長鏈非編碼RNA ReCAL作為腎透明細(xì)胞癌預(yù)后標(biāo)志物和靶向治療反應(yīng)預(yù)測因子的研究

鐘 科，唐富豪，潘 鑫，張征宇

0 引 言

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是最常見的腎癌，2017年在美國確診近63 990例，其中死亡人數(shù)高達(dá)14 400[1]。腎細(xì)胞癌70%以上為腎透明細(xì)胞癌(clear cell RCC，ccRCC)，大部分病例為散發(fā)性[2]。雖然大多數(shù)局限性腎癌患者腫瘤生長緩慢，呈非致死性，但是大約四分之一的患者在部分或根治性腎切除術(shù)后發(fā)生了疾病進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[3-4]。為了區(qū)分惰性腫瘤和侵襲性腫瘤，目前臨床指南主要以腫瘤的大小、分期和分級作為依據(jù)，這些都不包含任何分子生物標(biāo)記物[5-6]。然而，即使是根據(jù)這些臨床指南所定義的低風(fēng)險的患者也可能會發(fā)生疾病進(jìn)展和腫瘤復(fù)發(fā)[7]。一些研究報告了某些特定分子有助于ccRCC的風(fēng)險分層，如ClearCode34和復(fù)發(fā)評分[8-9]，但其臨床應(yīng)用可能太昂貴和復(fù)雜。因此，有必要尋找一種可以準(zhǔn)確有效地對ccRCC患者預(yù)后進(jìn)行分層的新的預(yù)后生物標(biāo)記物。

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs，lncRNAs)已被證實在腫瘤發(fā)展中具有重要作用[10-12]。我們以前對lncRNAs的功能進(jìn)行了廣泛的研究，特別是在ccRCC進(jìn)展和靶向治療抵抗方面[13-15]。近年來，隨著RNA測序的進(jìn)展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量lncRNAs可以作為一類新的預(yù)后生物標(biāo)記物[16-17]。基于ccRCC的這些臨床需要和lncRNAs作為腫瘤生物標(biāo)記物的潛在優(yōu)勢[18]，本研究對來自3個獨(dú)立ccRCC隊列的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以確定與患者預(yù)后相關(guān)的lncRNAs，隨后在多個獨(dú)立的ccRCC隊列中進(jìn)行驗證。

1 材料與方法

1.1 研究設(shè)計本研究遵循腫瘤標(biāo)志物預(yù)后研究(REMARK)標(biāo)準(zhǔn)[19]的報告建議,并得到了所有機(jī)構(gòu)審查委員會的批準(zhǔn)。腫瘤樣本和臨床數(shù)據(jù)是在長海醫(yī)院、長征醫(yī)院、東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)和患者知情同意下獲得[13-15,20-22]。本研究在3個有可用RNA測序數(shù)據(jù)和臨床注釋的ccRCC患者隊列中進(jìn)行：①來自TCGA(癌癥基因組圖譜)數(shù)據(jù)庫(美國隊列)的530個原發(fā)腫瘤和72個匹配的相鄰正常組織[22]，②來自EGA(歐洲基因組表型檔案)數(shù)據(jù)庫(日本隊列)的100個原發(fā)腫瘤[21]，③來自ICGC(國際癌癥基因組聯(lián)盟)數(shù)據(jù)庫(歐洲隊列)的91個原發(fā)腫瘤和45個匹配的鄰近正常組織[20]，具體流程見圖1。驗證研究在多中心隊列中進(jìn)行，包括來自長海醫(yī)院的1326例ccRCC患者、來自長征醫(yī)院的353例ccRCC患者和來自東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院的229例ccRCC患者。在驗證隊列中連續(xù)采集了從2004年到2012年的組織樣本。這些隊列包括有臨床病理特征和隨訪資料的患者，中位隨訪時間為96個月。

圖1 腎透明細(xì)胞癌患者隊列的研究流程圖

1.2 方法開發(fā)一種綜合數(shù)據(jù)挖掘策略來識別3個篩選隊列中的預(yù)測候選lncRNA：為了確定ccRCC中高度可靠的預(yù)后lncRNA，對3個研究隊列[①來自TCGA數(shù)據(jù)庫(美國隊列，中位隨訪40個月)，②來自EGA數(shù)據(jù)庫(EGAS0001000509，日本隊列，中位隨訪50.5個月)，③來自ICGC數(shù)據(jù)庫(歐洲隊列，中位隨訪58.9個月)] 進(jìn)行研究，獲得準(zhǔn)確的lncRNA注釋集，篩選出基因組定位中與蛋白質(zhì)編碼基因重疊的lncRNAs(GENCODE版本19注釋)，并對7070個lncRNAs進(jìn)行分析。然后，考慮在每個隊列中至少80%的樣本中表達(dá)值大于零的lncRNAs用于下游分析。對所選lncRNA的預(yù)后價值進(jìn)行驗證：為了驗證ReCAL評估患者預(yù)后的能力，使用RNA原位雜交技術(shù)(RNA scope)檢測長海隊列(n=1326)、長征隊列(n=353)和東總隊列(n=229)三家獨(dú)立醫(yī)院1908例ccRCC患者ReCAL的表達(dá)。進(jìn)一步評估在用Mayo Clinic SSIGN評分分層的患者中ReCAL的評估預(yù)后能力。對98例接受舒尼替尼或索拉非尼治療的患者進(jìn)行l(wèi)ncRNA表達(dá)與臨床預(yù)后的關(guān)系分析。主要臨床終點(diǎn)是總生存期(overall survival，OS)。采用單變量和多變量Cox回歸、Kaplan-Meier曲線評估lncRNA表達(dá)與臨床終點(diǎn)的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 16.0軟件(SPSS Inc., USA)進(jìn)行統(tǒng)計分析。以頻率和百分比描述患者的臨床病理特征。用χ2檢驗或Fisher精確檢驗估計ReCAL表達(dá)水平與臨床變量的相關(guān)性。t檢驗用于檢驗兩組間的ReCAL表達(dá)差異。用Kaplan-Meier方法估計事件發(fā)生的時間，用log-rank檢驗評估患者特征之間的比較。應(yīng)用多變量Cox比例風(fēng)險模型來評估有意義和無意義的預(yù)測協(xié)變量對總生存期(overall survival，OS)的影響，并在Cox模型中報告風(fēng)險比(hazard ratios，HR)[23-26]。使用Kaplan-Meier生存曲線來評估Cox回歸模型中風(fēng)險的占比。所有統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 多數(shù)據(jù)集分析證實長鏈非編碼RNA ReCAL是ccRCC的預(yù)后生物標(biāo)志物每個數(shù)據(jù)集中得到大約1695個lncRNAs。在研究隊列中，單變量Cox回歸分析顯示，29個lncRNA的表達(dá)與3個隊列的生存率顯著相關(guān)(P<0.05)。接下來，分別以29個lncRNA的表達(dá)中值作為界值將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，并評估2組總體生存期差異。確定了一個獨(dú)特的lncRNA，該基因在RefSeq參考序列數(shù)據(jù)庫中被注釋為LINC01410(集成基因注釋ENSG0000238113)，它顯示了3個隊列和集合隊列中高表達(dá)組和低表達(dá)組之間最顯著的差異生存率，見圖2a-2d。根據(jù)其與ccRCC預(yù)后的關(guān)系，將該基因命名為“與腎癌相關(guān)的LincRNA”(renal cancer associated LincRNA，ReCAL)。多變量Cox回歸分析表明，高表達(dá)ReCAL是ccRCC患者預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測因素(美國隊列：HR：1.420，95%CI：1.040～1.939，P=0.027；日本隊列：HR：3.658，95%CI：1.457～9.181；P=0.006；歐洲隊列：HR：1.630，95%CI：0.732～3.630；P=0.232),見表1。此外，探討連續(xù)的ReCAL表達(dá)與OS的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，在所有3個隊列中，隨著ReCAL表達(dá)的增加，低OS的風(fēng)險呈線性增長(美國隊列：HR：1.736；95%CI：1.416～2.129；P=1.141E-7；日本隊列：HR：1.711；95%CI：1.161～2.522；P=0.007；歐洲隊列：HR：2.257；95%CI：1.105～4.609；P=0.025),見表1。

2.2 通過多隊列研究驗證了ReCAL評估患者預(yù)后的能力ccRCC腫瘤中ReCAL的代表性染色見圖3a，通過RNA scope和實時熒光定量PCR(qRT-PCR)結(jié)果的比較，證實了ReCAL探針的特異性，見圖3b。以中位數(shù)為界將ReCAL的表達(dá)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。在所有3個驗證隊列和集合隊列中，與低表達(dá)組的患者相比，ReCAL高表達(dá)組的患者預(yù)后較差，見圖2e-2h。多變量Cox回歸分析顯示，在這些隊列中高ReCAL表達(dá)與較短OS獨(dú)立相關(guān)(長海隊列：HR：2.180，95%CI：1.775～2.678，P=1.111E-13；長征隊列：HR：2.735，95%CI：1.747～4.280，P=1.076E-5；東總隊列：HR：2.113，95%CI：1.270～3.514，P=0.004),見表1。此外，當(dāng)建模為連續(xù)變量時，發(fā)現(xiàn)隨著ReCAL表達(dá)增加，低OS風(fēng)險呈線性增長(長海隊列：HR：3.391，95%CI：2.741～4.386，P=1.344E-14；長征隊列：HR：2.473，95%CI：1.062～3.251，P=0.044；東總隊列：HR：2.409，95%CI：1.097～3.210，P=0.037),見表1。

2.3 ReCAL在低危Mayo Clinic SSIGN評分腎透明細(xì)胞癌患者中尤其具有預(yù)后價值ReCAL評估預(yù)后的能力在低風(fēng)險患者(SSIGN評分0～3)中最為明顯，在中等風(fēng)險患者(SSIGN評分4～7)中則較小，而在高風(fēng)險患者(SSIGN評分>8)中最小，見圖4。長海、長征和東總隊列中高ReCAL表達(dá)的低風(fēng)險患者發(fā)生ccRCC特異性死亡的可能性分別為低ReCAL表達(dá)組的5.854倍、8.15倍和3.091倍(95%CI：3.799～9.020，P=1.142E-15；95%CI：2.420～27.450，P=0.001；95%CI：1.458～6.555，P=0.003)，見表2。中等風(fēng)險患者中，長海隊列ReCAL高表達(dá)的患者發(fā)生ccRCC特異性死亡的可能性是低ReCAL表達(dá)組的1.408倍(95%CI：1.055～1.879，P=0.02)，而在其他兩個隊列中無顯著相關(guān)性。在高風(fēng)險患者中ReCAL的表達(dá)與ccRCC特異性死亡無顯著相關(guān)性。

表1 研究隊列和驗證隊列中腎透明細(xì)胞癌患者總體生存率相關(guān)因素的單變量和多變量分析

a：美國隊列；b：日本隊列；c：歐洲隊列；d：聯(lián)合研究隊列；e：長海隊列；f：長征隊列；g：東總隊列；h：聯(lián)合驗證隊列圖2 長鏈非編碼RNAReCAL在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)對3個研究隊列和3個驗證隊列總生存率的生存曲線

a:長鏈非編碼RNA ReCAL的代表性染色；b:RNA scope和qRT-PCR結(jié)果圖3 腎透明細(xì)胞癌患者腫瘤中長鏈非編碼RNA ReCAL的表達(dá)

2.4 長鏈非編碼RNA ReCAL表達(dá)與靶向治療反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)與匹配的鄰近正常組織相比，ReCAL在腫瘤中的表達(dá)顯著上調(diào),見圖5。此外，與原發(fā)腫瘤相比，ReCAL在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移腫瘤中的表達(dá)較高(P=0.048)，見圖6a。探討ReCAL是否可以作為評估靶向治療反應(yīng)的生物標(biāo)記物時發(fā)現(xiàn)，與對新輔助舒尼替尼治療有良好反應(yīng)的患者相比，ReCAL在舒尼替尼治療后復(fù)發(fā)的腎癌組織中富集(P=0.034)，見圖6b。為了確定接受靶向治療的ccRCC患者的ReCAL表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系，對先前報道的兩組患者[13-15]進(jìn)行評估發(fā)現(xiàn)，舒尼替尼或索拉非尼治療對所有ccRCC患者無進(jìn)展生存期的改善能力有限，而與對照組相比，低ReCAL表達(dá)的患者在接受靶向治療后預(yù)后較好，高ReCAL表達(dá)的患者對靶向治療反應(yīng)不佳，見圖7。這些結(jié)果提示ReCAL可以作為ccRCC患者評估靶向治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物。

表2 不同Mayo Clinic SSIGN 評分患者的ReCAL表達(dá)對總生存期(OS)和無進(jìn)展生存期(PFS)的分析

a、b、c:長海隊列；d、e、f：長征隊列；g、h、i：東總隊列圖4 3個驗證隊列不同Mayo Clinic SSIGN(分期、大小、分級和壞死)評分患者的ReCAL表達(dá)對總體生存率的生存曲線

a: 美國隊列；b:歐洲隊列；c:長海隊列圖5 ReCAL表達(dá)在腫瘤中與匹配的鄰近正常組織比較

a:復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移腫瘤中與原發(fā)腫瘤比較；b:舒尼替尼治療后復(fù)發(fā)的患者腎癌組織中與對新輔助舒尼替尼治療有良好反應(yīng)的患者腎癌組織比較圖6 在不同分組的組織中長鏈非編碼RNA ReCAL的表達(dá)

a、b、c：有或無舒尼替尼治療的ccRCC患者無進(jìn)展生存期的生存曲線；d、e、f：有或無索拉非尼治療的ccRCC患者無進(jìn)展生存期的生存曲線圖7 腎透明細(xì)胞癌患者中長鏈非編碼RNA ReCAL表達(dá)與靶向治療反應(yīng)的關(guān)系

3 討 論

本研究證實了一種之前未報道的lncRNA，命名為ReCAL，其高表達(dá)與ccRCC患者的不良預(yù)后相關(guān)。值得注意的是，ReCAL評估預(yù)后的能力在低風(fēng)險患者(SSIGN評分0～3)中最為明顯。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)ReCAL可以作為靶向治療反應(yīng)的獨(dú)立預(yù)測因子。雖然以往的研究已經(jīng)推薦了幾種用于ccRCC風(fēng)險分層的分子生物標(biāo)記物，以及傳統(tǒng)的臨床病理參數(shù)，但是這些作為檢測預(yù)后的可靠生物標(biāo)記物的能力不足，并且這些研究大多集中于晚期ccRCC[27]。本研究確定并驗證了lncRNAReCAL，它在6個獨(dú)立的ccRCC患者隊列中顯示出顯著的預(yù)后價值，表明了ReCAL在臨床應(yīng)用中的重要作用。

對于ccRCC患者的分層，ReCAL比經(jīng)典的腫瘤分期和分級指標(biāo)更能反映ccRCC復(fù)發(fā)風(fēng)險。患者常常對術(shù)后可能發(fā)生轉(zhuǎn)移性疾病感到不安，即使術(shù)后發(fā)生轉(zhuǎn)移的風(fēng)險很低。然而，大多數(shù)患者由于缺乏任何可以有效降低復(fù)發(fā)風(fēng)險并最終保持健康的指導(dǎo)方針而惡化，例如早期發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性疾病的生物標(biāo)志物和有效的治療方案。在本研究分層分析中，ReCAL主要在根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)臨床病理指標(biāo)SSIGN評分被歸類為低風(fēng)險的患者中表現(xiàn)出對評估預(yù)后的高效率。

三分之一被診斷為區(qū)域性或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的ccRCC患者需要強(qiáng)化治療，如靶向治療[28]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抑制劑或雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路是晚期ccRCC患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方案[29]。然而，10%～20%的晚期ccRCC患者天生對靶向治療不敏感，其余大多數(shù)患者在治療6～15個月后出現(xiàn)耐藥性和腫瘤進(jìn)展，導(dǎo)致靶向治療未能有效延長ccRCC患者的生存期[30-31]。由于在選擇治療反應(yīng)性患者時缺乏生物標(biāo)記物，靶向治療可能對一部分ccRCC患者有未實現(xiàn)的臨床益處[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，治療前ccRCC腫瘤中ReCAL的高表達(dá)與舒尼替尼和索拉非尼治療反應(yīng)不良顯著相關(guān)，而治療后ReCAL低表達(dá)的患者預(yù)后顯著改善。因此，在決定一個療程之前，最好評估ccRCC腫瘤中ReCAL的表達(dá)，以確定可能受益于靶向治療的患者類型。

總的來說，本研究提供了可靠的證據(jù)，證明ccRCC組織中ReCAL高表達(dá)與惡化臨床結(jié)局的風(fēng)險增加相關(guān)，并且獨(dú)立于多個獨(dú)立隊列中其他已知的病理預(yù)測因子。此外，這種聯(lián)系在低風(fēng)險ccRCC患者中更為明顯。本研究的發(fā)現(xiàn)揭示了ReCAL可以作為ccRCC評估預(yù)后的生物標(biāo)記物，可能有助于個體化治療方案的有效制訂，改善患者的治療和預(yù)后。