紅花黃色素對(duì)慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺功能的改善作用

包海藍(lán) 特日格樂(lè) 其木格

中圖分類號(hào) R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）13-1578-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.13.07

摘 要 目的：研究紅花黃色素對(duì)慢性阻塞性肺疾?。–OPD）模型大鼠肺功能的改善作用。方法：將SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（地塞米松，0.09 mg/kg）和紅花黃色素低、中、高劑量組（5、10、20 mg/kg），對(duì)照組10只大鼠，其余組各11只大鼠。除對(duì)照組外，其余各組大鼠以注射脂多糖聯(lián)合煙熏法復(fù)制COPD模型。造模成功后，對(duì)照組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，給藥組灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)12周。末次給藥后，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)大鼠血清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL-6）、IL-8水平;采用血?dú)夥治鰞x檢測(cè)全血中血?dú)庵笜?biāo)[動(dòng)脈氧分壓（PaO2）、血氧飽和度（SaO2）、動(dòng)脈二氧化碳分壓（PaCO2）]水平;采用肺功能檢測(cè)儀檢測(cè)大鼠肺功能指標(biāo)[肺活量（FVC）、1秒用力呼氣量（FEV1）、FEV1/FVC、最大呼氣量（PEF）、最大呼氣時(shí)中期流速（MMEF）]水平;采用Western blot法檢測(cè)大鼠肺組織中Toll樣受體4（TLR4）、核因子κB（NF-κB）、NF-κB抑制蛋白（IκBα）表達(dá)水平;采用蘇木精-伊紅染色法觀察大鼠肺組織的病理學(xué)形態(tài)變化。結(jié)果：與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-8水平，全血中PaCO2水平以及肺組織中TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）;全血中PaO2、SaO2水平，肺功能指標(biāo)FVC、FEV1、FEV1/FVC、PEF、MMEF水平以及肺組織中IκBα蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）;肺組織上皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯的變性、壞死，細(xì)胞間質(zhì)有明顯的炎性浸潤(rùn)現(xiàn)象。與模型組比較，紅花黃色素各劑量組大鼠血清中炎癥因子水平、全血中血?dú)庵笜?biāo)水平、肺功能指標(biāo)水平及肺組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平（低劑量組的IκBα除外）均顯著逆轉(zhuǎn)（P<0.05或P<0.01）;肺組織上皮細(xì)胞壞死、脫落、炎性浸潤(rùn)等情況均不同程度地改善。結(jié)論：紅花黃色素能明顯改善COPD模型大鼠的肺功能;其作用機(jī)制可能與抑制炎癥因子表達(dá)，調(diào)控TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 紅花黃色素;慢性阻塞性肺疾病;炎癥因子;Toll樣受體4;核因子κB

Improvement Effects of Safflower Yellow on Lung Function of Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model Rats

BAO Hailan1，Terigele2，Qimuge3（1. School of College of Mongolian Medicine， Inner Mongolia University for Nationalities， Inner Mongolia Tongliao 028000， China; 2. Network Center， Inner Mongolia University for Nationalities， Inner Mongolia Tongliao 028000， China; 3. Dept. of Mongolian Respiratory Medicine， the Affiliated Hospital of Inner Mongolia University for Nationalities， Inner Mongolia Tongliao 028000， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the improvement effects of safflower yellow on lung function in chronic obstructive pulmonary disease （COPD） model rats. METHODS： SD rats were randomly divided into control group， model group， positive control group （dexamethasone， 0.09 mg/kg）， safflower yellow low-dose， medium-dose and high-dose groups （5， 10， 20 mg/kg）， with 10 rats in control group and 11 rats in other groups. Except for control group， other groups were given lipopolysaccharide combined with fumigation to induce COPD model. After modeling， control group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically， and administration groups were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 12 weeks. After last medication， the levels of TNF-α， IL-6 and IL-8 were detected by ELISA. The levels of blood gas indexes （PaO2， SaO2 and PaCO2） in whole blood were detected by blood gas analyzer. The levels of lung function indexes （FVC， FEV1， FEV1/FVC， PEF and MMEF） were detected by lung function analyzer. The expression of TLR4， NF-κB and IκB-α protein were detected by Western blot. HE staining was used to observe the pathological changes of lung tissue. RESULTS： Compared with control group， the serum levels of TNF-α， IL-6 and IL-8， the level of PaCO2 in whole blood as well as the protein expression of TLR4 and NF-κB in lung tissue were increased significantly in model group （P<0.01）; the levels of PaO2 and SaO2 in whole blood， the levels of lung function as FVC， FEV1， FEV1/FVC， PEF and MMEF as well as the protein expression of? ? ?IκBα in lung tissue were decreased significantly （P<0.01）; there were obvious degeneration and necrosis in the epithelial cells of lung tissue， and obvious inflammatory infiltration in the interstitial cells. Compared with model group， the levels of inflammatory factors in serum， blood gas indexes in whole blood and lung function indexes as well as the expression of related protein in lung tissue （except for IκBα in low-dose group） were reversed significantly in safflower yellow groups （P<0.05 or P<0.01）; the necrosis， exfoliation and inflammatory infiltration of epithelial cells in lung tissue were improved in varying degrees. CONCLUSIONS： Safflower yellow can significantly improve the lung function of COPD model rats， and its mechanism may be related to inhibiting the expression of inflammatory factors and regulating the expression of TLR4/NF-κB pathway-related proteins.

KEYWORDS? ?Safflower yellow; Chronic obstructive pulmonary disease; Inflammatory factors; TLR4; NF-κB

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種具有氣流阻塞特征的慢性支氣管炎和（或）肺氣腫，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性的肺功能衰退及慢性炎癥反應(yīng)[1-3]，且隨著其病程發(fā)展可能會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、靜脈栓塞等多種并發(fā)癥[4-6]，極大程度地?fù)p害了患者的生命安全。因此，尋找能夠有效治療、改善COPD的用藥方案具有重要的臨床意義。近年來(lái)，隨著中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展壯大，中藥在COPD方面的應(yīng)用逐漸受到關(guān)注[7]。紅花黃色素是從中藥紅花中提取的一種天然色素，屬于查耳酮類化合物，具有降血壓、保護(hù)心血管、抗氧化、抗炎、抗癌等多種藥理作用[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，紅花黃色素對(duì)COPD具有一定的治療效果[10-12]，但其作用機(jī)制尚不清楚。

氣道內(nèi)的炎癥反應(yīng)是COPD的重要發(fā)病機(jī)制。COPD患者氣道內(nèi)出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并產(chǎn)生大量腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、IL-8等炎癥因子，對(duì)患者氣道造成損傷[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體4（TLR4）的激活可刺激NF-κB炎癥通路，引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)[14];且已有研究證明，TLR4/NF-κB通路在COPD患者體內(nèi)被激活，并參與了其炎癥反應(yīng)的發(fā)展進(jìn)程[15]?；诖?，本研究通過(guò)構(gòu)建COPD大鼠模型，研究紅花黃色素對(duì)COPD模型大鼠肺功能的改善作用及其對(duì)TLR4/NF-κB通路的影響，以期為COPD的臨床治療提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：ABL90型血?dú)夥治鰞x（上海雷杜米特醫(yī)療設(shè)備有限公司）、SCIREQ型小動(dòng)物肺功能檢測(cè)儀（北京廣源達(dá)科技發(fā)展有限公司）、MR-96A型酶標(biāo)儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）、KL01A型離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）、FA2104型電子天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）、DYCZ-40K型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用主要藥品與試劑包括：紅花黃色素對(duì)照品（南京道斯夫生物科技有限公司，批號(hào)78281-02-4，純度>98%），地塞米松片（廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)A14202002484，規(guī)格0.75 mg），脂多糖（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)08168），TNF-α檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測(cè)試劑盒、IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒、IL-8 ELISA檢測(cè)試劑盒（南京建成生物科技有限公司，批號(hào)分別為H052 、H007、H008），BCA蛋白定量試劑盒（英國(guó)Abcam公司，批號(hào)ab102536），鼠源TLR4單克隆抗體、兔源NF-κB單克隆抗體、兔源核因子κB抑制蛋白（IκBα）單克隆抗體、鼠源β-actin單克隆抗體、山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗、山羊抗兔IgG二抗（英國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為ab22048、ab32536、ab32518、 ab8226、 ab205719、 ab205718）;其余試劑為實(shí)驗(yàn)室常用規(guī)格，水為純凈水 。

1.3 動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為成年雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量（200±20） g，購(gòu)自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)為 SCXK（鄂）2017-0004。 大鼠飼養(yǎng)于室溫20～25 ℃、相對(duì)濕度50%～60%的動(dòng)物房?jī)?nèi)，通風(fēng)良好。大鼠自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將大鼠分為對(duì)照組、模型組、地塞米松組（陽(yáng)性對(duì)照，0.09 mg/kg，劑量參考文獻(xiàn)[16]設(shè)置）和紅花黃色素低、中、高劑量組（5、10、20 mg/kg，劑量參考文獻(xiàn)[17]設(shè)置），除對(duì)照組10只大鼠外，其余組各11只大鼠。參考文獻(xiàn)[18]方法，將除對(duì)照組之外的大鼠置于自制有機(jī)玻璃箱內(nèi)，每日煙熏1 h，每次20支香煙，并于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第7、14、21天向其氣管內(nèi)注射脂多糖（1 mg/kg，注射當(dāng)日不熏煙），持續(xù)8周，以復(fù)制COPD模型。造模結(jié)束后，除對(duì)照組外，其余各組分別取1只大鼠處死，剖取其肺組織，進(jìn)行病理學(xué)變化觀察。當(dāng)大鼠肺組織呈明顯的病理形態(tài)，且肺上皮細(xì)胞變性、壞死，細(xì)胞間隙伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)時(shí)，表明造模成功。造模成功后，對(duì)照組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥物（臨用時(shí)以生理鹽水溶解），灌胃體積為10 mL/kg，每天1次，連續(xù)12天。

2.2 樣本采集

末次給藥后，各組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）進(jìn)行麻醉，于腹腔主動(dòng)脈取血適量，一部分經(jīng)枸櫞酸鈉抗凝處理后直接保存，作為全血樣品;一部分以3 000 r/min離心10 min，取上清液，作為血清樣品。在測(cè)定肺功能指標(biāo)水平后，處死各組大鼠，剖取其肺組織，一部分用于相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)，一部分進(jìn)行病理學(xué)觀察。

2.3 大鼠血清中炎癥因子水平的測(cè)定

取“2.2”項(xiàng)下各組大鼠血清樣品，按ELISA試劑盒說(shuō)明書方法操作，采用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)下，測(cè)定血清中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8的水平。

2.4 大鼠全血中血?dú)庀嚓P(guān)指標(biāo)水平的測(cè)定

取“2.2”項(xiàng)下各組大鼠全血樣品，使用血?dú)夥治鰞x檢測(cè)相關(guān)血?dú)庀嚓P(guān)指標(biāo)[動(dòng)脈氧分壓（PaO2）、血氧飽和度（SaO2）、動(dòng)脈二氧化碳分壓（PaCO2）]的水平。

2.5 大鼠肺功能指標(biāo)水平的測(cè)定

各組大鼠取血后，采取仰臥位將其放置于肺功能檢測(cè)儀內(nèi)，并進(jìn)行氣管插管，然后記錄大鼠肺功能指標(biāo)[肺活量（FVC）、1秒用力呼氣量（FEV1）、FEV1/FVC、最大呼氣量（PEF）、最大呼氣時(shí)中期流速（MMEF）]水平。

2.6 大鼠肺組織中TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。取“2.2”項(xiàng)下各組大鼠肺組織，切取其右中葉部分的肺組織（距肺門3 mm處）適量，加入蛋白裂解液提取總蛋白，然后以12 000? ? r/min離心10 min，取上層蛋白液，以BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。蛋白經(jīng)變性處理后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）;轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉在室溫的條件下封閉1 h;以TBST清洗5 min×3次，加入TLR4、NF-κB、IκBα、β-actin一抗（稀釋度均為? ?1 ∶ 1 000），并于4 ℃條件下孵育過(guò)夜;以TBST清洗5 min×3次，加入相應(yīng)二抗（稀釋度均為1 ∶ 5 000），于室溫條件下孵育1 h;以TBST清洗5 min×3次，加入ECL發(fā)光劑顯色后，置于全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)中成像。采用Image Pro Plus 6.0軟件分析圖像，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin的灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

2.7 大鼠肺組織的病理學(xué)形態(tài)觀察

取“2.2”項(xiàng)下各組大鼠肺組織，于10%甲醛溶液中固定3 天后，經(jīng)石蠟包埋、切片（5 μm），再進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，然后于顯微鏡下觀察肺組織的病理學(xué)形態(tài)變化并拍照。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，首先采用方差齊性檢驗(yàn)，將符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 紅花黃色素對(duì)大鼠血清中炎癥因子水平的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-8水平均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，地塞米松組和紅花黃色素各劑量組大鼠血清中上述指標(biāo)水平均顯著降低（P<0.01），詳見(jiàn)表1。

3.2 紅花黃色素對(duì)大鼠全血中血?dú)庀嚓P(guān)指標(biāo)水平的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠全血中PaO2、SaO2水平均顯著降低（P<0.01），PaCO2水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，地塞米松組和紅花黃色素各劑量組大鼠的PaO2、SaO2水平均顯著升高（P<0.01），PaCO2水平均顯著降低（P<0.01），詳見(jiàn)表2（表中，1 mmHg≈0.133 kPa）。

3.3 紅花黃色素對(duì)大鼠肺功能指標(biāo)水平的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠FVC、FEV1、FEV1/FVC、PEF、MMEF水平均顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，地塞米松組和紅花黃色素各劑量組大鼠上述指標(biāo)水平均顯著升高（P<0.05或 P<0.01），詳見(jiàn)表3。

3.4 紅花黃色素對(duì)大鼠肺組織中TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織中TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01），IκBα蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，地塞米松組和紅花黃色素各劑量組大鼠肺組織中TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01），IκBα（紅花黃色素低劑量組除外）蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01），詳見(jiàn)圖1、表4。

3.5 紅花黃色素對(duì)大鼠肺組織病理學(xué)形態(tài)的影響

對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，上皮細(xì)胞未出現(xiàn)壞死、脫落，細(xì)胞間質(zhì)未發(fā)現(xiàn)炎性浸潤(rùn)或組織增生等情況;模型組大鼠肺組織上皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞變性、壞死，細(xì)胞間質(zhì)有明顯的炎性浸潤(rùn)現(xiàn)象;地塞米松組和紅花黃色素各劑量組大鼠肺組織上皮細(xì)胞壞死、脫落、炎性浸潤(rùn)等情況均不同程度地改善，詳見(jiàn)圖2。

4 討論

COPD的發(fā)生與吸煙、過(guò)敏、感染等多種因素有關(guān)，但其具體發(fā)病機(jī)制尚不明確[4]。目前，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，可通過(guò)降低體內(nèi)炎癥反應(yīng)來(lái)抑制COPD的發(fā)展[19]。宋麗娟等[20]研究發(fā)現(xiàn)，紅花黃色素對(duì)急性肺損傷模型小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)有明顯的抑制作用，且能明顯抑制小鼠體內(nèi)TLR4基因及蛋白的表達(dá)。TLR4是一類天然免疫受體，是NF-κB通路的上游信號(hào)分子，TLR4被激活后可進(jìn)一步激活NF-κB通路，進(jìn)而激活該通路的下游靶蛋白，引起一系列炎癥反應(yīng)[14]。TNF-α、IL-6、IL-8均是常見(jiàn)的炎癥因子，其在COPD患者體內(nèi)的水平均顯著升高，從而刺激氣道釋放黏液、促進(jìn)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而加重肺組織損傷[13]。基于此，本研究擬探討紅花黃色素對(duì)COPD模型大鼠肺功能的改善作用及其對(duì)TLR4/NF-κB通路的影響。此外，因目前臨床治療COPD主要以地塞米松片為主，故本研究以其作為陽(yáng)性對(duì)照藥進(jìn)行研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，COPD模型大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-8水平均顯著升高;全血中PaO2、SaO2及肺功能指標(biāo)FVC、FEV1、FEV1/FVC、PEF、MMEF水平均顯著降低，全血中PaCO2水平顯著升高;肺組織中TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平均顯著升高，IκBα蛋白表達(dá)水平顯著降低;大鼠肺組織出現(xiàn)明顯病變及炎性浸潤(rùn)。這提示COPD模型大鼠體內(nèi)TLR4/NF-κB炎癥通路被激活，使大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)加劇，同時(shí)損傷了大鼠的肺組織。但經(jīng)紅花黃色素干預(yù)后顯示，大鼠血清中上述炎癥因子水平均顯著降低，肺功能指標(biāo)水平和肺組織病變情況均得到明顯改善，且肺組織中TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平均顯著降低，IκBα（紅花黃色素低劑量組除外）蛋白表達(dá)水平均顯著升高。由此說(shuō)明，紅花黃色素可能通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)，從而減少炎癥反應(yīng)的發(fā)生，進(jìn)一步抑制COPD模型大鼠的疾病發(fā)展進(jìn)程，改善模型大鼠的肺功能水平。

綜上所述，紅花黃色素能明顯改善COPD模型大鼠的肺功能，其作用機(jī)制可能與抑制炎癥因子表達(dá)，調(diào)控TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。

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（收稿日期：2021-01-13 修回日期：2021-04-16）

（編輯：唐曉蓮）