• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于液質(zhì)聯(lián)用和代謝組學(xué)方法分析11種動物類中藥脂質(zhì)成分

    2021-08-13 08:52:36鞏曉宇嚴(yán)俊珍張麗陸燕萍陳黎
    關(guān)鍵詞:動物類代謝物脂質(zhì)

    鞏曉宇,嚴(yán)俊珍,張麗,陸燕萍,陳黎

    (深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院 & 香港中文大學(xué)(深圳)附屬第三醫(yī)院(籌),深圳 518172)

    動物類中藥中除去蛋白類,主要的化學(xué)物質(zhì)是脂質(zhì)成分[1-3],研究比較不同動物類中藥中脂質(zhì)成分的差異,可以鑒別和分類不同來源的動物類中藥,同時也可以指導(dǎo)藥物作用機制和臨床應(yīng)用研究.因脂類成分參與能量運輸、細(xì)胞間的信息通訊等,故脂類代謝在動物類樣本的生理代謝中占主導(dǎo)地位,其化學(xué)成分也是探討動物類樣本化合物特征的重要參考[4-6].本文基于液相-質(zhì)譜/質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測平臺,利用自建數(shù)據(jù)庫,采用MRM(多反應(yīng)監(jiān)測)檢測模式,對動物類中藥中脂質(zhì)代謝物進行檢測定性定量.利用自建多元統(tǒng)計分析流程,對定性定量脂質(zhì)數(shù)據(jù)進行差異分析.

    代謝組學(xué)分析的主要目的是從生物樣本中檢測出各種特征化合物,通過差異物分析和統(tǒng)計學(xué)建模,對樣品的特征進行歸納,探索不同生物體樣品的特點并進行歸類,同時闡明代謝過程的生物學(xué)機制.本文選取11個樣品,基于實驗設(shè)計、樣本的采集及處理、代謝物提取及代謝物的檢測分析鑒定出1050個代謝物.通過獲取的代謝組數(shù)據(jù),進行代謝物的鑒定與樣本數(shù)據(jù)的質(zhì)控分析和統(tǒng)計學(xué)分析,篩選差異的代謝物,對不同類型的動物類中藥進行分類識別、差異物鑒定等,從而對樣本的特征進行相關(guān)的功能預(yù)測和判別.

    1 儀器與試劑

    LC30A超高相液相色譜儀(日本島津);6500 QTRAP串聯(lián)質(zhì)譜(Applied Biosystems);ACQUITY UPLC HSS T3 C18色譜柱(美國Waters);5427R高速臺式離心機(德國艾本德).

    甲醇、甲酸銨為分析純,購于上海化學(xué)試劑廠;乙腈、異丙醇為色譜純,水為純化水.樣品信息詳見表1,所有樣品均按照國家標(biāo)準(zhǔn)進行鑒定.

    表1 樣品信息表Tab.1 Sample information table

    2 方法與結(jié)果

    2.1 供試品溶液的制備

    樣品進行冷凍干燥,在液氮環(huán)境下研磨成細(xì)粉,稱量20 mg加入到對應(yīng)的已編號的2 mL離心管中,加入1 mL脂質(zhì)提取液[V(甲基叔丁基醚)∶V(甲醇)=3∶1],并放入鋼珠,搖勻;用球磨機勻漿,取出鋼珠,渦旋15 min 加入200 μL水,渦旋1 min,置離心機中離心(轉(zhuǎn)速12000 r·min-1、4 ℃,10 min);吸取上層清液300 μL,放置在離心管中,濃縮至干,然后加入用200 μL 流動相 B,充分溶解,得到供試品溶液[7-9].

    2.2 色譜條件及質(zhì)譜條件的選擇

    流動相:A相:乙腈/水(60/40,V/V)(含 0.1% 甲酸,10 mmol·L-1甲酸銨);B相:乙腈/異丙醇(10/90,V/V,含 0.1% 甲酸,10 mmol·L-1甲酸銨),進行梯度洗脫(0~10 min:A相從95%~5%;10~15 min:A相保持在5%;15~18 min,A相從5%~95%).設(shè)定流速0.35 mL·min-1,柱溫40 ℃,進樣量2 μL.

    質(zhì)譜條件:同時采用正離子模式和負(fù)離子模式進行檢測,離子源溫度500 ℃,正離子模式下質(zhì)譜電壓設(shè)置為5500 V,負(fù)離子模式下質(zhì)譜電壓設(shè)置為-4500 V,離子源gas1(GS1)45 psi, gas2(GS2)55 psi,簾氣(curtain gas, CUR)35 psi.

    數(shù)據(jù)比對基于自建數(shù)據(jù)庫(武漢邁特維爾公司),數(shù)據(jù)庫的建立基于數(shù)千種脂質(zhì)化合物通過對照品確定保留時間和離子對信息,本文中選擇三重四級桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM),將所有離子對信息和保留時間信息輸入到方法學(xué)文件,得到不同樣本的質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后,對所有物質(zhì)的質(zhì)譜信號進行峰面積積分.圖1顯示的是質(zhì)控混合樣品(將所有動物類中藥樣品提取液各取100 μL混合)的總離子流圖,圖2是 MRM代謝物檢測多峰圖.

    圖1 11種動物類中藥混合樣品的總離子流圖Fig.1 Total ion current diagram of 11 kinds of animal traditionalChinese medicine mixed samples (a)負(fù)離子模式;(b) 正離子模式

    圖2 MRM代謝物檢測多峰圖Fig.2 MRM metabolite detection multi peak map(a)負(fù)離子模式;(b) 正離子模式

    對所有單一動物類中藥樣品的總離子流圖進行分析,可以發(fā)現(xiàn)每類樣品中均檢測出較為豐富的脂質(zhì)類化合物成分,本文采用相對定量的方法,根據(jù)保留時間與離子對信息,對每個化合物成分在不同樣本中檢測到的質(zhì)譜峰進行校正.圖3展示了隨機抽取的代謝物在不同樣本中的定量分析積分校正結(jié)果,橫坐標(biāo)為代謝物檢測的保留時間(min),縱坐標(biāo)為某代謝物離子檢測的離子流強度(cps).結(jié)合分離度和信噪比,共鑒定出1050個化合物.

    圖3 代謝物定量分析積分校正圖Fig.3 Integral correction chart of metabolite quantitative analysis圖中為隨機抽取的代謝物在不同樣本中的定量分析積分校正結(jié)果,橫坐標(biāo)為代謝物檢測的保留時間

    2.3 代謝組學(xué)分析

    單純從總離子流圖上看,不同動物類中藥較為相似,而且每種動物類中藥中有大量的共有成分,差異離子對信號也多被掩蓋,很難進行鑒定和區(qū)分.代謝組學(xué)分析的目標(biāo)是通過統(tǒng)計學(xué)方法,對樣品的整體成分及其分布進行考察,確定樣品之間的相關(guān)性和差異性,從而達到鑒別區(qū)分不同動物類中藥、指導(dǎo)生物學(xué)分類的目的.以下結(jié)合統(tǒng)計學(xué)軟件,對所有樣品中檢測到的脂質(zhì)類化合物成分進行多種代謝組學(xué)分析,以鑒別分析,文中相關(guān)性圖、聚類熱圖、PCA和OPLS-DA通過Simca-p統(tǒng)計學(xué)軟件繪制.

    2.3.1 相關(guān)性圖和聚類熱圖分析

    為了考察樣品間的相關(guān)性,通過對各樣品進行層次聚類,去除空值,對每個批次樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析,然后對所有檢測出的成分進行積分、匹配和峰強度校正等,得到它們的相關(guān)性熱圖.結(jié)果如圖4.

    圖4 樣品相關(guān)性圖Fig.4 Sample correlation diagram(a)包含mix混合樣品;(b) 不包含mix混合樣品

    圖4中橫縱坐標(biāo)為各個樣品信息,不同顏色代表樣品間相關(guān)性強弱,紅色表示相關(guān)性強,藍色表示相關(guān)性弱.圖4(a)中3個mix混合樣品緊密聚合一起,與預(yù)期相符合,表明數(shù)據(jù)質(zhì)控符合要求.此外,金錢白花蛇、烏梢蛇、地龍、燙水蛭和紫河車具有較多類似成分,聚為一類;炒九香蟲、全蝎和炒僵蠶聚為一類;海馬、土鱉蟲和壁虎聚為一類.在不同的類型中,也有更為相似的聚類關(guān)系,如土鱉蟲和壁虎、烏梢蛇和紫河車等,這種相似的成分,也提示在藥材療效和適用性上具有一定的相關(guān)性,為藥物成分的開發(fā)和利用提供有意義的參考.

    除了對樣品和代謝物兩個維度對代謝數(shù)據(jù)進行了層次聚類,本文還通過色階熱圖進行展示,更直觀地看出不同類型動物中藥中脂質(zhì)成分的異同、數(shù)據(jù)分布情況及不同樣品的相關(guān)性,結(jié)果如圖5.

    圖5 樣品代謝物的聚類熱圖Fig.5 Cluster thermogram of metabolites

    圖5的層次聚類熱圖是以代謝物相表達量經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行聚類,橫坐標(biāo)代表樣品信息,縱坐標(biāo)代表各樣品所含代謝物信息;顏色表示相對表達量的高低,紅色的為高表達,藍色的為低表達,可以直觀地觀察到不同樣品的異同.

    2.3.2 代謝組數(shù)據(jù)的PCA分析

    PCA分析是把復(fù)雜數(shù)據(jù)進行簡化的一種統(tǒng)計學(xué)方法,在中藥品種鑒定和分類研究上有廣泛的應(yīng)用[10-12].每種動物類中藥中檢測到化合物數(shù)量極大,很難直觀地比較,通過PCA方法處理,可以初步了解樣品間的分組情形,可進一步考察不同動物類中藥中脂質(zhì)成分整體代謝數(shù)據(jù)的相關(guān)性和差異情況,本文中將鑒定出的化合物作為多元數(shù)據(jù)集合,得到的PCA分析結(jié)果見圖6.

    圖6 PCA分析散點圖Fig.6 Scatter plot of PCA analysis

    圖6中橫縱坐標(biāo)軸分別代表PCA分析結(jié)果的前兩個主成分.圖中每個圓點代表1個樣品,圓點距離大小表示樣品相似度的遠近.從圖6中可見:3個混合樣品mix01、mix02、mix03很好地聚類到一起,說明樣品的質(zhì)控效果符合預(yù)期,由于不同類型的動物類中藥樣品在平面空間上有不同的分布空間,單純的PCA分析可以在平面空間上很好地表達物種之間的差異,但同時也存在不同樣品較為接近的情況,差異信息不能得到完整表達,例如樣品5(烏梢蛇)和樣品8(紫河車)顯示空間分布較為接近,提示在藥物的成分上差異性不明顯,藥理作用上的相關(guān)性也具有探討價值.

    2.3.3 代謝數(shù)據(jù)的PLS-DA分析及其置換檢驗結(jié)果

    為了更準(zhǔn)確地判別分析11個樣品中具有差異標(biāo)志物性質(zhì)的代謝物,對不同的樣品進行鑒定,結(jié)合前面的樣品聚類熱圖及PCA分析結(jié)果,對該代謝數(shù)據(jù)做PLS-DA分析.PLS-DA是多變量數(shù)據(jù)分析技術(shù)中的判別分析法,用來處理分類和判別問題.通過對主成分適當(dāng)?shù)男D(zhuǎn),PLS-DA可以有效地對組間觀察值進行區(qū)分,并找到導(dǎo)致組間區(qū)別的影響變量.分組情況如下:組別1:QX-2、CJC-9、CJXC-10、TBC-4;組別2:JQBHS-3、WSS-5、ZHC-8;組別3:DL-1、TSZ-7;組別4:BH-6、HM-11.結(jié)果見圖7.

    圖7 PLS-DA分析散點圖Fig.7 Scatter plot of PLS-DA analysis

    圖7中橫縱坐標(biāo)軸分別代表PLS-DA分析結(jié)果的前兩個主成分.圖中每個圓點代表1個樣品,圓點距離大小表示樣品相似度的遠近.不同顏色表示不同分組信息.由圖7可見:采用上述分組處理,可以較好地把11個樣品聚合成4類.

    為了驗證該PLS-DA模型分類效果是否理想,采用置換檢驗進行驗證,結(jié)果見圖8.置換檢驗可以有效地避免過擬合現(xiàn)象,更準(zhǔn)確的評估分類模型是否與實際相符,R2 接近1,模型與樣品數(shù)據(jù)匹配性更好,Q2 接近1,說明如果有建立的模型具有擴展性,新的樣品也可以按照類型匹配歸類,該方法對樣品之間的差異進行了很好地詮釋.隨著置換保留度逐漸降低,R2和Q2均逐漸下降,說明原模型不存在過擬合現(xiàn)象,表明模型的耐受性與穩(wěn)健性良好.

    圖8 置換檢驗分析Fig.8 Permutation test analysis

    以上結(jié)果表明:11種動物類中藥按照化學(xué)成分的異同,通過PLS-DA方法分為4類,其驗證結(jié)果具有合理性,全蝎、炒僵蠶、炒九香蟲、土鱉蟲為一類;金錢白花蛇、烏梢蛇、紫河車為一類;地龍與燙水蛭為一類;壁虎與海馬為一類.這和普通的動物學(xué)分類不完全相同,成分上的相似性,對應(yīng)藥理活性和作用機制上,也必然存在一定的關(guān)聯(lián),在藥物分析研究中,可以從同類型的動物中藥樣品中研究探討共同的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ),例如烏梢蛇和紫河車在物質(zhì)組成和分類上極為相似,提示在挖掘?qū)τ趧游镱愔兴幍幕钚猿煞盅芯可?,可以關(guān)聯(lián)分析分析;全蝎、炒僵蠶、炒九香蟲、土鱉蟲具有同類型的化合物較多,提示藥理活性上具有一定的相似性;壁虎與海馬,雖然來源不同,但化合物類型相似,可以作為替代品種進行對比研究.

    3 討論

    本文通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對比分析了11種動物類中藥中化合物成分,按照代謝組學(xué)的方法,共鑒定出樣品中上千種化學(xué)成分,同時基于統(tǒng)計學(xué)分析方法,對不同動物類中藥之間的親緣關(guān)系進行了分析和驗證.代謝組學(xué)的分析方法,基于樣品中大量物質(zhì)(離子對)信息進行綜合判斷,由于動物類中藥的藥理作用和脂質(zhì)類化學(xué)成分具有相關(guān)性,代謝組學(xué)的分析和傳統(tǒng)的生物學(xué)分類不完全相同,這對于闡明藥物的生物學(xué)藥理機制、發(fā)現(xiàn)藥物活性成分及合理用藥上提供了新的思路[13-15].

    通過代謝物分析,也可以闡明不同的炮制工藝對化學(xué)成分的分布和差異的影響[16-17],炒制后的動物類中藥化學(xué)成分上具有較強的關(guān)聯(lián),如炒僵蠶和炒九香蟲等,這表明脂質(zhì)代謝分析,對于動物類中藥的炮制工藝研究也具有很好的參考價值.炒制后的動物類中藥和一些凈制加工的動物類中藥也具有關(guān)聯(lián)性,這對于動物類中藥的合理炮制也提供了參考依據(jù).

    動物藥材一般是整體入藥,脂質(zhì)成分和蛋白類成分是主要的物質(zhì)基礎(chǔ),除了對樣品的分類和鑒定具有重要的意義,在藥理作用上也是主導(dǎo)作用,但不可忽視動物藥材中其他小分子代謝物,如有機酸類、揮發(fā)性成分等對藥理作用的影響,需要根據(jù)每類物質(zhì)的相對含量,確定不同成分在藥物活性的分析中的權(quán)重.

    由于脂質(zhì)成分物質(zhì)類型極為豐富,實驗中為了達到最佳的質(zhì)譜分析效果,對色譜條件進行了多次優(yōu)化,不同類型相對差異實驗中也對流動相體系做了相應(yīng)的考察,加入0.1%甲酸和10 mmol·L-1甲酸銨能有效改善色譜峰型,乙腈、異丙醇和水的梯度洗脫程序,可以分離出更多的脂質(zhì)成分,同時可以增加柱效,能讓物質(zhì)分離過程中充分的展開.

    以上的分析數(shù)據(jù)基于11種動物類中藥進行了初步嘗試,實驗中的樣本數(shù)量和品種偏少,但表明代謝分析方法對于動物類中藥的研究有很好的參考價值,下一步將繼續(xù)增加樣品數(shù)量和品種,便于更為準(zhǔn)確地研究動物類中藥的特性.

    猜你喜歡
    動物類代謝物脂質(zhì)
    阿爾茨海默病血清代謝物的核磁共振氫譜技術(shù)分析
    小學(xué)動物類文本的有效閱讀策略
    淺談動物類藥在小兒哮喘中的應(yīng)用
    你想我猜
    復(fù)方一枝蒿提取物固體脂質(zhì)納米粒的制備
    中成藥(2018年9期)2018-10-09 07:18:36
    白楊素固體脂質(zhì)納米粒的制備及其藥動學(xué)行為
    中成藥(2018年1期)2018-02-02 07:19:53
    馬錢子堿固體脂質(zhì)納米粒在小鼠體內(nèi)的組織分布
    中成藥(2017年4期)2017-05-17 06:09:26
    從方言詞匯釋讀藍田農(nóng)村地區(qū)的獨特風(fēng)貌(一)
    柱前衍生化結(jié)合LC-MSn分析人尿中茶堿及其代謝物
    HPLC-MS/MS法分析乙酰甲喹在海參中的主要代謝物
    a级毛色黄片| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 岛国毛片在线播放| 老司机影院毛片| 小说图片视频综合网站| 日韩av不卡免费在线播放| 国产精品,欧美在线| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 搡女人真爽免费视频火全软件| 淫秽高清视频在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产成人aa在线观看| 国产色爽女视频免费观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 久久精品91蜜桃| 亚洲激情五月婷婷啪啪| av在线观看视频网站免费| 亚洲成色77777| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产亚洲精品av在线| www.av在线官网国产| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲在久久综合| 久久亚洲国产成人精品v| 国产视频内射| 国产真实乱freesex| 欧美xxxx性猛交bbbb| 一区二区三区乱码不卡18| 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲欧美日韩无卡精品| 日日啪夜夜撸| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 色网站视频免费| 亚洲av成人精品一二三区| 天美传媒精品一区二区| 国产视频内射| 特级一级黄色大片| 精品久久久久久久久亚洲| 精品久久久久久久久av| 久久久国产成人免费| 国产成人精品一,二区| 高清午夜精品一区二区三区| 亚洲国产欧美在线一区| 大香蕉97超碰在线| 一级爰片在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 国产探花极品一区二区| 欧美日韩在线观看h| 中国国产av一级| 免费黄色在线免费观看| 亚洲av成人精品一区久久| 欧美高清成人免费视频www| a级一级毛片免费在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产精品蜜桃在线观看| 欧美成人午夜免费资源| 国产在视频线在精品| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 韩国高清视频一区二区三区| 欧美成人一区二区免费高清观看| 久久精品久久精品一区二区三区| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 精品国内亚洲2022精品成人| 蜜臀久久99精品久久宅男| 男女国产视频网站| 亚洲人与动物交配视频| 少妇的逼水好多| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久久精品影院6| 久久国内精品自在自线图片| 午夜视频国产福利| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲av日韩在线播放| 熟女电影av网| 三级经典国产精品| 身体一侧抽搐| 国产乱人视频| 美女大奶头视频| 免费播放大片免费观看视频在线观看 | 夜夜爽夜夜爽视频| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产精品野战在线观看| 亚洲欧美日韩东京热| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲色图av天堂| 搞女人的毛片| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 在线观看av片永久免费下载| 我要搜黄色片| 欧美另类亚洲清纯唯美| 老司机影院毛片| 我的女老师完整版在线观看| 国产成人aa在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| 日产精品乱码卡一卡2卡三| av在线天堂中文字幕| 国产老妇伦熟女老妇高清| 男人狂女人下面高潮的视频| 老司机福利观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 成年av动漫网址| 国产淫语在线视频| a级一级毛片免费在线观看| 国产午夜精品论理片| .国产精品久久| 国产精品一区二区在线观看99 | 色视频www国产| 婷婷色av中文字幕| 国产 一区 欧美 日韩| 久久久精品大字幕| 日本三级黄在线观看| 99久久人妻综合| av福利片在线观看| 99久久中文字幕三级久久日本| 春色校园在线视频观看| 免费观看精品视频网站| 久久精品人妻少妇| 成人漫画全彩无遮挡| 成人鲁丝片一二三区免费| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 国产成人一区二区在线| eeuss影院久久| 国产成人a∨麻豆精品| 午夜久久久久精精品| 久久精品91蜜桃| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 一级av片app| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲精品乱久久久久久| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲欧美成人精品一区二区| 99热网站在线观看| 1024手机看黄色片| 97超碰精品成人国产| 深夜a级毛片| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 久久精品国产亚洲网站| 亚洲最大成人中文| 我的女老师完整版在线观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 2022亚洲国产成人精品| 国产黄片视频在线免费观看| av在线老鸭窝| 中文欧美无线码| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产色爽女视频免费观看| 在线观看av片永久免费下载| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 搞女人的毛片| 99热精品在线国产| 不卡视频在线观看欧美| 熟女电影av网| av在线观看视频网站免费| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 青春草国产在线视频| 久久久久国产网址| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 亚洲第一区二区三区不卡| 久久国产乱子免费精品| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产亚洲精品久久久com| 秋霞在线观看毛片| 内地一区二区视频在线| 成人美女网站在线观看视频| kizo精华| 少妇熟女aⅴ在线视频| 在线观看av片永久免费下载| 综合色丁香网| 黄色欧美视频在线观看| 深夜a级毛片| 日韩欧美精品免费久久| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产精品一及| 麻豆av噜噜一区二区三区| 波野结衣二区三区在线| 日日撸夜夜添| 亚洲va在线va天堂va国产| 欧美成人免费av一区二区三区| 又爽又黄a免费视频| 亚洲在久久综合| 在线观看av片永久免费下载| 亚洲精品日韩av片在线观看| 综合色av麻豆| 久久久久九九精品影院| 桃色一区二区三区在线观看| 日本一本二区三区精品| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 欧美97在线视频| 国产伦在线观看视频一区| 日韩av不卡免费在线播放| 免费电影在线观看免费观看| 免费搜索国产男女视频| 久久精品国产亚洲网站| 国产探花在线观看一区二区| 色网站视频免费| 国内揄拍国产精品人妻在线| 一夜夜www| 嘟嘟电影网在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 少妇的逼好多水| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产成人a区在线观看| 日本免费在线观看一区| 久久久久久久久大av| 国产精品久久久久久av不卡| 成人亚洲精品av一区二区| 国内精品一区二区在线观看| 日韩欧美精品v在线| 国产黄色小视频在线观看| 久久久国产成人精品二区| 欧美日韩国产亚洲二区| av在线蜜桃| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 一二三四中文在线观看免费高清| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 日韩一区二区视频免费看| 亚洲第一区二区三区不卡| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 欧美激情在线99| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲真实伦在线观看| 九九热线精品视视频播放| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久久午夜欧美精品| 亚洲精品国产成人久久av| 久久精品国产亚洲av天美| 久久久亚洲精品成人影院| 免费搜索国产男女视频| kizo精华| 少妇的逼好多水| 高清毛片免费看| 波多野结衣高清无吗| 嫩草影院入口| 国产探花极品一区二区| 亚洲欧洲日产国产| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 日本五十路高清| 男插女下体视频免费在线播放| 国产精品99久久久久久久久| 国产精品三级大全| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 中文字幕av成人在线电影| av国产久精品久网站免费入址| 91精品一卡2卡3卡4卡| 日韩三级伦理在线观看| 中文字幕制服av| ponron亚洲| 好男人视频免费观看在线| 久久亚洲国产成人精品v| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 99久国产av精品| ponron亚洲| 丰满少妇做爰视频| 欧美+日韩+精品| 国产黄a三级三级三级人| 日本三级黄在线观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 99久久精品国产国产毛片| 内射极品少妇av片p| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 99久久人妻综合| 日本与韩国留学比较| 在现免费观看毛片| 看十八女毛片水多多多| 舔av片在线| 国产日韩欧美在线精品| 久久亚洲精品不卡| 久久久国产成人精品二区| 中文天堂在线官网| 丰满少妇做爰视频| 国产毛片a区久久久久| 综合色av麻豆| 国产在线男女| АⅤ资源中文在线天堂| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 日韩欧美精品v在线| 国产亚洲5aaaaa淫片| 一边摸一边抽搐一进一小说| 少妇高潮的动态图| 在线观看美女被高潮喷水网站| 免费人成在线观看视频色| 亚洲美女视频黄频| 如何舔出高潮| 亚洲国产精品sss在线观看| 51国产日韩欧美| 色网站视频免费| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产淫语在线视频| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲精品一区蜜桃| 色噜噜av男人的天堂激情| 久久久久性生活片| 久久热精品热| 国产人妻一区二区三区在| 波野结衣二区三区在线| 日日摸夜夜添夜夜爱| 日韩在线高清观看一区二区三区| 一边亲一边摸免费视频| 观看免费一级毛片| 久久这里只有精品中国| 午夜福利成人在线免费观看| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲人与动物交配视频| 身体一侧抽搐| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲成人av在线免费| 免费观看性生交大片5| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 中文字幕熟女人妻在线| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 色吧在线观看| 国产在视频线在精品| 成人国产麻豆网| 又爽又黄无遮挡网站| 日日啪夜夜撸| 久久精品国产亚洲网站| 午夜日本视频在线| 亚洲成人久久爱视频| av在线蜜桃| 六月丁香七月| 日本熟妇午夜| 两个人视频免费观看高清| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲内射少妇av| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 久久久成人免费电影| 午夜精品国产一区二区电影 | 成人欧美大片| 国产一区二区在线av高清观看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲av免费在线观看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 国产午夜福利久久久久久| 91久久精品国产一区二区三区| 国产69精品久久久久777片| 看片在线看免费视频| 永久免费av网站大全| 九九热线精品视视频播放| 欧美成人精品欧美一级黄| 日本-黄色视频高清免费观看| 97在线视频观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲成人av在线免费| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 99热全是精品| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 午夜激情欧美在线| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 男人舔女人下体高潮全视频| 1024手机看黄色片| 亚洲在久久综合| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 村上凉子中文字幕在线| 一边摸一边抽搐一进一小说| 啦啦啦韩国在线观看视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 99久久精品国产国产毛片| 高清视频免费观看一区二区 | 亚洲av男天堂| a级毛色黄片| 在线天堂最新版资源| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 成人美女网站在线观看视频| 国产一区亚洲一区在线观看| 中文字幕久久专区| 99在线人妻在线中文字幕| 国产成人精品一,二区| 国产成年人精品一区二区| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 日本午夜av视频| 国产单亲对白刺激| 五月伊人婷婷丁香| 国产单亲对白刺激| 黄片wwwwww| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 精品国产三级普通话版| 亚洲久久久久久中文字幕| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 婷婷六月久久综合丁香| 国产久久久一区二区三区| 国产不卡一卡二| 亚洲av不卡在线观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 乱系列少妇在线播放| 日韩人妻高清精品专区| 三级国产精品片| 国产三级在线视频| 亚洲精品456在线播放app| 中文欧美无线码| 久久草成人影院| 五月伊人婷婷丁香| 中文字幕制服av| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲久久久久久中文字幕| 久久久久精品久久久久真实原创| 欧美成人午夜免费资源| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲av成人精品一区久久| 久久精品影院6| 久久这里有精品视频免费| 91久久精品国产一区二区三区| 麻豆一二三区av精品| 日韩强制内射视频| 内射极品少妇av片p| 成人午夜高清在线视频| 成年版毛片免费区| 丰满少妇做爰视频| 最近中文字幕2019免费版| 欧美成人一区二区免费高清观看| 在线a可以看的网站| 天天躁日日操中文字幕| 国产熟女欧美一区二区| av女优亚洲男人天堂| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 毛片一级片免费看久久久久| 国产精品人妻久久久久久| 国产私拍福利视频在线观看| 日本黄色片子视频| 亚洲电影在线观看av| 亚洲av成人av| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲av日韩在线播放| 国产高清有码在线观看视频| 人人妻人人看人人澡| 国产精品久久久久久精品电影| a级毛色黄片| 亚洲欧美精品自产自拍| 91久久精品国产一区二区三区| 国产在线一区二区三区精 | 五月玫瑰六月丁香| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产三级在线视频| 国产精品国产三级国产专区5o | 三级毛片av免费| 亚洲电影在线观看av| 岛国在线免费视频观看| a级一级毛片免费在线观看| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲国产精品sss在线观看| 秋霞在线观看毛片| 成人毛片a级毛片在线播放| 日本一二三区视频观看| 亚洲成色77777| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 欧美成人午夜免费资源| 男人舔奶头视频| 一区二区三区免费毛片| www.av在线官网国产| 国产黄片视频在线免费观看| 国产老妇女一区| 精品欧美国产一区二区三| 国产三级中文精品| 成人亚洲精品av一区二区| 国产精品,欧美在线| 秋霞伦理黄片| av在线播放精品| 欧美区成人在线视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲不卡免费看| 国产成年人精品一区二区| 人人妻人人看人人澡| 日日干狠狠操夜夜爽| 欧美激情国产日韩精品一区| 在线观看美女被高潮喷水网站| 成人午夜精彩视频在线观看| 在线免费观看的www视频| 国产精品久久电影中文字幕| 黄片无遮挡物在线观看| av女优亚洲男人天堂| 成年女人看的毛片在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 免费电影在线观看免费观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产精品无大码| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 三级国产精品欧美在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲成色77777| 一二三四中文在线观看免费高清| 少妇熟女aⅴ在线视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 一级毛片aaaaaa免费看小| 在线免费观看的www视频| 久久久久久久国产电影| 国产三级在线视频| 美女cb高潮喷水在线观看| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 一区二区三区四区激情视频| 日本熟妇午夜| av视频在线观看入口| 搞女人的毛片| 日韩成人av中文字幕在线观看| 免费av观看视频| 国产精品三级大全| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 久久久久国产网址| 国产精品爽爽va在线观看网站| 看黄色毛片网站| 一边亲一边摸免费视频| 国产成人精品一,二区| 黑人高潮一二区| 最近最新中文字幕大全电影3| 最近最新中文字幕免费大全7| 亚洲图色成人| 亚洲欧洲国产日韩| 国产精品永久免费网站| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 高清在线视频一区二区三区 | 一本一本综合久久| 免费观看在线日韩| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲精品自拍成人| 美女高潮的动态| 26uuu在线亚洲综合色| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产私拍福利视频在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 高清av免费在线| 人人妻人人看人人澡| 偷拍熟女少妇极品色| 国产成人freesex在线| 91久久精品国产一区二区成人| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产免费视频播放在线视频 | 三级经典国产精品| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲国产最新在线播放| 国产av码专区亚洲av| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 日本欧美国产在线视频| 我的老师免费观看完整版| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 亚洲成色77777| 一区二区三区免费毛片| 全区人妻精品视频| 国内精品宾馆在线| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲国产精品sss在线观看| 中文字幕免费在线视频6| 日本wwww免费看| 午夜精品一区二区三区免费看| 久久久久久久午夜电影| 国产探花极品一区二区| 亚洲五月天丁香| 永久网站在线| 最近的中文字幕免费完整| 国产亚洲5aaaaa淫片| 亚洲国产成人一精品久久久| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 免费搜索国产男女视频| 高清午夜精品一区二区三区| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 插逼视频在线观看| 久久国内精品自在自线图片| 日本黄大片高清| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 在现免费观看毛片| 我的老师免费观看完整版| 午夜激情欧美在线| 亚洲自拍偷在线| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲精品色激情综合| 国产一区有黄有色的免费视频 | 两个人的视频大全免费| 一级黄片播放器| 国产一区二区三区av在线| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲伊人久久精品综合 | 日本免费在线观看一区| 亚洲国产色片| 国产三级在线视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲精品色激情综合| 午夜免费男女啪啪视频观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 中文亚洲av片在线观看爽| 精品一区二区三区视频在线| 日本五十路高清| 亚洲不卡免费看| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产在线男女| 日本爱情动作片www.在线观看| 久久久久久久久久久免费av| 美女cb高潮喷水在线观看| 日韩人妻高清精品专区| 久久久国产成人精品二区| 久久久成人免费电影| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产亚洲最大av| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 午夜福利在线观看吧| 成人毛片a级毛片在线播放| 又爽又黄无遮挡网站| 国产精品一及| a级一级毛片免费在线观看|