艾司奧美拉唑?qū)α沁拎ぴ诖笫篌w內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為的影響

賈茹 魏世杰 張文萍 買淑霞 蔣韶婓 黨宏萬

中圖分類號(hào) R969.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）13-1596-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.13.10

摘 要 目的：建立測(cè)定大鼠血漿中柳氮磺吡啶（SSZ）代謝產(chǎn)物磺胺吡啶（SP）濃度的方法，并探討艾司奧美拉唑（ESOM）對(duì)SSZ在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為的影響。方法：將雄性SD大鼠隨機(jī)分為SSZ組和SSZ+ESOM組，每組6只。SSZ+ESOM組大鼠連續(xù)灌胃艾司奧美拉唑腸溶片[90 mg/（kg·d）]14天;第15天時(shí)，兩組大鼠單次灌胃柳氮磺吡啶腸溶片（90 mg/kg），并在給藥后0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24、36、48、72 h時(shí)于其眼內(nèi)眥取血。血漿經(jīng)甲醇沉淀蛋白后，以地西泮為內(nèi)標(biāo)，以Agilent XDR-C18為色譜柱，以甲醇-0.1%甲酸溶液（梯度洗脫）為流動(dòng)相，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)血漿中SSZ代謝產(chǎn)物SP的濃度;采用DAS 3.0.1軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)并進(jìn)行組間比較。結(jié)果：SP檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為2～1 000 ng/mL，方法學(xué)考察結(jié)果符合《中國(guó)藥典》相應(yīng)要求。SSZ+ESOM組和SSZ組大鼠體內(nèi)SP的AUC0-t、tmax、t1/2z、cmax、MRT0-t等藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：所建方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高，可用于血漿中SSZ代謝產(chǎn)物SP濃度的檢測(cè);ESOM對(duì)SSZ在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為無明顯影響。

關(guān)鍵詞 柳氮磺吡啶;磺胺吡啶;艾司奧美拉唑;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;藥動(dòng)學(xué)行為

Effects of Esomeprazole on Pharmacokinetic Behavior of Sulfasalazine in Rats

JIA Ru1，2，WEI Shijie1，3，ZHANG Wenping1，3，MAI Shuxia1，JIANG Shaofei4，DANG Hongwan1，3（1. Dept. of Pharmacy， General Hospital of Ningxia Medical University， Yinchuan 750004， China; 2. College of Pharmacy， Ningxia Medical University， Yinchuan 750004， China; 3. Institute of Clinical Pharmacology， General Hospital of Ningxia Medical Universtiy， Yinchuan 750004， China; 4. Dept. of Pharmacy， Qingdao Jiaozhou Central Hospital， Shandong Qingdao 266300， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To develop a method for determining the plasma concentration of sulfasalazine （SSZ） metabolite sulfapyridine （SP） in rats， and to investigate the effects of esomeprazole （ESOM） on the pharmacokinetic behavior of SSZ in rats. METHODS： Male SD rats were randomly divided into SSZ group and SSZ+ESOM group， with 6 rats in each group. SSZ+ESOM group were given Esomeprazole enteric-coated tablets [90 mg/（kg·d）] intragastrically for 14 days. On the 15th day， the rats in 2 groups were given Sulfasalazine enteric coated tablets （90 mg/kg） intragastrically， and blood sample was collected from the inner canthus at 0.5， 1， 1.5， 2， 3， 4， 6， 8， 10， 12， 24， 36， 48， 72 h after administration. After protein precipitation with methanol， using diazepam as internal standard， Agilent XDR-C18 column was adopted with methanol-0.1% formic acid solution （gradient elution） as mobile phase. The concentration of SSZ metabolite SP in plasma was determined by LC-MS/MS. The pharmacokinetic parameters were calculated by using DAS 3.0.1 software and compared between 2 groups. RESULTS： The linear range of SP were 2-1 000 ng/mL. The methodology met the requirements of Chinese Pharmacopeia. There was no statistical significance in pharmacokinetic parameters of SP between 2 groups， such as AUC0-t， tmax， t1/2z， cmax， MRT0-t （P>0.05）. CONCLUSIONS： The established method is simple， rapid and sensitive; it can be used for the concentration determination of SSZ metabolite SP in plasma. ESOM has no significant effect on the pharmacokinetic behavior of SSZ in rats.

KEYWORDS? ?Sulfasalazine; Sulfapyridine; Esomeprazole; LC-MS/MS; Pharmacokinetic behavior

質(zhì)子泵抑制劑（proton pump inhibitors，PPIs）因高效的抑酸作用而被廣泛用于胃腸道疾病的臨床治療。目前，PPIs除用于治療胃食管反流病、胃十二指腸潰瘍和幽門螺桿菌感染等疾病外，還被用于預(yù)防由非甾體抗炎藥（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）引發(fā)的胃潰瘍疾病[1]。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（aheumatoid arthritis，RA）是一種全身性自身免疫疾病，其特征為多關(guān)節(jié)的慢性炎癥、骨侵蝕和軟骨破壞[2]。柳氮磺吡啶（sulfasalazine，SSZ）是傳統(tǒng)的合成類抗風(fēng)濕藥物，是治療RA的基石藥物，臨床通常在使用SSZ的基礎(chǔ)上根據(jù)患者的病情聯(lián)合使用NSAIDs[3]。近年來，國(guó)外研究表明，SSZ聯(lián)合PPIs代表藥物艾司奧美拉唑（esomeprazole，ESOM）可協(xié)同抑制黑色素瘤和肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移;針對(duì)某些難治性腫瘤，二者聯(lián)用也顯示出一定的臨床價(jià)值[4]。此外，最新的研究結(jié)果證實(shí)，ESOM和SSZ可作為孕產(chǎn)婦子癇早期的備選治療藥物，兩者聯(lián)合使用后可降低可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體的分泌和內(nèi)皮功能障礙標(biāo)志物的水平，從而達(dá)到有效防治先兆子癇的目的[5]。

有研究指出，SSZ需在腸道細(xì)菌產(chǎn)生的偶氮還原酶參與下釋放出發(fā)揮藥效的磺胺吡啶（sulfapyridine，SP）和5-氨基水楊酸（5-aminosalicylic，5-ASA）[6]。其中，約90%的SP在大腸被吸收，而僅有20%～30%的5-ASA被吸收，未被吸收的部分則經(jīng)大便排出[7]。同時(shí)，該藥的不良反應(yīng)發(fā)生率為71%，其中2/3涉及胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，主要表現(xiàn)為惡心、嘔吐、厭食、消化不良、腹痛、頭痛、眩暈等，約20%～30%的患者因此而停藥[7-8]。SP是SSZ治療RA的有效成分，且與服用SSZ后產(chǎn)生的不良反應(yīng)密切相關(guān)[9-11]。有學(xué)者研究認(rèn)為，當(dāng)臨床以SSZ治療潰瘍性結(jié)腸炎且患者體內(nèi)SP血藥濃度達(dá)20～50 ?g/mL時(shí)，療效較好、不良反應(yīng)較少;而當(dāng)血藥濃度超過50 ?g/mL時(shí)，則易引發(fā)不良反應(yīng)[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，PPIs可導(dǎo)致腸道細(xì)菌過度生長(zhǎng)[12-14]。那么，吸收、代謝過程受腸道菌群影響的SSZ與促進(jìn)腸道細(xì)菌生長(zhǎng)的PPIs聯(lián)用時(shí)，前者的藥動(dòng)學(xué)行為是否會(huì)受后者的影響是值得探究的問題?；诖耍疚臄M建立測(cè)定大鼠血漿中SSZ代謝產(chǎn)物SP濃度的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS），通過分別測(cè)定聯(lián)用ESOM和未聯(lián)用ESOM大鼠體內(nèi)SP的血藥濃度，計(jì)算并比較兩者的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，以進(jìn)一步明確ESOM是否會(huì)對(duì)SSZ的藥動(dòng)學(xué)過程產(chǎn)生影響，為提高SSZ的臨床療效及安全性提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括LC-30A型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司），API4000型串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀及配備的電噴霧離子源、Analyst 1.5.1分析操作軟件（美國(guó)Applied Biosystems公司），Centrifuge 5804R型臺(tái)式低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），VORTEX-GENIE2型渦旋混合器（美國(guó)Scientific Industries公司），Mettler型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）等。

1.2 主要藥品和試劑

柳氮磺吡啶腸溶片（批號(hào)09190504，規(guī)格0.25 g）購(gòu)自上海信誼天平藥業(yè)有限公司;艾司奧美拉唑鎂腸溶片[批號(hào)1908009，規(guī)格40 mg（按C17H19N3O3S計(jì)算）]購(gòu)自阿斯利康制藥有限公司;0.9%氯化鈉注射液（批號(hào)A20040402B，規(guī)格250 mL ∶ 2.25 g）購(gòu)自四川科倫藥業(yè)有限公司;SP對(duì)照品（批號(hào)B24271，純度≥98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;地西泮對(duì)照品（內(nèi)標(biāo)，批號(hào)171225-101304，純度≥99.9%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;甲酸、甲醇均為色譜純，水為純凈水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為SPF級(jí)SD大鼠，雄性，共12只，體質(zhì)量250～310 g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（寧）2015-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

精密稱取SP對(duì)照品10 mg，置于10 mL棕色量瓶中，用50%甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品貯備液。精密稱取內(nèi)標(biāo)地西泮對(duì)照品10 mg，置于10 mL棕色量瓶中，用50%甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)母液;用50%甲醇進(jìn)一步將上述內(nèi)標(biāo)母液稀釋至200 ng/mL，即得內(nèi)標(biāo)溶液。以上所有溶液均于4 ℃下保存。臨用前，SP對(duì)照品貯備液需用50%甲醇稀釋成所需質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2 藥液的配制

2.2.1 ESOM藥液 精密稱取研細(xì)的艾司奧美拉唑腸溶片粉末適量，用0.9%氯化鈉注射液溶解，配制成質(zhì)量濃度為15 mg/mL的ESOM藥液，備用。

2.2.2 SSZ藥液 精密稱取研細(xì)的柳氮磺吡啶腸溶片粉末適量，用0.9%氯化鈉注射液溶解，配制成質(zhì)量濃度為30 mg/mL的SSZ藥液，備用。

2.3 血漿樣品的處理

取大鼠血漿樣品50 ?L，置于1.5 mL離心管中，加入50%甲醇50 ?L，渦旋2 min，然后加入內(nèi)標(biāo)溶液（200? ?ng/mL）50 ?L和甲醇200 ?L，渦旋5 min;于4 ℃下以14 000 r/min離心10 min，取上清液100 ?L，加水100 ?L，渦旋2 min;于4 ℃下以14 000 r/min離心2 min，取上清液，進(jìn)行LC-MS/MS分析。

2.4 色譜與質(zhì)譜條件

2.4.1 色譜條件 以Agilent XDR-C18（2.18 mm×100 mm，1.8 μm）為色譜柱，以Shim-pack GVP-ODS（2.0 mm×5 mm，2.2 μm）為保護(hù)柱;以甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～0.8 min，60%B;0.8～1.8 min，60%B→20%B;1.8～4 min，20%B;4～4.2 min，20%B→60%B;4.2～5 min，60%B）;流速為0.30 mL/min;柱溫為40 ℃;進(jìn)樣量為10 ?L。

2.4.2 質(zhì)譜條件 以電噴霧離子源為離子源，離子噴射電壓為4.5 kV，離子源溫度為600 ℃;霧化氣流速為45 L/h，輔助加熱氣流速為45 L/h;氣簾氣（N2）壓力為14 psi，碰撞氣壓力為7 psi。以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式進(jìn)行正離子掃描，用于定量分析的離子對(duì)分別為m/z 250.1→156.0（SP）、m/z 285.3→193.1（內(nèi)標(biāo)），碰撞能量分別為25、43 eV，掃描時(shí)間為200 ms。SP和內(nèi)標(biāo)的二級(jí)質(zhì)譜圖見圖1。

2.5 專屬性考察

分別取不同來源的空白血漿50 μL，用等體積的50%甲醇代替內(nèi)標(biāo)溶液，其余按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，得空白血漿色譜圖（圖2A）;將質(zhì)量濃度為2 ng/mL的SP標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白血漿中，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，得到空白血漿+SP+內(nèi)標(biāo)色譜圖（圖2B）;取單只大鼠灌胃柳氮磺吡啶腸溶片0.5 h后采集的血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，得到大鼠血漿樣品色譜圖（圖2C）。由圖2可見，SP和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間約分別為1.2、3.3 min，內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾待測(cè)成分的檢測(cè)。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和定量下限的考察

以50%甲醇為溶劑，按“2.1”項(xiàng)下方法配制7個(gè)不同質(zhì)量濃度的SP標(biāo)準(zhǔn)溶液;分別移取各標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL至1.5 mL離心管中，加入空白血漿50 μL，依次配制成SP質(zhì)量濃度分別為2、5、20、100、500、800、1 000 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以SP質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、SP峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（y）為縱坐標(biāo)，應(yīng)用加權(quán)最小二乘法（w=1/x2）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=0.002 97x+0.002 02（r=0.998 7）。這表明SP檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為2～1 000 ng/mL，定量下限為2 ng/mL。

以50%甲醇為溶劑，按“2.1”項(xiàng)下方法配制相應(yīng)質(zhì)量濃度的SP標(biāo)準(zhǔn)溶液;精密移取該標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL至1.5 mL離心管中，加入空白血漿50 μL，配制成SP質(zhì)量濃度為2 ng/mL的定量下限血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。每個(gè)分析批平行操作6個(gè)樣品、連續(xù)操作3個(gè)分析批，分別根據(jù)同批隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算SP的實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度，并考察批內(nèi)、批間精密度[以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示，下同]和準(zhǔn)確度[以相對(duì)誤差（RE）表示，下同]，結(jié)果見表1。由表1可見，定量下限血漿樣品的批內(nèi)、批間RSD均不超過10%，與理論質(zhì)量濃度的RE均在±5%之內(nèi)，符合2020年版《中國(guó)藥典》（四部）“生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”的要求[15]。

2.7 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)

以50%甲醇為溶劑，按“2.6”項(xiàng)下方法配制SP質(zhì)量濃度分別為4、80、800 ng/mL的低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控（QC）樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。每個(gè)分析批平行操作6個(gè)樣品、連續(xù)操作3個(gè)分析批，分別根據(jù)同批隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各QC樣品的實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度，并計(jì)算其批內(nèi)、批間精密度和準(zhǔn)確度，結(jié)果見表1。由表1可見，SP低、中、高質(zhì)量濃度QC樣品的批內(nèi)、批間RSD均小于11%，與理論質(zhì)量濃度的RE均在±5%之內(nèi)，符合2020年版《中國(guó)藥典》（四部）“生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”的要求[15]。

2.8 稀釋可靠性考察

以50%甲醇為溶劑，按“2.6”項(xiàng)下方法配制SP質(zhì)量濃度為4 000 ng/mL的高質(zhì)量濃度血漿樣品，再用空白血漿稀釋5倍，按此稀釋倍數(shù)平行操作6份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。根據(jù)同批隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度，并乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算最終質(zhì)量濃度，將該值與對(duì)應(yīng)的理論質(zhì)量濃度進(jìn)行比較，用以考察精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果，大鼠血漿中SP稀釋5倍后，所得樣品實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度的RSD為1.1%（n=6），與理論質(zhì)量濃度的RE為-0.5%，表明稀釋可靠性良好。

2.9 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)

以50%甲醇為溶劑，按“2.6”項(xiàng)下方法配制SP質(zhì)量濃度分別為4、80、800 ng/mL的低、中、高質(zhì)量濃度QC血漿樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度樣品平行制備6份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄相應(yīng)峰面積（A）;將不同來源的空白血漿按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再加入相應(yīng)濃度的SP標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，使質(zhì)量濃度與前者對(duì)應(yīng)，每個(gè)質(zhì)量濃度樣品平行制備6份，按“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄相應(yīng)峰面積（B）;分別配制含內(nèi)標(biāo)且質(zhì)量濃度與前者對(duì)應(yīng)的SP標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄相應(yīng)峰面積（C）。按如下公式計(jì)算提取回收率：提取回收率（%）=A/B×100%，結(jié)果見表2。由表2可見，低、中、高質(zhì)量濃度QC樣品中，SP的提取回收率（以平均值計(jì)）為86.16%～95.26%，RSD均不高于2.47%（n=6）;內(nèi)標(biāo)的提取回收率（以平均值計(jì)）為89.09%，RSD為14.2%（n=6）。按如下公式計(jì)算基質(zhì)因子：基質(zhì)因子=B/C×100%;以SP與內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子的比值作為內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子，結(jié)果見表2。由表2可見，低、中、高質(zhì)量濃度QC樣品的內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子（以平均值計(jì)）為58.80%～62.53%，RSD不超過6.06%，符合2020年版《中國(guó)藥典》（四部）“生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”的要求[15]。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

以50%甲醇為溶劑，按“2.6”項(xiàng)下方法配制SP質(zhì)量濃度分別為4、80、800 ng/mL的低、中、高質(zhì)量濃度QC血漿樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度樣品平行制備5份，考察其在室溫（25 ℃）存放4 h、凍融（-80 ℃～室溫）循環(huán)3次、-80 ℃冰箱保存1個(gè)月再處理以及處理后于4 ℃冰箱中存放24 h的穩(wěn)定性。所有樣品均按同批隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度及RSD。結(jié)果，低、中、高質(zhì)量濃度QC血漿樣品在上述條件下，實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度的RSD均小于6.6%（n=5），提示樣品穩(wěn)定性良好。

3 SSZ藥動(dòng)學(xué)研究

3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案

將SD大鼠隨機(jī)分為SSZ組和SSZ+ESOM組，每組6只。SSZ+ESOM組大鼠每天于固定時(shí)間點(diǎn)灌胃15? mg/mL的ESOM藥液（給藥劑量為3.6 mg/kg[16]），每天1次，連續(xù)給藥14天;SSZ組大鼠不作處理。所有大鼠在相同環(huán)境下正常喂養(yǎng)，直到14天末次給予ESOM后，禁食、不禁水12 h，同時(shí)單次灌胃30 mg/mL的SSZ藥液（給藥劑量為90 mg/kg[10，16]）。分別在此次給藥后0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24、36、48、72 h于大鼠眼內(nèi)眥采血（采血量約300 ?L），置于肝素抗凝管中，于4 000 r/min離心10 min，分離血漿于-80 ℃保存，備用。

3.2 平均藥-時(shí)曲線的繪制及藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的計(jì)算

取“3.1”項(xiàng)下凍存的血漿樣品，放置至室溫，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積并按隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其血漿中SP的質(zhì)量濃度（各時(shí)間點(diǎn)的血漿樣品需用空白血漿稀釋5倍），再采用Origin Pro 9.1軟件繪制其平均藥-時(shí)曲線，結(jié)果見圖3。

采用DAS 3.0.1軟件以非房室模型方法計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。其中，對(duì)cmax和AUC先進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后再進(jìn)行t檢驗(yàn);對(duì)tmax進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，對(duì)t1/2z、MRT0-t、CLz、Vz進(jìn)行t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見表3。

由表3可見，SSZ+ESOM組與SSZ組比較，各藥動(dòng)學(xué)參數(shù)組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示ESOM對(duì)SSZ在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為并無明顯影響。

4 討論

樣品的前處理是血漿中藥物定量分析至關(guān)重要的一步。本課題組前期曾嘗試使用25%醋酸溶液和叔丁基甲醚或乙酸乙酯進(jìn)行液液萃取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，此操作過程復(fù)雜且所需血漿量（500 μL）較大。與之相比，甲醇沉淀蛋白法操作過程簡(jiǎn)便、快速;同時(shí)與已有的LC-MS/MS法比較[17]，本方法的血漿用量（50 μL）更少，更有利于樣品的批量采集。

在前期工作中，本課題組分別在正離子和負(fù)離子模式下對(duì)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在正離子模式下可獲得更寬的線性范圍和更強(qiáng)的色譜峰響應(yīng)。同時(shí)，本課題組曾嘗試使用C8和C18兩種反相色譜柱進(jìn)行分離，通過對(duì)流動(dòng)相中有機(jī)相和水相的比例進(jìn)行反復(fù)調(diào)試并結(jié)合內(nèi)標(biāo)物的篩選，最終確定使用色譜柱Agilent XDR-C18（2.18 mm×100 mm，1.8 μm），內(nèi)標(biāo)選擇地西泮，流動(dòng)相甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（B）初始比例為40 ∶ 60（V/V）。方法學(xué)考察結(jié)果顯示，待測(cè)成分SP和內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)均較強(qiáng)，色譜峰峰形、峰強(qiáng)度和分辨率均較優(yōu);本方法的精密度、準(zhǔn)確度均符合2020年版《中國(guó)藥典》（四部）“生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”的要求[15];提取方法、基質(zhì)效應(yīng)均不影響待測(cè)成分的定量分析。這提示本法可行、簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)。與現(xiàn)已報(bào)道的分光光度法[18]、LC-MS/MS法[17]和高效液相色譜法[9，19-20]相比，本法操作簡(jiǎn)單、所需血漿量少，且具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確性。

SP是SSZ經(jīng)腸道菌群分解所得的主要代謝物，約90%在結(jié)腸中被吸收入血。本文通過測(cè)定SSZ的代謝物SP在大鼠體內(nèi)的血藥濃度，進(jìn)一步研究ESOM對(duì)SSZ藥動(dòng)學(xué)行為的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)聯(lián)合使用ESOM時(shí)，大鼠體內(nèi)SP的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)cmax、AUC、t1/2z、MRT、CLz、Vz和tmax均無明顯變化。這不能排除可能與ESMO在大鼠體內(nèi)作用時(shí)間較短、不足以使其腸道菌群發(fā)生改變有關(guān)。此外，有研究表明，長(zhǎng)時(shí)間使用PPIs可導(dǎo)致腸道中厚壁菌門細(xì)菌增多[21];同時(shí)，除厚壁菌門中的葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、梭菌屬外，真桿菌屬、擬桿菌屬等多種細(xì)菌也已經(jīng)被證實(shí)能夠產(chǎn)生偶氮還原酶[22]。因此，SSZ發(fā)生偶氮還原反應(yīng)所需的酶不一定是由ESOM增多的菌株所產(chǎn)生。在研究過程中，筆者還發(fā)現(xiàn)，在給藥后的48～72 h內(nèi)，兩組大鼠體內(nèi)的SP的血藥濃度略有上述趨勢(shì)，這可能與部分未被吸收入血的SSZ隨膽汁轉(zhuǎn)移至腸道中并發(fā)生偶氮還原反應(yīng)，生成SP被吸收入血有關(guān)[23]。

綜上所述，本研究成功建立了測(cè)定大鼠血漿中SSZ代謝產(chǎn)物SP濃度的LC-MS/MS法，該方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈敏、所需血漿量少，對(duì)SP的血藥濃度監(jiān)測(cè)具有重要的參考價(jià)值。但本研究并未發(fā)現(xiàn)ESOM對(duì)SSZ藥動(dòng)學(xué)行為有明顯影響。由于本研究ESOM的用藥時(shí)間有限，其是否足以導(dǎo)致大鼠腸道菌群發(fā)生改變等，都有待于后續(xù)研究進(jìn)一步探討。

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（收稿日期：2021-02-22 修回日期：2021-05-17）

（編輯：張?jiān)拢?/p>