阿魏酸對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響

音金萍 卓少元

中圖分類號(hào) R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）13-1565-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.13.05

摘 要 目的：研究阿魏酸對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響。方法：采用CCK-8法篩選阿魏酸的給藥濃度;采用Western blot法篩選白細(xì)胞介素6（IL-6）誘導(dǎo)磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白及轉(zhuǎn)錄激活子3（p-STAT3）蛋白高表達(dá)的HepG2細(xì)胞模型的最佳造模濃度。將HepG2細(xì)胞分為空白對(duì)照組、模型組、阿魏酸組（0.5 mmol/L）和陽性對(duì)照組（p-STAT3抑制劑C188-9，10 μmol/L），除空白對(duì)照組外，模型組加入IL-6、各給藥組加入IL-6和相應(yīng)藥物分別進(jìn)行培養(yǎng)。采用CCK-8法、 Transwell法和Annexin V-FITC/PI雙染色法分別檢測(cè)各組細(xì)胞存活率、侵襲數(shù)和早期、晚期凋亡率;采用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中p-STAT3、胱天蛋白酶3（caspase-3）、鋅指蛋白（ZBP-89）和波形蛋白（vimentin）的表達(dá)水平?；赑DB蛋白數(shù)據(jù)庫，以STAT3高度相似晶體結(jié)構(gòu)1BG1為對(duì)接模板，以Tyr705周圍的區(qū)域?yàn)榧俣ǖ慕Y(jié)合口袋，進(jìn)行阿魏酸與STAT3蛋白的分子對(duì)接分析。結(jié)果：選擇以0.5 mmol/L 阿魏酸干預(yù)HepG2細(xì)胞48 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件，以50 ng/mL IL-6為造模條件。與空白對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞侵襲數(shù)和p-STAT3/STAT3比值、vimentin蛋白表達(dá)水平均顯著增加或升高（P<0.05或P<0.01），細(xì)胞晚期凋亡率和caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，阿魏酸組和陽性對(duì)照組細(xì)胞存活率、侵襲數(shù)、p-STAT3/STAT3比值和vimentin蛋白表達(dá)水平均顯著減少或降低（P<0.05或P<0.01），細(xì)胞早期凋亡率（阿魏酸組除外）、晚期凋亡率和caspase-3、ZBP-89（陽性對(duì)照組除外）蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。分子對(duì)接結(jié)果表明，阿魏酸的羧酸基團(tuán)與Asn581、Lys591分別存在1.9?、2.0?的氫鍵作用，結(jié)合能為-4.4 kcal/mol。結(jié)論：阿魏酸可能通過與STAT3磷酸化位點(diǎn)直接結(jié)合來抑制p-STAT3的活性;并可通過STAT3依賴性途徑上調(diào)caspase-3蛋白表達(dá)，或可通過STAT3非依賴性途徑上調(diào)ZBP-89蛋白表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)vimentin蛋白表達(dá)，從而抑制HepG2細(xì)胞的增殖、侵襲與凋亡。

關(guān)鍵詞 阿魏酸;人肝癌HepG2細(xì)胞;信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白及轉(zhuǎn)錄激活子3;胱天蛋白酶3;波形蛋白

Effects of Ferulic Acid on the Proliferation， Invasion and Apoptosis of HepG2 Hepatocellular Carcinoma Cells

YIN Jinping，ZHUO Shaoyuan（School of Basic Medical Science， Guangxi University of TCM， Nanning 530200， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects of ferulic acid on the proliferation， invasion and apoptosis of HepG2 hepatocelluar carcinoma cells. METHODS： CCK-8 assay was used to screen the concentration of ferulic acid. Western blot assay was adopted to screen the optimal concentration of interleukin 6 （IL-6） to induce HepG2 cell model with high expression of phosphorylated signal transduction protein and activator 3 （p-STAT3） protein.? HepG2 cell were divided into blank control group， model group， ferulic acid group （0.5 mmol/L） and positive control group （p-STAT3 inhibitor C188-9， 10 μmol/L）. Except for blank control group， model group treated with IL-6， while administration groups were treated with IL-6 and relevant drugs. Cell survival rate， invasion and apoptosis rate in early and late stage were detected by CCK-8 assay， Transwell assay and Annexin V-FITC/PI double staining， respectively. Western blot assay was used to detect the expression of p-STAT3， caspase-3， ZBP-89 and vimentin proteins in each group. On the basis of the PDB protein database， using 1BG1， a highly similar crystal structure of STAT3， as docking template， using the region around Tyr705 as the putative binding pocket， the docking analysis of ferulic acid with STAT3 protein was carried out. RESULTS： It is selected to use 0.5 mmol/L ferulic acid intervention for 48 h as the follow-up experimental condition; 50 ng/mL IL-6 was selected as the modeling condition. Compared with blank control group， the number of cell invasion， p-STAT3/STAT3 ratio and protein expression of vimentin were increased significantly in model group （P<0.05 or P<0.01）， while late apoptosis rate and protein expression of caspase-3 were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， cell survival rate， the number of cell invasion， p-STAT3/STAT3 ratio and protein expression of vimentin were decreased significantly in ferulic acid group and positive control group （P<0.05 or P<0.01）; early apoptotic rate （except for ferulic acid group）， late? apoptotic rate， the protein expression of caspase-3 and ZBP-89 （except for positive control group） were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. The results of molecular docking showed that the carboxylic groups of ferulic acid could interact with 1.9 ? hydrogen bond of Asn581 and 2.0 ? hydrogen bond of Lys591， with binding energy of -4.4 kcal/mol. CONCLUSIONS： Ferulic acid may inhibit the activity of p-STAT3 by directly binding to the phosphorylation site of STAT3; it may up-regulate the protein expression of caspase-3 via STAT3 dependent pathway， or up-regulate the protein expression of ZBP-89 via STAT3 independent pathway and then down-regulate the protein expression of vimentin， so as to inhibit the proliferation， invasion and apoptosis of HepG2 cells.

KEYWORDS? ?Ferulic acid; HepG2 hepatocellular carcinoma cell; STAT3; Caspase-3; Vimentin

原發(fā)性肝癌是全球第六大常見癌癥，2020年其新發(fā)病例約90.6萬，病死病例約83萬;其中最常見的是肝細(xì)胞癌，約占原發(fā)性肝癌的75%～85%[1]。

阿魏酸是來源于阿魏和當(dāng)歸等中藥的一種酚酸類成分，其性質(zhì)穩(wěn)定、毒性低，具有解毒、保肝等作用，且可有效抑制肝癌細(xì)胞的生長、促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡[2-3]，但其抗肝癌的分子機(jī)制及作用靶點(diǎn)尚未完全明確。研究表明，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白及轉(zhuǎn)錄激活子3（STAT3）和波形蛋白（vimentin）均在肝癌組織或肝癌細(xì)胞株中過度表達(dá)，并作為一種重要的信號(hào)分子和轉(zhuǎn)錄因子，參與肝癌細(xì)胞的快速增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[4-6]。當(dāng)肝癌細(xì)胞受到刺激后，促進(jìn)白細(xì)胞介素6（IL-6）等炎癥因子激活STAT3的磷酸化[7-8]，然后磷酸化STAT3（p-STAT3）以二聚體的形式轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，調(diào)控細(xì)胞凋亡關(guān)鍵分子胱天蛋白酶3（caspase-3）或抑癌因子鋅指蛋白（ZBP-89），進(jìn)而增強(qiáng)vimentin表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲并抑制其凋亡[9-12]。但阿魏酸是否可通過STAT3-vimentin信號(hào)通路發(fā)揮抗肝癌作用尚不明確。

基于此，本研究利用人重組因子IL-6誘導(dǎo)p-STAT3高表達(dá)的人肝癌HepG2細(xì)胞模型，以p-STAT3抑制劑C188-9為陽性對(duì)照[13]，基于STAT3-vimentin信號(hào)通路探討阿魏酸對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響，并結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)阿魏酸與STAT3的結(jié)合位點(diǎn)，探討阿魏酸抗肝癌作用的靶點(diǎn)與分子機(jī)制，以期為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有MCO-18AIC型 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司），Epoch 型全波長酶標(biāo)儀（美國 BioTek公司），LSRFortessa型流式細(xì)胞儀（美國BD公司），PowerPac TM Universal Power Supply型電泳儀、全能型成像分析系統(tǒng)（美國 Bio-Rad公司），垂直式電泳槽和轉(zhuǎn)膜儀（北京六一生物技術(shù)有限公司），MDF-U7386S型超低溫冰箱、ST 16R型高速離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用主要藥品與試劑有高糖DMEM培養(yǎng)基、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（美國 Wisent 公司，批號(hào)分別為319006023、A211-01），0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（美國Gibco公司，批號(hào)分別為2120917、2148169CP），p-STAT3抑制劑C188-9（美國Mce公司，批號(hào)31595），CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司，批號(hào)7E271E8），Matrigel基質(zhì)膠（美國BD公司，批號(hào)354234），十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠快速配制試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)120319191206），Transwell小室（美國Corning公司，批號(hào)09420061），阿魏酸（成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)MUST-20060511，純度≥98%），人重組因子IL-6（美國Peprotech公司，批號(hào)0215102c2793），BCA 蛋白定量試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)14G08A46），ECL 發(fā)光試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)7E34E9），RIRA裂解液（北京索萊寶生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20190922），蛋白磷酸酶抑制劑（杭州弗德生物科技有限公司，批號(hào)20200114），兔源caspase-3多克隆抗體、兔源p-STAT3單克隆抗體（美國CST公司，批號(hào)分別為34、18），兔源GAPDH多克隆抗體、兔源STAT3多克隆抗體、兔源vimentin多克隆抗體、山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為00078427、00081195、00086320、20000217），兔源ZBP-89多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)AC07172366）;其余試劑為實(shí)驗(yàn)室常用規(guī)格，水為純凈水。

1.3 細(xì)胞

本研究所用人肝癌細(xì)胞株HepG2由廣西中藥藥效研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基（以下簡稱培養(yǎng)基）于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞生長至80%時(shí)，向培養(yǎng)瓶中加入0.25%胰酶消化，經(jīng)培養(yǎng)基中和后，制成細(xì)胞懸液，以進(jìn)行傳代和后續(xù)研究。

2.2 阿魏酸的干預(yù)時(shí)間和給藥濃度的篩選

采用CCK-8法進(jìn)行篩選。取對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，加入0.25%胰酶消化，制成密度為5×104 mL-1的細(xì)胞懸液;取100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔板中，然后分為空白對(duì)照組和阿魏酸不同濃度組（0.125、0.25、0.5、1、2、4 mmol/L，濃度參考文獻(xiàn)[14]設(shè)置），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔;并設(shè)置調(diào)零孔（只加培養(yǎng)基不加細(xì)胞，下同）。將細(xì)胞于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，給藥組加入100 μL含相應(yīng)濃度阿魏酸的無血清培養(yǎng)基，空白對(duì)照組加入100 μL無血清培養(yǎng)基。分別于作用12、24、48 h時(shí)，根據(jù)CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說明書操作，采用酶標(biāo)儀于450 nm波長處測(cè)定各組的光密度（OD）值，并計(jì)算細(xì)胞存活率[細(xì)胞存活率=（OD給藥組-OD調(diào)零孔）/（OD空白對(duì)照組-OD調(diào)零孔）×100%]，以篩選阿魏酸的干預(yù)時(shí)間和給藥濃度。

2.3 IL-6造模濃度的篩選

參考文獻(xiàn)[15-16]方法進(jìn)行篩選。取對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，加入0.25%胰酶消化，制成2.5×105 mL-1的細(xì)胞懸液;取2 mL細(xì)胞懸液接種于6孔板中，然后分為空白對(duì)照組和IL-6不同造模濃度組（12.5、25、50、100、200 ng/mL，濃度參考文獻(xiàn)[15-16]設(shè)置），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。待HepG2細(xì)胞生長至80%時(shí)，IL-6不同造模濃度組加入含相應(yīng)質(zhì)量濃度IL-6的無血清培養(yǎng)基2 mL，空白對(duì)照組加入不含IL-6的無血清培養(yǎng)基2 mL，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞，并以? 1 000 r/min離心5 min獲得細(xì)胞沉淀。取細(xì)胞沉淀，加入RIPA裂解液、PMSF和蛋白磷酸酶抑制劑（體積比為100 ∶ 1 ∶ 1）適量，于冰上裂解30 min;于4 ℃條件下以12 000 r/min離心5 min，取上清液，采用BCA 蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。蛋白經(jīng)變性處理后進(jìn)行SDS- PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，于封閉液中封閉30 min;以TBST洗膜30 min，分別加入GAPDH一抗（稀釋度為1 ∶ 5 000）、p-STAT3一抗（稀釋度為1 ∶ 2 000）、STAT3一抗（稀釋度為1 ∶ 2 000），孵育過夜;以TBST洗膜30 min，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 5 000），孵育1 h;以TBST洗膜30 min，加入顯影液，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)成像。采用Image J v1.8.0軟件進(jìn)行分析，以p-STAT3蛋白灰度值與STAT3蛋白灰度值的比值表示STAT3的磷酸化程度，該比值越大，則表示STAT3磷酸化程度越高（下同）。

2.4 分組、造模與給藥

取對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，分為空白對(duì)照組、模型組、阿魏酸組（0.5 mmol/L）和陽性對(duì)照組（C188-9，10 μmol/L，濃度根據(jù)文獻(xiàn)[17]設(shè)置）。待細(xì)胞生長至80%時(shí)，空白對(duì)照組加入無血清培養(yǎng)基（6孔板加入培養(yǎng)基2 mL，96孔板加入培養(yǎng)基100 μL，下同），模型組加入含50 ng/mL IL-6的無血清培養(yǎng)基，阿魏酸組加入含50? ? ?ng/mL IL-6和0.5 mmol/L阿魏酸的無血清培養(yǎng)基，陽性對(duì)照組加入含50 ng/mL IL-6和10 μmol/L C188-9的無血清培養(yǎng)基，再繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

2.5 細(xì)胞存活率的檢測(cè)

采用CCK-8法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，加入0.25%胰酶消化，制成5×104 mL-1的細(xì)胞懸液;取100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔板中，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，按“2.4”項(xiàng)下方法分組、造模與給藥，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置調(diào)零孔。然后根據(jù)CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說明書操作，采用酶標(biāo)儀于450 nm波長處測(cè)定各孔的OD值，并計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.6 細(xì)胞侵襲能力的檢測(cè)

采用Transwell小室法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，按“2.4”項(xiàng)下方法分組、造模與給藥;培養(yǎng)過程中另取培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠（體積比為1 ∶ 8），兩者混勻后，以50 μL/孔加入Transwell小室上層，并于培養(yǎng)箱中過夜風(fēng)干;取上述各組細(xì)胞制成2.5×105 mL-1的細(xì)胞懸液，然后分別取細(xì)胞懸液100 μL加入至Transwell小室上層中，小室下層中加入700 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;取出小室，經(jīng)甲醛固定、結(jié)晶紫染色、棉簽拭去未侵襲細(xì)胞后，于顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野觀察被染成藍(lán)紫色的細(xì)胞，即為侵襲細(xì)胞，并統(tǒng)計(jì)各組的侵襲細(xì)胞數(shù)。

2.7 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

采用Annexin V-FITC/PI雙染色法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，加入0.25%胰酶消化，制成2.5×105 mL-1的細(xì)胞懸液;取2 mL細(xì)胞懸液接種于6孔板中，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，按“2.4”項(xiàng)下方法分組、造模與給藥，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。然后根據(jù)Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說明書方法操作，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡率檢測(cè)。

2.8 細(xì)胞中p-STAT3、STAT3、ZBP-89、caspase-3、vimentin蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，加入0.25%胰酶消化，制成2.5×105 mL-1的細(xì)胞懸液;取2 mL細(xì)胞懸液接種于6孔板中，按“2.4”項(xiàng)下方法分組、造模與給藥，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后，刮取各組細(xì)胞，按“2.3”項(xiàng)下“于4 ℃條件下以12 000 r/min離心5 min獲得細(xì)胞沉淀……于封閉液中封閉30 min”步驟操作，然后以TBST洗膜30 min，分別加入GAPDH一抗（稀釋度為1 ∶ 5 000）、p-STAT3一抗（稀釋度為1 ∶ 2 000）、STAT3一抗（稀釋度為1 ∶ 2 000）、ZBP-89一抗（稀釋度為1 ∶ 1 000）、vimentin一抗（稀釋度為1 ∶? ?1 000）、caspase-3一抗（稀釋度為1 ∶ 1 000），孵育過夜;以TBST洗膜30 min，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 5 000），孵育1 h;以TBST洗膜30 min，加入顯影液，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)成像。采用Image J v1.8.0軟件進(jìn)行分析，以p-STAT3蛋白灰度值與STAT3蛋白灰度值的比值表示STAT3的磷酸化程度，以ZBP-89、vimentin 、caspase-3蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白GAPDH的灰度值的比值表示其表達(dá)水平。

2.9 阿魏酸與STAT3蛋白的分子對(duì)接分析

通過PDB蛋白數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）獲得STAT3蛋白分子4個(gè)高度相似的晶體結(jié)構(gòu)（PDB條目分別為4E68、1BG1、6QHD、3CWG）。通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，抑制劑C188-9主要通過作用于STAT3蛋白的SH2結(jié)構(gòu)域，抑制Tyr705位點(diǎn)的磷酸化[13]。因此，筆者假定該結(jié)構(gòu)域?yàn)榘⑽核崤cSTAT3蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，以1BG1為對(duì)接模板、以Tyr705周圍的區(qū)域?yàn)榧俣ǖ慕Y(jié)合口袋（包括氨基酸Lys591、Arg609、Phe610、Ser611、Ser613、Thr620、Ser636、Val637、Pro639），進(jìn)行分子對(duì)接分析。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。將符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以x±s表示，采用單因素方差分析;不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 阿魏酸干預(yù)時(shí)間和給藥濃度的篩選結(jié)果

阿魏酸干預(yù)12 h后，與空白對(duì)照組比較，阿魏酸4 mmol/L組細(xì)胞存活率顯著降低（P<0.01），阿魏酸其余濃度組細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;阿魏酸干預(yù)24 h后，與空白對(duì)照組比較，阿魏酸2、4 mmol/L組細(xì)胞存活率顯著降低（P<0.05或P<0.01）;阿魏酸干預(yù)48 h后，與空白對(duì)照組比較，阿魏酸0.5、1、2、4 mmol/L組細(xì)胞存活率均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表1?；诖?，本研究采用以0.5 mmol/L 阿魏酸干預(yù)48 h的條件進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

3.2 IL-6造模濃度的篩選結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，IL-6 25、50、100、200 ng/mL組細(xì)胞中p-STAT3/STAT3比值均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與IL-6 50、100 ng/mL組比較，IL-6其余濃度組細(xì)胞中p-STAT3/STAT3比值均顯著降低（P<0.05或P<0.01），但I(xiàn)L-6 50、100 ng/mL兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。基于此，后續(xù)試驗(yàn)采用50 ng/mL IL-6來誘導(dǎo)建立p-STAT3蛋白高表達(dá)的HepG2細(xì)胞模型，詳見圖1、表2。

3.3 阿魏酸對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與模型組比較，阿魏酸組和陽性對(duì)照組細(xì)胞存活率均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;與陽性對(duì)照組比較，阿魏酸組細(xì)胞存活率顯著升高（P<0.01），詳見表3。

3.4 阿魏酸對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲能力的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組HepG2細(xì)胞侵襲數(shù)顯著增加（P<0.01）;與模型組比較，阿魏酸組和陽性對(duì)照組細(xì)胞侵襲數(shù)顯著減少（P<0.01）;與陽性對(duì)照組比較，阿魏酸組細(xì)胞侵襲數(shù)顯著增加（P<0.05），詳見圖2、表3。

3.5 阿魏酸對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組HepG2細(xì)胞的早期凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），晚期凋亡率顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，阿魏酸組細(xì)胞的晚期凋亡率和陽性對(duì)照組細(xì)胞的早期、晚期凋亡率均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與陽性對(duì)照組比較，阿魏酸組細(xì)胞的早期、晚期凋亡率均顯著降低（P<0.01），詳見圖3、表4。

3.6 阿魏酸對(duì)HepG2細(xì)胞中p-STAT3、STAT3、ZBP- 89、caspase-3和vimentin蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中p-STAT3/STAT3比值、vimentin蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，阿魏酸組和陽性對(duì)照組細(xì)胞中p-STAT3/STAT3比值、vimentin蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），caspase-3、ZBP-89（陽性對(duì)照組除外）蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與陽性對(duì)照組比較，阿魏酸組細(xì)胞中p-STAT3/STAT3比值、vimentin和ZBP-89蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見圖4、表5。

3.7 阿魏酸與STAT3蛋白分子對(duì)接結(jié)果

選取1BG1為對(duì)接模板，以Tyr705周圍的區(qū)域?yàn)榧俣ǖ慕Y(jié)合口袋進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)果表明，阿魏酸的羧酸基團(tuán)與Asn581、Lys591分別存在1.9?、2.0?的氫鍵作用，結(jié)合能為-4.4 kcal/mol，詳見圖5。

4 討論

臨床研究表明，STAT3及其激活型p-STAT3在大多數(shù)肝細(xì)胞癌患者的肝癌組織中高表達(dá)[18]，且STAT3信號(hào)通路的激活在肝細(xì)胞癌進(jìn)展與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[19]。STAT3通常以非活化形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，IL-6等炎性因子可通過與細(xì)胞膜受體結(jié)合，作用于gp130蛋白，激活非受體酪氨酸激酶（JAK），進(jìn)而磷酸化修飾STAT3蛋白分子;p-STAT3以二聚體形式轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，調(diào)控癌基因表達(dá)[4，20]。研究表明，p- STAT3可通過結(jié)合ZBP-89或抑制caspase-3表達(dá)，從而促進(jìn)vimentin蛋白的表達(dá)及其在癌細(xì)胞中的作用[9-12]。ZBP-89是vim基因啟動(dòng)子區(qū)域的負(fù)調(diào)控因子，其與p-STAT3直接相互作用后，不僅可促進(jìn)vim基因抗沉默子元件的作用來增強(qiáng)vimentin的表達(dá)，還可減弱自身募集組蛋白去乙?；?（HDAC1）到vim啟動(dòng)子區(qū)域的能力，從而使vimentin乙?；鰪?qiáng)，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移[9-10];凋亡關(guān)鍵分子caspase-3可裂解vimentin蛋白，而p-STAT3可通過抑制caspase-3的表達(dá)，降低后者對(duì)vimentin蛋白的裂解能力進(jìn)而上調(diào)vimentin表達(dá)[11-12]。

本研究確定以0.5 mmol/L 阿魏酸干預(yù)HepG2細(xì)胞48 h的條件進(jìn)行研究，且以50 ng/mL IL-6誘導(dǎo)的p- STAT3高表達(dá)HepG2細(xì)胞模型最佳。然后基于此進(jìn)行后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞侵襲數(shù)顯著增加，p-STAT3/STAT3比值、vimentin蛋白表達(dá)水平均顯著升高，細(xì)胞晚期凋亡率和caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著降低，表明STAT3蛋白磷酸化水平的升高可抑制caspase-3（而不是ZBP-89）蛋白表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)肝癌細(xì)胞中vimentin的蛋白表達(dá)。經(jīng)阿魏酸和陽性對(duì)照干預(yù)后，阿魏酸組和陽性對(duì)照組細(xì)胞存活率、細(xì)胞侵襲數(shù)、p-STAT3/STAT3比值、vimentin蛋白表達(dá)水平均顯著降低，細(xì)胞早期凋亡率（阿魏酸組除外）、晚期凋亡率、caspase-3和ZBP-89（陽性對(duì)照組除外）蛋白表達(dá)水平均顯著升高，表明阿魏酸可能通過下調(diào)STAT3蛋白磷酸化水平，上調(diào)caspase-3蛋白表達(dá)，進(jìn)而促使vimentin蛋白下調(diào)。另外分子對(duì)接的分析結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了阿魏酸可作用于STAT3的SH2結(jié)構(gòu)域，從而影響STAT3蛋白的磷酸化。盡管本研究結(jié)果也證實(shí)阿魏酸可明顯上調(diào)ZBP-89蛋白的表達(dá)，但與陽性對(duì)照結(jié)果不一致，提示阿魏酸對(duì)ZBP-89蛋白的上調(diào)可能與STAT3無關(guān)。

綜上所述，阿魏酸可能通過與STAT3蛋白磷酸化位點(diǎn)直接結(jié)合來抑制p-STAT3活性;并可通過STAT3依賴性途徑上調(diào)caspase-3蛋白表達(dá)，或可通過STAT3非依賴性途徑上調(diào)ZBP-89蛋白表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)vimentin蛋白表達(dá)，從而抑制HepG2細(xì)胞的增殖、侵襲與凋亡。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] SUNG H，F(xiàn)ERLAY J，SIEGEL R L，et al. Global cancer statistics 2020：GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA Cancer J Clin，2021，70（4）：313.

[ 2 ] DAS U，MANNA K，ADHIKARY A，et al. Ferulic acid enhances the radiation sensitivity of lung and liver carcinoma cells by collapsing redox homeostasis：mechanistic involvement of Akt/p38 MAPK signalling pathway[J]. Free radical research，2019，53（9/10）：944-967.

[ 3 ] EZHUTHUPURAKKAL P B，ARIRAMAN S，ARUMUGAM S，et al. Anticancer potential of ZnO nanoparticle-ferulic acid conjugate on Huh-7 and HepG2 cells and diethyl? ? ?nitrosamine induced hepatocellular cancer on Wistar albino rat[J]. Nanomedicine，2018，14（2）：415-428.

[ 4 ] 音金萍，岳紫晨，卓少元. STAT3：慢性炎癥介導(dǎo)肝癌進(jìn)程的關(guān)鍵分子[J].臨床肝膽病雜志，2020，36（4）：948- 952.

[ 5 ] 謝金玲，卓少元. Vimentin在原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展及凋亡過程中的作用[J].中國腫瘤，2017，26（2）：130-134.

[ 6 ] 孫志欣，張瑩.桔皮素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞體外增殖和侵襲的影響及機(jī)制研究[J].中國藥房，2016，27（34）：4800-4803.

[ 7 ] HENDRAYANI S F，AL-HARBI B，AL-ANSARI M M，et al. The inflammatory/cancer-related IL-6/STAT3/NF-κB positive feedback loop includes AUF1 and maintains the active state of breast myofibroblasts[J]. Oncotarget，2016，7（27）：41974.

[ 8 ] CAMPANA L，LEWIS P J S，PELLICORO A，et al. The STAT3-IL-10-IL-6 pathway is a novel regulator of macrophage efferocytosis and phenotypic conversion in sterile liver injury[J]. J Immunol，2018，200（3）：1169-1187.

[ 9 ] WU Y，DIAB I，ZHANG X，et al. STAT3 enhances vimentin gene expression by binding to the antisilencer element and interacting with the repressor protein，ZBP-89[J]. Oncogene，2004，23（1）：168-178.

[10] WU Y，ZHANG X，SALMON M，et al. The zinc finger repressor，ZBP-89，recruits histone deacetylase 1 to repress vimentin gene expression[J]. Genes Cells，2007，12（8）：905-918.

[11] SHIN S，SUNG B J，CHO Y S，et al. An anti-apoptotic protein human survivin is a direct inhibitor of caspase-3 and -7[J]. Biochemistry，2001，40（4）：1117-1123.

[12] 卓少元，謝金玲.健脾益氣方含藥血清通過Caspase-3/Vimentin促進(jìn)人肝癌MHCC-97H 細(xì)胞凋亡[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2016，22（24）：161-166.

[13] SILVA K A，DONG J，DONG Y，et al. Inhibition of STAT3 activation suppresses caspase-3 and the ubiquitin-proteasome system，leading to preservation of muscle mass in cancer cachexia[J]. J Biol Chem，2015，290（17）：11177- 11187.

[14] 湯浩，高慶劍，陸鋮，等.阿魏酸和異阿魏酸對(duì)HepG2細(xì)胞增殖及其細(xì)胞色素P450酶的影響[J].中草藥，2014，45（12）：1726-1730.

[15] 朱全杰，段曉明，何蜜，等. HA轉(zhuǎn)hGM-CSF HepG2疫苗對(duì)IL-6誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞EMT的影響及機(jī)制[J].湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2016，13（6）：4-7.

[16] KIM B，PARK B. Saffron carotenoids inhibit STAT3 activation and promote apoptotic progression in IL-6-stimula- ted liver cancer cells[J]. Oncol Rep，2018，39（4）：1883- 1891.

[17] REDELL M S，RUIZ M J，ALONZO T A，et al. STAT3 signaling in acute myeloid leukemia：ligand-dependent and-independent activation and induction of apoptosis by a novel small-molecule STAT3 inhibitor[J]. Blood，2011，117（21）：5701-5709.

[18] GOU Z，WANG D，ZHOU L. STAT3 protein expression profile and its clinical significance in hepatocellular carcinoma[J]. J Clin Hepatol，2013，29（7）：520-524.

[19] ZHANG X P，JIANG Y B，ZHONG C Q，et al. PRMT1 promoted HCC growth and metastasis in vitro and in vivo via activating the STAT3 signalling pathway [J]. Cell Physiol Biochem，2018，47（4）：1643-1654.

[20] XIONG S，WANG R，CHEN Q，et al. Cancer-associated fibroblasts promote stem cell-like properties of hepatocellular carcinoma cells through IL-6/STAT3/Notch signaling

[J]. Am J Cancer Res，2018，8（2）：302-316.

（收稿日期：2021-03-01 修回日期：2021-05-19）

（編輯：唐曉蓮）