苯胺藍(lán)染色對沉積物搖蚊頭殼提取方法的改進(jìn)

田文龍，駱萱，鄭子杰，周安琪，代哲，曹艷敏

(中南民族大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，武漢 430074)

搖蚊幼蟲是遍布幾乎所有淡水水體的一種不咬人的蠓蟲.其作為淡水底棲生物中數(shù)量最多、分布最廣的水生昆蟲，在水生態(tài)系統(tǒng)生物地球化學(xué)過程中具有不可替代的重要作用[1].搖蚊是一種全變態(tài)昆蟲，其幼蟲蛻變過程中脫落的頭囊?guī)锥≠|(zhì)化程度高，能耐酸堿，因此可以在沉積物中得以長期保存.

現(xiàn)代搖蚊生態(tài)學(xué)研究表明：盡管搖蚊可遍布世界幾乎所有的生物地理區(qū)，但多數(shù)屬種生態(tài)幅狹窄，其短暫的生命周期使得各生長階段生理活動對環(huán)境變化異常敏感，能對周圍環(huán)境變化做出迅速響應(yīng)[2].古湖沼學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，沉積物中保存良好的亞化石頭殼可以鑒定到屬甚至到種，使過去環(huán)境下?lián)u蚊組合的恢復(fù)成為可能.20世紀(jì)90年代以來，搖蚊被視為古環(huán)境古氣候重建最具發(fā)展?jié)摿Φ纳锓椒ㄖ籟3].一系列搖蚊-環(huán)境數(shù)據(jù)庫的建立[4-6]使得搖蚊在古湖沼學(xué)研究中的應(yīng)用從定性轉(zhuǎn)向定量.全球范圍內(nèi)基于沉積物搖蚊亞化石的溫度、營養(yǎng)鹽、降水等指標(biāo)的定量重建工作相繼開展[7-9]，為區(qū)域及全球環(huán)境變化研究提供了大量基礎(chǔ)性數(shù)據(jù).

然而，作為古環(huán)境有效生物代用指標(biāo)，亞化石搖蚊頭殼的應(yīng)用范圍遠(yuǎn)不如孢粉和硅藻等其他生物指標(biāo).1990年以來，諸多學(xué)者對亞化石搖蚊頭殼的前處理過程進(jìn)行了不斷改進(jìn)，目前形成了一套“樣品分散—過篩—挑揀—制片—鑒定”的標(biāo)準(zhǔn)流程[2].然而，手動將搖蚊頭殼從沉積物中一一提取出來并封片是一項極其繁瑣、耗時的工作，即使是熟練的工作人員也需要4～8 h(視頭殼總數(shù)及樣品類型而有所不同)才能完成一個樣品的頭殼挑揀及封片工作，這可能是限制亞化石搖蚊應(yīng)用范圍進(jìn)一步推廣的原因之一.因此，亟需尋找一種能提高前處理效率的方法，節(jié)約科研人員的時間及人力成本.

學(xué)者們嘗試各種方法希望解決這一難題.ROLLAND N和LAROCQUE I發(fā)現(xiàn)煤油浮選方法可以快速、有效地提取搖蚊頭殼，但對易被沉積物填充的較大殼體效果并不明顯[10].同時，VERSCHUREN D和EGGERMONT H提出前處理過程中使用大孔徑(>150 μm)分樣篩可有效縮短樣品處理時間，且對搖蚊古生態(tài)信息解譯不會產(chǎn)生較大影響[11]，但是，他們所用湖泊沉積物樣品取自非洲，熱帶地區(qū)的搖蚊頭殼相對較大，大孔徑分樣篩不會導(dǎo)致大量搖蚊殼體的遺失，但該方法對于高緯地區(qū)冷水湖泊中較小殼體可能并不適用. VELLE G和LAROCQUE I建議通過添加已知濃度的微球標(biāo)記物快速估算沉積物搖蚊頭殼濃度，但這對亞化石搖蚊種群組成及古生態(tài)解譯研究作用并不明顯[12].直到2011年，LAROCQUE-TOBLER I和OBERLI F嘗試?yán)妹匏{(lán)(cotton blue)對沉積物搖蚊頭殼進(jìn)行染色[13]，從而增強(qiáng)搖蚊頭殼和其它雜質(zhì)間對比度，雖然仍需將搖蚊頭殼手動一一挑揀，但這無疑加快了工作人員識別、挑揀搖蚊頭殼的速度，提高了樣品處理效率.

鑒于棉藍(lán)試劑及其他染色劑在生物樣品處理中的成功應(yīng)用[14]，本文嘗試?yán)昧硗庖环N染色劑-苯胺藍(lán)-乳酚油試劑對沉積物搖蚊頭殼進(jìn)行染色處理，通過與未染色樣品中頭殼著色情況、種群組成特征等進(jìn)行對比，探討該染色劑是否能有效提高搖蚊亞化石提取效率，以尋求更多、更有效的樣品處理方法，擴(kuò)大搖蚊亞化石作為古環(huán)境有效代用指標(biāo)的應(yīng)用范圍.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

共10個水體表層沉積物樣品用于本實驗染色分析.樣品分別于2015年11月、2018年11月和2019年3月在華中科技大學(xué)、中南財經(jīng)政法大學(xué)和中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)校園水體內(nèi)采得，各水體具體信息見表1.采樣過程使用1/32 m2彼得森抓泥器抓取水體沉積物，刮取表層0～1 cm樣品并置于自封袋中，4 ℃冷藏以備分析測試.

表1 采樣點屬性信息Tab.1 Information of sampling sites

1.2 染色劑配制

將苯酚(20 mL)、乳酸(20 mL)、甘油(40 mL)及蒸餾水(20 mL)以1∶1∶2∶1比例配制，混合均勻后加入苯胺藍(lán)(150 mg)將其配成1%的苯胺藍(lán)-乳酚油試劑(后稱“苯胺藍(lán)染色劑”)，待溶解穩(wěn)定后進(jìn)行使用.

1.3 樣品染色及分析

每個表層樣品稱取質(zhì)量相當(dāng)?shù)某练e物兩份，置于100 mL燒杯中并分別標(biāo)記為對照組(無染色)和實驗組(苯胺藍(lán)染色劑染色).兩組樣品按文獻(xiàn)[2]提出的沉積物搖蚊頭殼提取標(biāo)準(zhǔn)方法同時進(jìn)行前處理：加入 10% KOH適量，置于75 ℃水浴鍋中加熱15 min后依次過 212 μm和90 μm分樣篩, 將剩余樣品反復(fù)沖洗后轉(zhuǎn)移至燒杯中以備頭殼提取或后續(xù)染色.

取清洗后的實驗組樣品，加入適量苯胺藍(lán)染色劑(以殘余樣品能完全被染液淹沒為準(zhǔn))，后置于室溫下靜置染色約2 h(不同樣品可酌情增減染色時間).將染色后的樣品再次清洗過篩，用水洗去染液后，將篩網(wǎng)中剩余樣品轉(zhuǎn)移至生物解剖鏡下，用鑷子將搖蚊頭殼手工揀出, 并用Hydromatrix?將其封片.對照組樣品不進(jìn)行染色，直接轉(zhuǎn)移至鏡下手動提取搖蚊頭殼并進(jìn)行封片處理.提取的所有搖蚊頭殼在100～400倍生物顯微鏡(Nikon ECLIPSE E200)下進(jìn)行屬種鑒定，盡可能鑒定到種級水平.將完整的或具大部分頦的頭殼計為一個，將半個頦的計為半個，不足一半的不統(tǒng)計.搖蚊屬種鑒定主要依據(jù)文獻(xiàn)[2,15]進(jìn)行.

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用搖蚊頭殼濃度和屬種數(shù)對各樣點對照組和實驗組樣品中搖蚊豐度和屬種豐富度進(jìn)行評價.配對樣本t檢驗用于判別對照組和實驗組樣品中的搖蚊頭殼濃度和屬種豐富度有無顯著性差異.計算各個屬種百分含量以衡量對照組和實驗組中搖蚊種群組成，并在TILIA-GRAPH 1.7.16中制圖，配對樣本t檢驗在SPSS 25中實現(xiàn).

2 結(jié)果與討論

2.1 染色可提高搖蚊頭殼提取效率

染色和未染色樣品在顯微鏡下呈現(xiàn)出顯著不同的效果.由圖1可見：對照組樣品中，搖蚊頭殼與背景雜質(zhì)色調(diào)較為一致，頭殼與其它物質(zhì)較難快速區(qū)分，增加了挑樣難度；而經(jīng)染色后的樣品，搖蚊頭殼呈現(xiàn)鮮艷的藍(lán)色，在雜質(zhì)較多的背景中非常突出，易于識別和快速挑取.實驗表明：一個未染色沉積物樣品搖蚊頭殼提取所需時間約為3～5 h(所得頭殼>50頭)，而染色樣品所需時間僅為2～3 h，節(jié)省時間成本約30%～40%.此外，搖蚊頭殼提取過程中，部分較小的頭殼易于在水面上漂浮，其經(jīng)染色后更容易引起實驗人員的注意，提高挑樣速度的同時可降低較小殼體遺漏的可能性.

框內(nèi)目標(biāo)即為搖蚊頭殼，圖片在相同放大倍數(shù)下拍攝，未經(jīng)任何后期處理.圖1 顯微鏡下?lián)u蚊頭殼樣品圖 Fig.1 Sample photos of the chironomid head capsules under microscope(a), (b)對照組；(c), (d) 實驗組

2.2 染色對搖蚊鑒定的影響

100倍顯微鏡下，經(jīng)苯胺藍(lán)染色后的殼體不同部位著色對比明顯(圖2).

圖2 100倍顯微鏡下染色組和未染色組搖蚊頭殼對比圖 Fig.2 Comparison of chironomid head capsules between stained and unstained group under 100× magnification (a), (b), (c), (d) 染色組，著色程度不同，其中圖(c)為染色后一段時間出現(xiàn)褪色；(e), (f) 未染色組

圖2中頦板(mentum)、上顎(mandible)、前上顎(premandible)及后頭板(post-occipital plate)邊緣等部位呈現(xiàn)褐色或黑褐色，而其余部位為淺藍(lán)到藍(lán)色.

400倍顯微鏡下，特征部位著色對比也非常明顯(圖3).如腹頦板是亞化石搖蚊鑒定中最為重要的特征之一，但一般較難識別其細(xì)微特征.經(jīng)染色后的殼體上，腹頦板邊緣著色較淺，而中部及基部呈現(xiàn)藍(lán)色，影線紋也更加明顯.由于前上顎為褐色，與殼體其它部位著色差異明顯，有利于快速區(qū)分搖蚊亞科長附搖蚊族各屬幼蟲的殼體.此外，毛孔邊緣較周邊殼體位置著色略深，對快速識別部分屬種(尤其長足搖蚊亞科和直突搖蚊亞科)特征非常有利.說明苯胺藍(lán)染色能提高殼體特征部位與其它部位對比度，有利于鑒定特征及生物屬種的快速識別.

圖3 400倍生物顯微鏡下染色與未染色頭殼鑒定特征 Fig.3 Identification characteristics of stained and unstained chironomid head capsules under 400× magnification (a), (c), (e), (g) 染色組；(b), (d), (f), (h) 未染色組；(a),(b) Glyptotendipes腹頦板輪廓及影線紋; (c) Glyptotendipes上顎及前上顎; (d) Procladius腹部毛序; (e),(f) Tanytarsus腹頦板邊緣; (g),(h) Polypedilum亞頦毛孔

2.3 搖蚊組成及種群特征

所有樣品中搖蚊頭殼濃度變化范圍為1.9～22.1 ind·g-1濕樣，其中最小值出現(xiàn)在實驗組的L2樣品，最大值為對照組的L4樣品；搖蚊屬種數(shù)在9～24之間變化，最小值為實驗組的L1、L2和對照組的L2樣品，最大值為對照組的L5(圖4).圖4表明，除L4和L5兩個樣點不同處理方式下頭殼濃度出現(xiàn)較大偏差外，其余樣點均勻分布于1∶1線兩側(cè)；50%的樣點實驗組搖蚊屬種數(shù)高于對照組，說明苯胺藍(lán)染色不會降低屬種分類精度.同時，t檢驗結(jié)果表明對照組和實驗組搖蚊頭殼濃度和屬種數(shù)均不存在顯著差異(P>0.05)，說明染色對以上搖蚊種群特征并未產(chǎn)生顯著影響.

圖4 對照組和實驗組樣品搖蚊頭殼濃度和屬種豐度對比圖Fig.4 Comparison of head capsule density and species richness between control and experimental samples

主要搖蚊組合圖譜(圖5)顯示，大部分樣點對照組和實驗組搖蚊種群組成上非常相似.將對照組和實驗組中出現(xiàn)的各個屬種百分含量進(jìn)行對比(圖6)，結(jié)果表明：僅有L7樣點中的Glyptotendipespallens-type以及L1和P9樣點中的Cricotopussylvestris-type落在1∶1線的±10%偏差線以外，說明L1樣點中的Cricotopussylvestris-type被高估，而L7中的Glyptotendipespallens-type和P9中的Cricotopussylvestris-type則被低估.10個樣點中共有14個屬種位于±5%～±10%偏差范圍內(nèi)，約占所有屬種的5.2%，說明這些屬種雖然存在高估或低估的現(xiàn)象，但誤差較小.

C為對照組；E為實驗組.圖5 主要搖蚊組合圖譜Fig.5 Major chironomid assemblages

實線為兩種處理方式中搖蚊屬種相對豐度1∶1關(guān)系線，其±5%和±10%偏差線分別用短虛線、長虛線表示；圖中標(biāo)示了位于±10%偏差范圍外的屬種及其所屬樣品號.圖6 對照組和實驗組搖蚊屬種相對豐度散點圖 Fig.6 Comparison of taxa relative abundance in control and experimental samples

3 結(jié)論

(1)苯胺藍(lán)染色能使沉積物搖蚊頭殼挑揀時間縮短約30%～40%，有效提高頭殼提取效率.

(2)苯胺藍(lán)染色后搖蚊頭殼各部分著色對比更加明顯，方便了對特征部位的快速辨識，更有利于搖蚊頭殼的鑒定和分類.

(3)染色后搖蚊頭殼濃度及屬種豐度并未發(fā)生顯著變化，說明苯胺藍(lán)染色過程不會對搖蚊古生態(tài)信息的解譯產(chǎn)生顯著影響.