杜仲翅果皮酶解提取液的超濾工藝優(yōu)化

謝玲 陶菡 張學(xué)俊 張靈麗 賀揚(yáng)潔 田運(yùn)霞 吳巧靈 季春

中圖分類號(hào) R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）13-1557-08

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.13.04

摘 要 目的：優(yōu)化杜仲翅果皮酶解提取液的超濾工藝。方法：采用單因素實(shí)驗(yàn)考察超濾膜截留分子量、料液溫度、操作壓力、操作頻率、過(guò)膜時(shí)間、料液濃度、料液pH對(duì)杜仲翅果皮酶解提取液中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸的轉(zhuǎn)移率和固形物去除率的影響。固定超濾膜截留分子量100 000、料液濃度7 g/L、料液pH 7，以料液溫度、操作壓力、操作頻率、過(guò)膜時(shí)間為考察因素，以桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸的轉(zhuǎn)移率和固形物去除率的綜合得分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法對(duì)超濾工藝進(jìn)行優(yōu)化并驗(yàn)證。結(jié)果：杜仲翅果皮酶解提取液的最佳超濾工藝為料液溫度35 ℃、操作壓力0.5 MPa、操作頻率35 Hz、過(guò)膜時(shí)間42 min。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，杜仲翅果皮酶解提取液中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸的轉(zhuǎn)移率和固形物去除率的綜合得分為78.06%（RSD=1.43%，n=3），與預(yù)測(cè)值（77.18%）的相對(duì)誤差為1.14%。結(jié)論：優(yōu)化后的超濾工藝穩(wěn)定、可靠，可用于杜仲翅果皮酶解提取液的超濾純化。

關(guān)鍵詞 杜仲翅果皮;超濾工藝;Box-Behnken設(shè)計(jì);響應(yīng)面法;桃葉珊瑚苷;京尼平苷酸;綠原酸

Optimization of Ultrafiltration Technology of Enzymatic Hydrolysate from Eucommia ulmoides Peel

XIE Ling1，TAO Han1，ZHANG Xuejun1，ZHANG Lingli1，HE Yangjie1，TIAN Yunxia1，WU Qiaoling1，JI Chun2? ?（1. Guizhou Province Key Laboratory of Fermentation Engineering and Bio-Pharmaceutical/School of Liquor & Food Engineering， Guizhou University， Guiyang 550025， China; 2. School of Pharmaceutical Sciences， Guizhou University， Guiyang 550025， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To optimize the ultrafiltration technology of enzymatic hydrolysate from Eucommia ulmoides peel. METHODS： The single factor test was adopted to investigate the effects of molecular weight of ultrafiltration membrane， liquid temperature， operating pressure， operating frequency， membrane filtration time， liquid concentration and pH on transfer rates of aucubin， geniposide and chlorogenic acid as well as solid removal rate in enzymatic hydrolysate from E. ulmoides peel. Setting the molecular cut off of fixed ultrafiltration membrane of 100 000， liquid concentration of 7 g/L， and pH value of 7， the ultrafiltration technology was optimized by Box-Behnken design response-surface methodology and validated with liquid temperature， operating pressure， operating frequency and membrane passing time as factors， using comprehensive scores calculated from transfer rates of aucubin， geniposide and chlorogenic acid as well as solid removal rate as indexes. RESULTS： The optimal ultrafiltration technology of enzymatic hydrolysate from E. ulmoides peel was as follows as liquid temperature of 35 ℃， operating pressure of 0.5 MPa， operating frequency of 35 Hz and membrane passing time of 42 min.? Results of validation tests showed that the comprehensive scores of the transfer rates of aucubin， geniposide and chlorogenic acid as well as solid removal rate in enzymatic hydrolysate from E. ulmoides peel was 78.06% （RSD=1.43%， n=3）， and its relative error with the predicted value （77.18%） was 1.14%. CONCLUSIONS： The optimized ultrafiltration technology is stable and reliable， and can be used for the ultrafiltration purification of enzymatic hydrolysate from E. ulmoides peel.

KEYWORDS? ?Eucommia ulmoides peel; Ultrafiltration technology; Box-Behnken design; Response surface methodology; Aucubin; Geniposidic acid; Chlorogenic acid

杜仲Eucommia ulmoides Oliv.屬于被子植物門杜仲科Eucommiaceae，是我國(guó)重要的名貴中藥材之一，傳統(tǒng)以杜仲皮入藥外，其葉、雄花、果實(shí)也具有很高的藥用價(jià)值，在《神農(nóng)本草經(jīng)》《本草綱目》《中國(guó)藥典》中均有詳細(xì)記載[1-2]。杜仲翅果皮是杜仲果實(shí)的皮，其中含有環(huán)烯醚萜類、酚酸類、萜類、甾體類、苯丙素類等活性成分[3]。其中，苯丙素類化合物綠原酸具有抗菌、抗病毒[4]、抗炎[5]、抗肥胖[6]、降血壓[7-8]、神經(jīng)保護(hù)[9]等藥理作用，環(huán)烯醚萜類化合物桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸均具有保護(hù)神經(jīng)、肝臟、心臟以及調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗腫瘤、降血糖等藥理作用[10-14]。

本課題組前期采用酶解法、水提法、醇提法分別提取杜仲翅果皮中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸等成分，發(fā)現(xiàn)采用酶解法提取上述成分的效果最好。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，中藥提取液中除了有效成分外，通常還含有無(wú)機(jī)鹽、鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)、多糖、淀粉、果膠等無(wú)效成分[15-16]。本課題組在以酶解法提取杜仲翅果皮中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸等成分的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，該酶解提取液中同樣含有上述無(wú)效成分，從而增加了該提取液的精制難度。

超濾膜法是基于選擇透過(guò)原理的一種方法，可使相對(duì)分子質(zhì)量小于超濾膜截留分子量的成分透過(guò)超濾膜，還可以截留90%以上的雜質(zhì)（相對(duì)分子質(zhì)量為1 000～ 300 000），如有機(jī)物、膠體、懸浮固體等，從而可以實(shí)現(xiàn)有效成分（相對(duì)分子質(zhì)量通常小于1 000）與雜質(zhì)的分離，達(dá)到精制的目的[17]。該方法具有無(wú)相變、環(huán)保、高效、易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化生產(chǎn)等特點(diǎn)，可保持有效成分的生物活性[17-18]。因此，本文課題組根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)了杜仲翅果皮酶解提取液的超濾純化工藝流程（見(jiàn)圖1）。

基于此，本課題組采用酶解法制備杜仲翅果皮的酶解提取液，并根據(jù)設(shè)計(jì)的超濾純化工藝流程，以其主要活性成分桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸的轉(zhuǎn)移率以及固形物去除率為指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化該提取液的超濾工藝，以期為其精制方法優(yōu)化提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），SHA-C（A）型水浴恒溫振蕩器（紹興市蘇珀儀器有限公司），DLSB-5L/10型低溫冷卻液循環(huán)泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），TG16.5型高速離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司），A-10型超純水儀（美國(guó)Millipore公司），BSA124S-CW型電子天平（德國(guó)Sartorius公司），HC-XS18-6X型高壓型膜分離設(shè)備[包括聚醚砜卷式超濾膜UF1（截留分子量為10 000）、UF2（截留分子量為30 000）、UF3（截留分子量為100 000）]、HC-4015型澄清小試設(shè)備（成都和誠(chéng)過(guò)濾技術(shù)有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用杜仲翅果皮購(gòu)自山東貝隆杜仲生物工程有限公司，經(jīng)貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院張學(xué)俊教授鑒定為杜仲科植物杜仲E. ulmoides Oliv.的干燥翅果皮。其他藥品與試劑有酸性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶（張家港大恒生物化工科技有限公司），酸性木聚糖酶（濰坊蘇科漢生物工程有限公司），檸檬酸、檸檬酸鈉（濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司），桃葉珊瑚苷對(duì)照品、京尼平苷酸對(duì)照品、綠原酸對(duì)照品（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)分別為SA9840、SG8110、SC8210，純度均不低于98%）;乙腈、甲醇為色譜純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 杜仲翅果皮酶解提取液的制備

稱取杜仲翅果皮50.0 g至1 000 mL三角瓶中，加入經(jīng)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（pH 3.4）反復(fù)洗脫后的酸性蛋白酶液500 mL（酶含量為8%），置于53 ℃恒溫水浴中振蕩8 h，再經(jīng)過(guò)濾、抽濾后，得第1次濾液;將殘?jiān)厥罩寥瞧恐?，加入?jīng)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（pH 4.0）反復(fù)洗脫后的果膠酶液500 mL（酶含量為5%），置于50 ℃恒溫水浴中振蕩8 h，再經(jīng)過(guò)濾、抽濾后，得第2次濾液;再將殘?jiān)厥罩寥瞧恐?，加入?jīng)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（pH 5.5）反復(fù)洗脫后的纖維素酶液500 mL（酶含量為5%），置于55 ℃恒溫水浴中振蕩8 h，再經(jīng)過(guò)濾、抽濾后，得第3次濾液;再次將殘?jiān)厥罩寥瞧恐?，加入?jīng)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（pH 4.8）反復(fù)洗脫后的酸性木聚糖酶液500 mL（酶含量為6%），置于45 ℃恒溫水浴中振蕩8 h，再經(jīng)過(guò)濾、抽濾后，得第4次濾液;合并上述4次濾液，即得25 g/L（以生藥量計(jì)）的杜仲翅果皮酶解提取液。

2.2 杜仲翅果皮酶解提取液中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 參考文獻(xiàn)[19]的方法并進(jìn)行優(yōu)化后進(jìn)行測(cè)定。色譜柱為WondaSil C18 Superb（4.6 mm×250 mm，5 μm）;桃葉珊瑚苷的流動(dòng)相為乙腈-水溶液（10 ∶ 90，V/V），流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為204 nm;京尼平苷酸的流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸水溶液（16 ∶ 84，V/V），流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm;綠原酸的流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸水溶液（24 ∶ 76，V/V），流速為0.7 mL/min，進(jìn)樣量為15 μL，柱溫為40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm。

2.2.2 單一對(duì)照品溶液制備 精密稱取桃葉珊瑚苷對(duì)照品2.10 mg、京尼平苷酸對(duì)照品8.00 mg、綠原酸對(duì)照品1.71 mg，分別置于10 mL量瓶中，以50%甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為0.21、0.80、0.17 mg/mL的單一對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 取“2.1”項(xiàng)下杜仲翅果皮酶解提取液適量，進(jìn)行澄清膜除雜處理（如圖1第2步所示，以預(yù)先除去提取液中的微生物、懸浮膠體、色素等雜質(zhì)，下同）;取澄清膜除雜處理后的溶液，進(jìn)行高壓膜分離純化（如圖1第3步所示），以制備超濾透過(guò)液;然后取超濾透過(guò)液適量，以8 000 r/min離心30 min，取上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得超濾后供試品溶液。另取適量杜仲翅果皮酶解提取液按上述“以8 000 r/min……過(guò)濾”方法操作，即得超濾前供試品溶液。

2.2.4 專屬性考察 取“2.2.2”和“2.2.3”項(xiàng)下單一對(duì)照品溶液和超濾前后供試品溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果，超濾前后供試品溶液中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸的理論板數(shù)均大于30 000，分離度均大于1.5，且超濾后上述成分色譜峰的峰形更好、分離度更大，說(shuō)明超濾可以降低雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)的干擾，詳見(jiàn)圖2。

2.2.5 線性關(guān)系考察 分別取“2.2.2”項(xiàng)下各單一對(duì)照品溶液適量，分別以50%甲醇稀釋，制成桃葉珊瑚苷質(zhì)量濃度為0.001 0、0.025 0、0.050 0、0.075 0、0.100 0、0.120 0、0.150 0、0.210 0 mg/mL，京尼平苷酸質(zhì)量濃度為0.025 0、0.050 0、0.100 0、0.250 0、0.450 0、0.600 0、0.750 0、0.800 0 mg/mL，綠原酸質(zhì)量濃度為0.000 5、0.001 0、0.002 0、0.007 5、0.010 0、0.015 0、0.020 0、0.030 0 mg/mL的系列對(duì)照品溶液。按照“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，mg/mL）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.6 精密度考察 取“2.2.5”項(xiàng)下桃葉珊瑚苷質(zhì)量濃度為0.075 0 mg/mL、京尼平苷酸質(zhì)量濃度為0.250 0? mg/mL、綠原酸質(zhì)量濃度為0.010 0 mg/mL的對(duì)照品溶液適量，分別按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸峰面積的RSD分別為1.07%、0.79%、0.86%（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性考察 取“2.2.3”項(xiàng)下超濾后供試品溶液6份，于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸峰面積的RSD分別為1.72%、1.26%、1.47%（n=6），表明超濾后供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 重復(fù)性考察 取“2.2.3”項(xiàng)下超濾后供試品溶液6份，按照“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。結(jié)果，桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸的平均含量分別為37.73、86.87、5.51 μg/mL，RSD分別為1.95%、1.31%、1.78%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率考察 精密量取“2.2.3”項(xiàng)下超濾后供試品溶液共18份（已知含桃葉珊瑚苷0.037 7 mg/mL、京尼平苷酸0.034 0 mg/mL、綠原酸0.005 6 mg/mL），每6份為一組，每組分別按桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸質(zhì)量比約1 ∶ 1.1加入對(duì)照品溶液（按“2.2.2”項(xiàng)下的方法，分別制備桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸質(zhì)量濃度分別為0.035 0、0.030 0、0.005 0 mg/mL的對(duì)照品溶液），然后按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 杜仲翅果皮酶解提取液中固形物去除率和有效成分轉(zhuǎn)移率的測(cè)定

2.3.1 固形物去除率 參考文獻(xiàn)[20]的方法并調(diào)整后進(jìn)行測(cè)定。精密吸取杜仲翅果皮酶解提取液、超濾透過(guò)液（取杜仲翅果皮酶解提取液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備）各15 mL，置于干燥至恒重的培養(yǎng)皿中，在105 ℃烘箱中烘干至恒重，分別稱定其質(zhì)量，即得杜仲翅果皮酶解提取液的干膏質(zhì)量和超濾透過(guò)液的干膏質(zhì)量，然后計(jì)算杜仲翅果皮酶解提取液中固形物去除率[固形物去除率（%）=（1-超濾透過(guò)液干膏質(zhì)量/杜仲翅果皮酶解提取液的干膏質(zhì)量）×100%]。

2.3.2 有效成分轉(zhuǎn)移率 參考文獻(xiàn)[21-22]的方法進(jìn)行測(cè)定。分別精密吸取杜仲翅果皮酶解提取液、超濾透過(guò)液（取杜仲翅果皮酶解提取液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備）適量，以8 000 r/min離心30 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算杜仲翅果皮酶解提取液、超濾透過(guò)液中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸的含量，然后計(jì)算3種有效成分的轉(zhuǎn)移率[有效成分轉(zhuǎn)移率（%）=超濾透過(guò)液中有效成分的含量/杜仲翅果皮酶解提取液中有效成分的含量×100%]。

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

本課題組通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在超濾工藝中，超濾膜截留分子量、料液溫度、操作壓力（膜過(guò)程透過(guò)性的主要影響因素）、操作頻率（控制膜面流速的主要參數(shù)）、過(guò)膜時(shí)間、料液濃度、料液pH均能對(duì)有效成分的轉(zhuǎn)移率和固形物去除率產(chǎn)生影響，故以桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸的轉(zhuǎn)移率和固形物去除率的綜合得分[參考文獻(xiàn)[23]，分別計(jì)算得桃葉珊瑚苷轉(zhuǎn)移率（X1）、京尼平苷酸轉(zhuǎn)移率（X2）、綠原酸轉(zhuǎn)移率（X3）、固形物去除率（X4）的權(quán)重分別為0.285 6、0.291 5、0.207 2、0.215 6;并進(jìn)行歸一化處理，計(jì)算綜合得分（0.285 6×X1+0.291 5×X2+0.207 2×X3+0.215 6×X4），該分值越大表示超濾純化的分離效果越佳]為指標(biāo)，以超濾膜截留分子量、料液溫度、操作壓力、操作頻率、料液濃度、料液pH為因素，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.4.1 超濾膜截留分子量的影響 取“2.2.3”項(xiàng)下經(jīng)澄清膜除雜處理后的溶液1.5 L，固定料液濃度為25 g/L、料液pH為4、料液溫度為25 ℃、操作壓力為0.5 MPa、操作頻率為35 Hz、過(guò)膜時(shí)間為30 min，考察不同超濾膜截留分子量[10 000（超濾膜為UF1）、30 000（超濾膜為UF2）、100 000（超濾膜為UF3）]的影響。結(jié)果，綜合得分隨超濾膜截留分子量的增大而增加，筆者推測(cè)這是因?yàn)槌瑸V膜UF3截留分子量較大，在超濾過(guò)程中形成濃度極差化的程度較小，從而對(duì)有效成分的透過(guò)率影響較小，與范遠(yuǎn)景等[24]的研究結(jié)果一致。由于超濾膜UF1、UF2綜合得分低于UF3，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，前兩者用于杜仲翅果皮酶解提取液的超濾實(shí)驗(yàn)后清洗困難、其膜通量恢復(fù)率低，說(shuō)明膜受到的污染程度較嚴(yán)重，因此選擇超濾膜UF3進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

2.4.2 料液溫度的影響 取“2.2.3”項(xiàng)下經(jīng)澄清膜除雜處理后的溶液1.5 L，固定超濾膜為UF3、料液濃度為25 g/L、料液pH為4、操作壓力為0.5 MPa、操作頻率為35 Hz，過(guò)膜時(shí)間為30 min，考察不同料液溫度（20、25、30、35、40、45 ℃）的影響。結(jié)果，料液溫度在25～35 ℃范圍內(nèi)，綜合得分逐漸增加，在35 ℃時(shí)達(dá)到最大值;繼續(xù)增加料液溫度，綜合得分開始減小，推測(cè)這可能是因?yàn)榇蠓肿游镔|(zhì)在大于35 ℃的條件下開始吸附、沉積于膜表面或堵塞膜孔，阻礙有效成分透過(guò)膜[25-27]。因此，選擇料液溫度為35 ℃進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

2.4.3 操作壓力的影響 取“2.2.3”項(xiàng)下經(jīng)澄清膜除雜處理后的溶液1.5 L，固定超濾膜為UF3、料液濃度為25 g/L、料液pH為4、料液溫度為35 ℃、操作頻率為35 Hz、過(guò)膜時(shí)間為30 min，考察不同操作壓力（0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 MPa）的影響。結(jié)果，綜合得分隨操作壓力增大而先增加后減小，在操作壓力為0.5 MPa時(shí)綜合得分達(dá)到最大，這一變化與操作壓力對(duì)膜過(guò)程透過(guò)性影響的一般規(guī)律相一致[28]。因此，選擇操作壓力為0.5 MPa進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

2.4.4 操作頻率的影響 取“2.2.3”項(xiàng)下經(jīng)澄清膜除雜處理后的溶液1.5 L，固定超濾膜為UF3、料液濃度為25 g/L、料液pH為4、料液溫度為35 ℃、操作壓力為0.5 MPa、過(guò)膜時(shí)間為30 min，考察不同操作頻率（30、32.5、35、37.5、40、45 Hz）的影響。結(jié)果，當(dāng)操作頻率在30～35 Hz范圍內(nèi)時(shí)，綜合得分隨之增大而增加，且在操作頻率為35 Hz時(shí)達(dá)到最大;但當(dāng)操作頻率超過(guò)35 Hz時(shí)，綜合得分反而開始減小，說(shuō)明膜面流速過(guò)大對(duì)有效成分的透過(guò)和固形物雜質(zhì)的去除具有阻礙作用。因此，選擇操作頻率為35 Hz進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

2.4.5 過(guò)膜時(shí)間的影響 取“2.2.3”項(xiàng)下經(jīng)澄清膜除雜處理后的溶液1.5 L，固定超濾膜為UF3、料液濃度為25? g/L、料液pH為4、料液溫度為35 ℃、操作壓力為0.5 MPa、操作頻率為35 Hz，考察不同過(guò)膜時(shí)間（20、30、40、50、60、70 min）的影響。結(jié)果，隨著過(guò)膜時(shí)間的延長(zhǎng)，綜合得分先增加后減小，當(dāng)過(guò)膜時(shí)間為40 min時(shí)，綜合得分達(dá)到最大;當(dāng)過(guò)膜時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)，綜合得分開始減小，筆者推測(cè)這是因?yàn)槟け砻娼亓舻奈镔|(zhì)堵塞膜孔，從而導(dǎo)致膜通量下降。因此，選擇過(guò)膜時(shí)間為40 min進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

2.4.6 料液濃度的影響 取“2.2.3”項(xiàng)下經(jīng)澄清膜除雜處理后的溶液1.5 L，固定超濾膜為UF3、料液溫度為35 ℃、料液pH為4、操作壓力為0.5 MPa、操作頻率為35 Hz、過(guò)膜時(shí)間為40 min，考察不同料液濃度（3、4、5、6、7、8、9、10 g/L）的影響。 結(jié)果，料液濃度在3～7 g/L內(nèi)逐漸增加時(shí)，綜合得分也隨之增加;當(dāng)料液濃度為7 g/L時(shí)，綜合得分達(dá)到最大;當(dāng)繼續(xù)增大料液濃度，綜合得分反而開始減小，筆者推測(cè)這是因?yàn)楦酂o(wú)效成分與有效成分形成競(jìng)爭(zhēng)透過(guò)關(guān)系，破壞了膜表面的透過(guò)平衡，影響了分離效果。因此，選擇料液濃度為7 g/L進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

2.4.7 料液pH的影響 取“2.2.3”項(xiàng)下經(jīng)澄清膜除雜處理后的溶液1.5 L，固定超濾膜為UF3、料液濃度為7? ? ? g/L、料液溫度為35 ℃、操作壓力為0.5 MPa、操作頻率為35 Hz、過(guò)膜時(shí)間為40 min，考察不同料液pH（4、5、6、7、8、9、10、11）的影響。結(jié)果，隨著料液pH逐漸增大，綜合得分先增加后減小;當(dāng)料液pH為7時(shí)，綜合得分達(dá)到最大;當(dāng)pH>7時(shí)，綜合得分開始減小。因此，選擇料液pH為7進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

2.5 Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化杜仲翅果皮酶解提取液的超濾工藝

2.5.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 根據(jù)單因素考察結(jié)果可知，料液濃度為7 g/L、pH 為7時(shí)的料液環(huán)境有利于超濾分離的進(jìn)行，故設(shè)為固定值。固定超濾膜為UF3，同時(shí)，以料液溫度（A）、操作壓力（B）、操作頻率（C）、過(guò)膜時(shí)間（D）為自變量，以綜合得分為響應(yīng)值，采用Design Expert 11.0軟件設(shè)計(jì)4因素3水平的Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn)，綜合評(píng)價(jià)各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表3，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表4，方差分析結(jié)果見(jiàn)表5。

2.5.2 模型分析與預(yù)測(cè) 通過(guò)Design-Expert 11.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得二次多項(xiàng)回歸模擬方程：綜合得分=76.87-0.47A+1.91B-0.468 3C+1.44D+0.192 5AB+2.36AC-0.585 0AD-1.69BC-2.45BD-0.735 0CD-5.93A2-5.21B2-5.71C2-3.36D2。結(jié)合表5結(jié)果可知，該響應(yīng)值模型顯著（P<0.05）;失擬項(xiàng)P值為0.200 6，表示失擬項(xiàng)不顯著（P>0.05），說(shuō)明該回歸模型對(duì)綜合得分的擬合程度較好;一次項(xiàng)A、C對(duì)綜合得分的影響不顯著（P>0.05），B、D對(duì)綜合得分的影響顯著（P<0.05），影響大小排序?yàn)锽>D>A>C;二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)綜合得分的影響均顯著（P<0.05），說(shuō)明A、B、C、D對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

2.5.3 兩因素交互作用分析 響應(yīng)面分析的曲面圖可直觀地反映響應(yīng)值的變化趨勢(shì);二維等高線圖可反映兩因素的交互作用大小，中心圓越呈橢圓形則表示兩因素的交互作用越明顯[29-30]。本研究通過(guò)Design-Expert 11.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到三維響應(yīng)面圖，見(jiàn)圖4。由圖4a可知，AB兩因素交互、其余2個(gè)因素取0水平時(shí)，隨著料液溫度和操作壓力的增加，綜合得分呈先增加后減小的變化趨勢(shì)（與單因素實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果一致），且在中心點(diǎn)處達(dá)到最大值;結(jié)合表5的方差分析結(jié)果可知，AB交互作用對(duì)綜合得分的影響不顯著（P>0.05）。由圖4b可知，AC兩因素交互時(shí)，隨著料液溫度和操作頻率的增加，綜合得分先增加后減小，在中心處可達(dá)到最大值，該曲面坡度較陡，說(shuō)明AC交互作用明顯，且對(duì)綜合得分的影響顯著（P<0.05），與表5的方差分析結(jié)果一致。同理分析AD、BC、BD、CD的交互作用對(duì)綜合得分的影響，結(jié)合表5的方差分析結(jié)果可知，AD、CD交互作用對(duì)綜合得分的影響不顯著（P>0.05），BC、BD交互作用對(duì)綜合得分的影響顯著（P<0.05），AC、BC、BD交互作用對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響大小排序?yàn)锽D>AC>BC。

2.6 杜仲翅果皮酶解提取液最佳條件確定及驗(yàn)證

通過(guò)對(duì)“2.5.2”項(xiàng)下回歸模擬方程進(jìn)行分析，得到最佳超濾工藝條件為料液溫度34.681 ℃、操作壓力0.516 MPa、操作頻率34.777 Hz、過(guò)膜時(shí)間41.721 min，其綜合得分預(yù)測(cè)值為77.18%?？紤]到超濾工藝實(shí)際可操作性，將各條件參數(shù)調(diào)整為料液溫度35 ℃、操作壓力0.5 MPa、操作頻率35 Hz、過(guò)膜時(shí)間42 min。

取杜仲翅果皮50.0 g，按“2.1”項(xiàng)下方法制備酶解提取液，然后按上述最佳工藝參數(shù)進(jìn)行超濾處理，共平行制備3份，每份1.5 L，以驗(yàn)證優(yōu)選的最佳超濾工藝。結(jié)果，桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸的轉(zhuǎn)移率和固形物去除率分別為93.54%（RSD=1.43%，n=3）、82.36%（RSD=1.18%，n=3）、58.15%（RSD=1.48%，n=3）、70.89%（RSD=1.76%，n=3），綜合得分為78.06%（RSD=1.43%，n=3）;與預(yù)測(cè)值（77.18%）相比較，實(shí)測(cè)綜合得分的相對(duì)誤差為1.14%，說(shuō)明該模型的回歸方程與真實(shí)實(shí)驗(yàn)的擬合度高，優(yōu)化所得的最佳工藝具有可行性和可靠性。

2.7 杜仲翅果皮酶解提取液超濾前后的澄清度比較

取杜仲翅果皮酶解提取液和其經(jīng)超濾后的溶液適量，進(jìn)行肉眼觀察。結(jié)果，杜仲翅果皮酶解提取液呈深褐色，透明度較低;經(jīng)超濾后，其溶液澄清、透明，詳見(jiàn)圖5。

3 討論

目前，用于中藥水提液“精制”的方法主要有絮凝法、醇沉法、大孔樹脂吸附法和膜分離法等，其中醇沉法周期長(zhǎng)，需要進(jìn)行乙醇回收處理，從而增加了純化工藝的成本;絮凝法和大孔樹脂吸附法純化的樣品中可能有絮凝劑和樹脂顆粒殘留，可能使制劑的安全性降低[16]。超濾法屬于膜分離法中的一種，具有條件溫和、除雜效果好、無(wú)相變、高效節(jié)能、可以阻截?zé)嵩图?xì)菌等特點(diǎn)[16，31]，因此以該方法獲得的精制提取液的穩(wěn)定性較好，可以為中藥制劑的生產(chǎn)提供安全保障。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，超濾膜抗污染能力差，是導(dǎo)致膜通量衰減嚴(yán)重的重要原因[32]。因此，本研究進(jìn)行超濾前，對(duì)杜仲翅果皮酶解提取液進(jìn)行了抽濾和澄清過(guò)濾除雜預(yù)處理，以預(yù)先去除提取液中的顆粒、微生物、懸浮膠體等雜質(zhì)。另外，在以往的膜分離研究中，多以膜通量為指標(biāo)間接評(píng)價(jià)超濾效果[33]，不能直接反映相應(yīng)活性成分的轉(zhuǎn)移情況，因此本研究選擇有效成分的轉(zhuǎn)移率和固形物去除率作為杜仲翅果皮酶解提取液超濾工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化了杜仲翅果皮酶解提取液的超濾工藝，得到了料液溫度、操作壓力、操作頻率、過(guò)膜時(shí)間與綜合得分的回歸模型，并對(duì)兩因素交互作用對(duì)綜合得分的影響進(jìn)行了分析，得到各因素對(duì)超濾工藝的影響大小依次為操作壓力>過(guò)膜時(shí)間>料液溫度>操作頻率。所得最佳工藝條件為：料液溫度35 ℃，操作壓力0.5 MPa，操作頻率35 Hz，過(guò)膜時(shí)間42 min;該最佳工藝經(jīng)驗(yàn)證后的綜合得分為78.06%，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為1.14%，表示該模型的回歸方程與真實(shí)實(shí)驗(yàn)的模擬度高;且經(jīng)肉眼觀察后發(fā)現(xiàn)，杜仲翅果皮酶解提取液超濾后樣品的澄清度明顯改善。

綜上所述，本研究?jī)?yōu)化后的超濾工藝穩(wěn)定、可靠，可用于杜仲翅果皮酶解提取液的超濾純化。

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（收稿日期：2021-03-04 修回日期：2021-04-06）

（編輯：唐曉蓮）