VdxyL3植株接種大麗輪枝菌14 d和21 d表型Disease symptom of the pTRV2-00 and pTRV2-VdxyL3 treated plants at 14 and 21 dpi；B：接種大麗輪枝菌14 d后pTRV2-00和pTRV2-VdxyL3處理植株的株高Plant height of the pTRV2-00 and pTRV2-VdxyL3 treated plants at 14 dpi；C：pTRV2-00和pTRV2-VdxyL3植株接種大麗輪枝菌14 d和 21 d病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)Disease index of the pTRV2-00 and pTRV2-VdxyL3 treated plants at 14 and 21 dpi；D：pTRV2-00和pTRV2-VdxyL3植株接種大麗輪枝菌14 d后莖稈的表型Disease symptom in stems of the pTRV2-00 and pTRV2-VdxyL3 treated plants at 14 dpi

A：接種大麗輪枝菌14 d后pTRV2-00和pTRV2-VdxyL3處理植株莖稈中病原菌相對(duì)含量測(cè)定Quantification of the relative fungal biomass in stems of the pTRV2-00 and pTRV2-VdxyL3 treated plants at 14 dpi；B：接種大麗輪枝菌14 d后pTRV2-00和pTRV2-VdxyL3處理植株莖稈大麗輪枝菌恢復(fù)培養(yǎng)。將莖稈置于PDA培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后拍照Fungal isolation in the stem sections from pTRV2-00 and pTRV2-VdxyL3 treated plants at 14 dpi. Stems were plated on PDA medium. Photos were taken at 7 dpi of culture at 25℃

了解宿主與病原體的相互作用對(duì)于黃萎病的防控具有重要意義。在這個(gè)病理系統(tǒng)中，病害循環(huán)始于大麗輪枝菌微菌核對(duì)宿主根系分泌物刺激的響應(yīng)和萌發(fā)[27]。感病品種根系分泌物促進(jìn)大麗輪枝菌的生長(zhǎng)，而抗病品種根系分泌物抑制其生長(zhǎng)[28-29]。EI-Bebany等[27]研究發(fā)現(xiàn)，感病馬鈴薯品種根系分泌物誘導(dǎo)后大麗輪枝菌中差異基因的數(shù)量多于中抗品種根系分泌物誘導(dǎo)后的數(shù)量，高侵染力病原菌中受感病品種根系分泌物誘導(dǎo)表達(dá)的基因被認(rèn)為與致病相關(guān)；Zhang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，感病棉花品種根系分泌物誘導(dǎo)后大麗輪枝菌中差異基因的數(shù)量明顯多于耐病和抗病品種根系分泌物誘導(dǎo)后的數(shù)量，一些編碼水解酶和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因受感病品種根系分泌物誘導(dǎo)后明顯上調(diào)，被認(rèn)為與致病相關(guān)；Xu等[9]研究表明，受棉花根誘導(dǎo)后表達(dá)量明顯上調(diào)，敲除和回補(bǔ)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該基因在大麗輪枝菌的產(chǎn)孢、菌絲體的發(fā)育、微菌核的形成和致病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，該基因HIGS沉默棉株的抗病性明顯增強(qiáng)。上述研究表明棉花根系分泌物能夠影響大麗輪枝菌中基因的表達(dá)，受其誘導(dǎo)表達(dá)的基因在大麗輪枝菌致病及宿主-病原體互作過(guò)程中可能發(fā)揮著重要的作用。本研究利用qRT-PCR對(duì)不同抗/感棉花品種根系分泌物誘導(dǎo)后大麗輪枝菌中6個(gè)木糖苷酶基因的表達(dá)量變化進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)均受根系分泌物的誘導(dǎo)，因此可將其作為研究大麗輪枝菌致病及宿主-病原體互作機(jī)制的候選基因。

大麗輪枝菌的致病分子機(jī)制非常復(fù)雜，近年來(lái)其致病相關(guān)基因的研究取得了階段性的進(jìn)展。大麗輪枝菌致病相關(guān)基因包括效應(yīng)因子和細(xì)胞壁降解酶相關(guān)基因，如[30]、[8]、[31]和[32]等；生長(zhǎng)-致病相關(guān)基因，如[33]、[34]、[35]和[36]等。盡管認(rèn)為大麗輪枝菌分泌蛋白中的細(xì)胞壁降解酶能夠參與植物細(xì)胞壁的降解，促進(jìn)病原菌的定殖，但相關(guān)基因的鑒定及功能研究?jī)H有少量報(bào)道。如果膠代謝相關(guān)基因和被敲除后，大麗輪枝菌的致病力降低[37]。調(diào)控果膠酶和半乳糖酶活性的被敲除后，大麗輪枝菌的致病力降低[31]。毒力因子與植物細(xì)胞壁降解有關(guān)，該基因的缺失突變體致病力降低[32]。趙玉蘭等[38]利用HIGS技術(shù)快速篩選獲得了4個(gè)細(xì)胞壁降解相關(guān)基因，轉(zhuǎn)化4個(gè)靶標(biāo)基因的煙草以及混合注射的煙草病情指數(shù)均降低，抗病性增強(qiáng)。上述研究表明將編碼細(xì)胞壁降解酶的基因敲除或沉默導(dǎo)致大麗輪枝菌的致病力降低。本研究利用HIGS技術(shù)沉默后大麗輪枝菌的致病力明顯增強(qiáng)，導(dǎo)致處理棉株的病情指數(shù)明顯增高，這與前人細(xì)胞壁降解酶基因的功能研究結(jié)果不一致[31-32,37-38]，推測(cè)可能參與誘導(dǎo)植物體內(nèi)的抗性機(jī)制，增強(qiáng)植株的抗性，而該基因的沉默表達(dá)導(dǎo)致植株抗病性減弱。鑒于大麗輪枝菌致病分子機(jī)制的復(fù)雜性，的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

利用生物信息學(xué)方法從大麗輪枝菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出13個(gè)木糖苷酶基因，包括9個(gè)糖苷水解酶43家族成員，1個(gè)3家族成員和3個(gè)31家族成員。6個(gè)木糖苷酶基因的表達(dá)均受到棉花根系分泌物的誘導(dǎo)，暗示其在大麗輪枝菌致病及宿主-病原體互作過(guò)程中可能發(fā)揮著重要的作用。通過(guò)HIGS技術(shù)對(duì)木糖苷酶基因在大麗輪枝菌侵染過(guò)程中的功能進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)被干擾后，轉(zhuǎn)化棉株的病情指數(shù)增高，抗病性減弱，表明與大麗輪枝菌的致病性相關(guān)。

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Identification of Xylosidase Genes fromand Functional Analysis Based on HIGS Technology

ZHANG XiaoXue, SUN TianGe, ZHANG YingChun, CHEN LiHua, ZHANG XinYu, LI YanJun, SUN Jie

College of Agriculture, Shihezi University, Shihezi 832003, Xinjiang

【】The objective of this research is to identify xylosidase genes fromand study the relationship between xylosidase genes and pathogenicity of, which will provide a theoretical basis for exploring the molecular mechanism of pathogenicity ofand a scientific basis for formulating better control strategies for verticillium wilt.【】All xylosidase genes were identified from the genome database ofby bioinformatics, and their protein domain, chromosomal location and phylogenetic relationship were analyzed. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) was used to detect the expression pattern of xylosidase genes inculturedwith different root exudates from resistant and susceptible cotton varieties for 0, 6, 12, 24 and 48 h. The function of one of the xylosidase geneswas analyzed by using host-induced gene silencing (HIGS) method. The target fragment ofwas injected into cotton, and thenVd991 was inoculated to those plants injected with target fragment ofby using root-dip approach. The phenotype of transformed plants was observed and the disease index was counted, meanwhile, the biomass of fungi and the expression level of【】Bioinformatics analysis showed that there were 13 xylosidase genes (-) in, whose coding sequences ranged from 1 461 to 2 544 bp, molecular weight of the encoded proteins ranged from 38.78 to 90.97 kD, and theoretical isoelectric point ranged from 4.67 to 5.89. Protein domain phylogenetic relationship analysis showed that there were 9 glycoside hydrolase 43 family members, 1 glycoside hydrolase 3 family member and 3 glycoside hydrolase 31 family members included in xylosidase genes. The chromosomal location analysis showed that the 13 genes were distributed on 6 chromosomes and no gene clusters were formed. qRT-PCR analysis showed that the expression of 6 xylosidase genes was induced by cotton root exudates. After being cultured in one or more root exudates for 6 h or 12 h, expression levels of these genes were significantly increased and then decreased. Among 6 genes, the expression level ofincreased significantly after sensing root exudates from sea island cotton. The results based on HIGS technology showed that after 14 and 21 days of inoculation, the disease symptom of cotton plants transformed withinterfering fragment was more serious, and the disease index (33.3 and 83.9) was significantly higher than that of empty vector control (21.7 and 66.1). qRT-PCR analysis showed that cotton plants transformed withinterfering fragment had higher fungal biomass but lower expression level ofcompared to the empty vector control.【】Thegene silencing by using HIGS technology lead to a significant decrease of cotton resistance to, indicating thatmay play a certain role in the pathogenesis ofand host-pathogen interaction.

cotton;; verticillium wilt;; xylosidase; host-induced gene silencing (HIGS)

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.15.007

2020-11-09；

2020-12-18

國(guó)家自然科學(xué)基金（31460360）、石河子大學(xué)高層次人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目（RCZK202019）

張小雪，E-mail：943124507@qq.com。通信作者李艷軍，E-mail：lyj20022002@sina.com

（責(zé)任編輯 岳梅）