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    基于液質(zhì)聯(lián)用和代謝組學(xué)方法分析11種動物類中藥脂質(zhì)成分

    2021-08-13 08:52:36鞏曉宇嚴(yán)俊珍張麗陸燕萍陳黎
    關(guān)鍵詞:動物類代謝物脂質(zhì)

    鞏曉宇,嚴(yán)俊珍,張麗,陸燕萍,陳黎

    (深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院 & 香港中文大學(xué)(深圳)附屬第三醫(yī)院(籌),深圳 518172)

    動物類中藥中除去蛋白類,主要的化學(xué)物質(zhì)是脂質(zhì)成分[1-3],研究比較不同動物類中藥中脂質(zhì)成分的差異,可以鑒別和分類不同來源的動物類中藥,同時也可以指導(dǎo)藥物作用機制和臨床應(yīng)用研究.因脂類成分參與能量運輸、細(xì)胞間的信息通訊等,故脂類代謝在動物類樣本的生理代謝中占主導(dǎo)地位,其化學(xué)成分也是探討動物類樣本化合物特征的重要參考[4-6].本文基于液相-質(zhì)譜/質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測平臺,利用自建數(shù)據(jù)庫,采用MRM(多反應(yīng)監(jiān)測)檢測模式,對動物類中藥中脂質(zhì)代謝物進行檢測定性定量.利用自建多元統(tǒng)計分析流程,對定性定量脂質(zhì)數(shù)據(jù)進行差異分析.

    代謝組學(xué)分析的主要目的是從生物樣本中檢測出各種特征化合物,通過差異物分析和統(tǒng)計學(xué)建模,對樣品的特征進行歸納,探索不同生物體樣品的特點并進行歸類,同時闡明代謝過程的生物學(xué)機制.本文選取11個樣品,基于實驗設(shè)計、樣本的采集及處理、代謝物提取及代謝物的檢測分析鑒定出1050個代謝物.通過獲取的代謝組數(shù)據(jù),進行代謝物的鑒定與樣本數(shù)據(jù)的質(zhì)控分析和統(tǒng)計學(xué)分析,篩選差異的代謝物,對不同類型的動物類中藥進行分類識別、差異物鑒定等,從而對樣本的特征進行相關(guān)的功能預(yù)測和判別.

    1 儀器與試劑

    LC30A超高相液相色譜儀(日本島津);6500 QTRAP串聯(lián)質(zhì)譜(Applied Biosystems);ACQUITY UPLC HSS T3 C18色譜柱(美國Waters);5427R高速臺式離心機(德國艾本德).

    甲醇、甲酸銨為分析純,購于上海化學(xué)試劑廠;乙腈、異丙醇為色譜純,水為純化水.樣品信息詳見表1,所有樣品均按照國家標(biāo)準(zhǔn)進行鑒定.

    表1 樣品信息表Tab.1 Sample information table

    2 方法與結(jié)果

    2.1 供試品溶液的制備

    樣品進行冷凍干燥,在液氮環(huán)境下研磨成細(xì)粉,稱量20 mg加入到對應(yīng)的已編號的2 mL離心管中,加入1 mL脂質(zhì)提取液[V(甲基叔丁基醚)∶V(甲醇)=3∶1],并放入鋼珠,搖勻;用球磨機勻漿,取出鋼珠,渦旋15 min 加入200 μL水,渦旋1 min,置離心機中離心(轉(zhuǎn)速12000 r·min-1、4 ℃,10 min);吸取上層清液300 μL,放置在離心管中,濃縮至干,然后加入用200 μL 流動相 B,充分溶解,得到供試品溶液[7-9].

    2.2 色譜條件及質(zhì)譜條件的選擇

    流動相:A相:乙腈/水(60/40,V/V)(含 0.1% 甲酸,10 mmol·L-1甲酸銨);B相:乙腈/異丙醇(10/90,V/V,含 0.1% 甲酸,10 mmol·L-1甲酸銨),進行梯度洗脫(0~10 min:A相從95%~5%;10~15 min:A相保持在5%;15~18 min,A相從5%~95%).設(shè)定流速0.35 mL·min-1,柱溫40 ℃,進樣量2 μL.

    質(zhì)譜條件:同時采用正離子模式和負(fù)離子模式進行檢測,離子源溫度500 ℃,正離子模式下質(zhì)譜電壓設(shè)置為5500 V,負(fù)離子模式下質(zhì)譜電壓設(shè)置為-4500 V,離子源gas1(GS1)45 psi, gas2(GS2)55 psi,簾氣(curtain gas, CUR)35 psi.

    數(shù)據(jù)比對基于自建數(shù)據(jù)庫(武漢邁特維爾公司),數(shù)據(jù)庫的建立基于數(shù)千種脂質(zhì)化合物通過對照品確定保留時間和離子對信息,本文中選擇三重四級桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM),將所有離子對信息和保留時間信息輸入到方法學(xué)文件,得到不同樣本的質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后,對所有物質(zhì)的質(zhì)譜信號進行峰面積積分.圖1顯示的是質(zhì)控混合樣品(將所有動物類中藥樣品提取液各取100 μL混合)的總離子流圖,圖2是 MRM代謝物檢測多峰圖.

    圖1 11種動物類中藥混合樣品的總離子流圖Fig.1 Total ion current diagram of 11 kinds of animal traditionalChinese medicine mixed samples (a)負(fù)離子模式;(b) 正離子模式

    圖2 MRM代謝物檢測多峰圖Fig.2 MRM metabolite detection multi peak map(a)負(fù)離子模式;(b) 正離子模式

    對所有單一動物類中藥樣品的總離子流圖進行分析,可以發(fā)現(xiàn)每類樣品中均檢測出較為豐富的脂質(zhì)類化合物成分,本文采用相對定量的方法,根據(jù)保留時間與離子對信息,對每個化合物成分在不同樣本中檢測到的質(zhì)譜峰進行校正.圖3展示了隨機抽取的代謝物在不同樣本中的定量分析積分校正結(jié)果,橫坐標(biāo)為代謝物檢測的保留時間(min),縱坐標(biāo)為某代謝物離子檢測的離子流強度(cps).結(jié)合分離度和信噪比,共鑒定出1050個化合物.

    圖3 代謝物定量分析積分校正圖Fig.3 Integral correction chart of metabolite quantitative analysis圖中為隨機抽取的代謝物在不同樣本中的定量分析積分校正結(jié)果,橫坐標(biāo)為代謝物檢測的保留時間

    2.3 代謝組學(xué)分析

    單純從總離子流圖上看,不同動物類中藥較為相似,而且每種動物類中藥中有大量的共有成分,差異離子對信號也多被掩蓋,很難進行鑒定和區(qū)分.代謝組學(xué)分析的目標(biāo)是通過統(tǒng)計學(xué)方法,對樣品的整體成分及其分布進行考察,確定樣品之間的相關(guān)性和差異性,從而達到鑒別區(qū)分不同動物類中藥、指導(dǎo)生物學(xué)分類的目的.以下結(jié)合統(tǒng)計學(xué)軟件,對所有樣品中檢測到的脂質(zhì)類化合物成分進行多種代謝組學(xué)分析,以鑒別分析,文中相關(guān)性圖、聚類熱圖、PCA和OPLS-DA通過Simca-p統(tǒng)計學(xué)軟件繪制.

    2.3.1 相關(guān)性圖和聚類熱圖分析

    為了考察樣品間的相關(guān)性,通過對各樣品進行層次聚類,去除空值,對每個批次樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析,然后對所有檢測出的成分進行積分、匹配和峰強度校正等,得到它們的相關(guān)性熱圖.結(jié)果如圖4.

    圖4 樣品相關(guān)性圖Fig.4 Sample correlation diagram(a)包含mix混合樣品;(b) 不包含mix混合樣品

    圖4中橫縱坐標(biāo)為各個樣品信息,不同顏色代表樣品間相關(guān)性強弱,紅色表示相關(guān)性強,藍色表示相關(guān)性弱.圖4(a)中3個mix混合樣品緊密聚合一起,與預(yù)期相符合,表明數(shù)據(jù)質(zhì)控符合要求.此外,金錢白花蛇、烏梢蛇、地龍、燙水蛭和紫河車具有較多類似成分,聚為一類;炒九香蟲、全蝎和炒僵蠶聚為一類;海馬、土鱉蟲和壁虎聚為一類.在不同的類型中,也有更為相似的聚類關(guān)系,如土鱉蟲和壁虎、烏梢蛇和紫河車等,這種相似的成分,也提示在藥材療效和適用性上具有一定的相關(guān)性,為藥物成分的開發(fā)和利用提供有意義的參考.

    除了對樣品和代謝物兩個維度對代謝數(shù)據(jù)進行了層次聚類,本文還通過色階熱圖進行展示,更直觀地看出不同類型動物中藥中脂質(zhì)成分的異同、數(shù)據(jù)分布情況及不同樣品的相關(guān)性,結(jié)果如圖5.

    圖5 樣品代謝物的聚類熱圖Fig.5 Cluster thermogram of metabolites

    圖5的層次聚類熱圖是以代謝物相表達量經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行聚類,橫坐標(biāo)代表樣品信息,縱坐標(biāo)代表各樣品所含代謝物信息;顏色表示相對表達量的高低,紅色的為高表達,藍色的為低表達,可以直觀地觀察到不同樣品的異同.

    2.3.2 代謝組數(shù)據(jù)的PCA分析

    PCA分析是把復(fù)雜數(shù)據(jù)進行簡化的一種統(tǒng)計學(xué)方法,在中藥品種鑒定和分類研究上有廣泛的應(yīng)用[10-12].每種動物類中藥中檢測到化合物數(shù)量極大,很難直觀地比較,通過PCA方法處理,可以初步了解樣品間的分組情形,可進一步考察不同動物類中藥中脂質(zhì)成分整體代謝數(shù)據(jù)的相關(guān)性和差異情況,本文中將鑒定出的化合物作為多元數(shù)據(jù)集合,得到的PCA分析結(jié)果見圖6.

    圖6 PCA分析散點圖Fig.6 Scatter plot of PCA analysis

    圖6中橫縱坐標(biāo)軸分別代表PCA分析結(jié)果的前兩個主成分.圖中每個圓點代表1個樣品,圓點距離大小表示樣品相似度的遠近.從圖6中可見:3個混合樣品mix01、mix02、mix03很好地聚類到一起,說明樣品的質(zhì)控效果符合預(yù)期,由于不同類型的動物類中藥樣品在平面空間上有不同的分布空間,單純的PCA分析可以在平面空間上很好地表達物種之間的差異,但同時也存在不同樣品較為接近的情況,差異信息不能得到完整表達,例如樣品5(烏梢蛇)和樣品8(紫河車)顯示空間分布較為接近,提示在藥物的成分上差異性不明顯,藥理作用上的相關(guān)性也具有探討價值.

    2.3.3 代謝數(shù)據(jù)的PLS-DA分析及其置換檢驗結(jié)果

    為了更準(zhǔn)確地判別分析11個樣品中具有差異標(biāo)志物性質(zhì)的代謝物,對不同的樣品進行鑒定,結(jié)合前面的樣品聚類熱圖及PCA分析結(jié)果,對該代謝數(shù)據(jù)做PLS-DA分析.PLS-DA是多變量數(shù)據(jù)分析技術(shù)中的判別分析法,用來處理分類和判別問題.通過對主成分適當(dāng)?shù)男D(zhuǎn),PLS-DA可以有效地對組間觀察值進行區(qū)分,并找到導(dǎo)致組間區(qū)別的影響變量.分組情況如下:組別1:QX-2、CJC-9、CJXC-10、TBC-4;組別2:JQBHS-3、WSS-5、ZHC-8;組別3:DL-1、TSZ-7;組別4:BH-6、HM-11.結(jié)果見圖7.

    圖7 PLS-DA分析散點圖Fig.7 Scatter plot of PLS-DA analysis

    圖7中橫縱坐標(biāo)軸分別代表PLS-DA分析結(jié)果的前兩個主成分.圖中每個圓點代表1個樣品,圓點距離大小表示樣品相似度的遠近.不同顏色表示不同分組信息.由圖7可見:采用上述分組處理,可以較好地把11個樣品聚合成4類.

    為了驗證該PLS-DA模型分類效果是否理想,采用置換檢驗進行驗證,結(jié)果見圖8.置換檢驗可以有效地避免過擬合現(xiàn)象,更準(zhǔn)確的評估分類模型是否與實際相符,R2 接近1,模型與樣品數(shù)據(jù)匹配性更好,Q2 接近1,說明如果有建立的模型具有擴展性,新的樣品也可以按照類型匹配歸類,該方法對樣品之間的差異進行了很好地詮釋.隨著置換保留度逐漸降低,R2和Q2均逐漸下降,說明原模型不存在過擬合現(xiàn)象,表明模型的耐受性與穩(wěn)健性良好.

    圖8 置換檢驗分析Fig.8 Permutation test analysis

    以上結(jié)果表明:11種動物類中藥按照化學(xué)成分的異同,通過PLS-DA方法分為4類,其驗證結(jié)果具有合理性,全蝎、炒僵蠶、炒九香蟲、土鱉蟲為一類;金錢白花蛇、烏梢蛇、紫河車為一類;地龍與燙水蛭為一類;壁虎與海馬為一類.這和普通的動物學(xué)分類不完全相同,成分上的相似性,對應(yīng)藥理活性和作用機制上,也必然存在一定的關(guān)聯(lián),在藥物分析研究中,可以從同類型的動物中藥樣品中研究探討共同的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ),例如烏梢蛇和紫河車在物質(zhì)組成和分類上極為相似,提示在挖掘?qū)τ趧游镱愔兴幍幕钚猿煞盅芯可?,可以關(guān)聯(lián)分析分析;全蝎、炒僵蠶、炒九香蟲、土鱉蟲具有同類型的化合物較多,提示藥理活性上具有一定的相似性;壁虎與海馬,雖然來源不同,但化合物類型相似,可以作為替代品種進行對比研究.

    3 討論

    本文通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對比分析了11種動物類中藥中化合物成分,按照代謝組學(xué)的方法,共鑒定出樣品中上千種化學(xué)成分,同時基于統(tǒng)計學(xué)分析方法,對不同動物類中藥之間的親緣關(guān)系進行了分析和驗證.代謝組學(xué)的分析方法,基于樣品中大量物質(zhì)(離子對)信息進行綜合判斷,由于動物類中藥的藥理作用和脂質(zhì)類化學(xué)成分具有相關(guān)性,代謝組學(xué)的分析和傳統(tǒng)的生物學(xué)分類不完全相同,這對于闡明藥物的生物學(xué)藥理機制、發(fā)現(xiàn)藥物活性成分及合理用藥上提供了新的思路[13-15].

    通過代謝物分析,也可以闡明不同的炮制工藝對化學(xué)成分的分布和差異的影響[16-17],炒制后的動物類中藥化學(xué)成分上具有較強的關(guān)聯(lián),如炒僵蠶和炒九香蟲等,這表明脂質(zhì)代謝分析,對于動物類中藥的炮制工藝研究也具有很好的參考價值.炒制后的動物類中藥和一些凈制加工的動物類中藥也具有關(guān)聯(lián)性,這對于動物類中藥的合理炮制也提供了參考依據(jù).

    動物藥材一般是整體入藥,脂質(zhì)成分和蛋白類成分是主要的物質(zhì)基礎(chǔ),除了對樣品的分類和鑒定具有重要的意義,在藥理作用上也是主導(dǎo)作用,但不可忽視動物藥材中其他小分子代謝物,如有機酸類、揮發(fā)性成分等對藥理作用的影響,需要根據(jù)每類物質(zhì)的相對含量,確定不同成分在藥物活性的分析中的權(quán)重.

    由于脂質(zhì)成分物質(zhì)類型極為豐富,實驗中為了達到最佳的質(zhì)譜分析效果,對色譜條件進行了多次優(yōu)化,不同類型相對差異實驗中也對流動相體系做了相應(yīng)的考察,加入0.1%甲酸和10 mmol·L-1甲酸銨能有效改善色譜峰型,乙腈、異丙醇和水的梯度洗脫程序,可以分離出更多的脂質(zhì)成分,同時可以增加柱效,能讓物質(zhì)分離過程中充分的展開.

    以上的分析數(shù)據(jù)基于11種動物類中藥進行了初步嘗試,實驗中的樣本數(shù)量和品種偏少,但表明代謝分析方法對于動物類中藥的研究有很好的參考價值,下一步將繼續(xù)增加樣品數(shù)量和品種,便于更為準(zhǔn)確地研究動物類中藥的特性.

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