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    泊洛沙姆188復驗后再使用研究

    2021-08-11 03:52:23張存超胡瀟予任鵬丞
    上海醫(yī)藥 2021年13期
    關(guān)鍵詞:細胞培養(yǎng)

    張存超 胡瀟予 任鵬丞

    摘 要 目的:研究泊洛沙姆188復驗期后放置時間對其品質(zhì)和細胞培養(yǎng)的影響,為泊洛沙姆188復驗期的確定提供依據(jù)。方法:分別對復驗期后6個月、24個月和36個月的泊洛沙姆188進行pH、內(nèi)毒素含量測定、拉曼鑒別和細胞培養(yǎng)測試,評估其作為培養(yǎng)基組分對細胞生長和重組蛋白表達的影響。結(jié)果:泊洛沙姆188在復驗期后36個月以內(nèi)的pH、內(nèi)毒素含量和拉曼鑒別符合標準,使用復驗期后24個月以內(nèi)的泊洛沙姆188對細胞生長、活率和表達量與復驗期內(nèi)的無顯著差異,但使用復驗期后36個月的泊洛沙姆188細胞生長和活率及重組蛋白表達量均降低。結(jié)論:泊洛沙姆188用于無血清培養(yǎng)基組分時,復驗期建議為24個月。

    關(guān)鍵詞 泊洛沙姆188 細胞培養(yǎng) 無血清培養(yǎng)基 復驗

    中圖分類號:TQ460.4 文獻標志碼:A 文章編號:1006-1533(2021)13-0077-04

    Study on retest period of poloxamer 188

    ZHANG Cunchao, HU Xiaoyu, REN Pengcheng

    (Shanghai Sinomab Biotechnology Co., Ltd., Shanghai 201203, China)

    ABSTRACT Objective: To study the effect of Poloxamer 188 after the retest period on its quality and cell culture. Methods: The determination of pH, endotoxin content and cell culture and the identification of Raman spectra to poloxamer 188 at 6, 24 and 36 months after the retest period were performed to evaluate its effects on cell growth and recombinant protein expression as a medium component. Results: The pH, endotoxin content and Raman identification of poloxamer 188 within 36 months after the retest period met the related standards. Poloxamer 188 within 24 months after retest date showed no differences in cell growth and viability and the protein expression compared with one within retest date, however, those indicators were all decreased when poloxamer 188 stored for 36 months after retest date was used. Conclusion: The retest period of poloxamer 188 is suggested to be 24 months after retest date as a component for serum free medium.

    KEy WORDS poloxamer 188; cell culture test; serum free medium; retest

    無血清培養(yǎng)基是重組蛋白生產(chǎn)中的關(guān)鍵原材料,是影響重組蛋白產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量的重要因素。泊洛沙姆188屬聚氧乙烯和聚氧丙烯的聚合物,是一種無血清培養(yǎng)基中常用的原料,用于培養(yǎng)時減輕生物反應器中攪拌對細胞剪切的損傷,通常在常溫條件下保存[1-2]。

    目前,對培養(yǎng)基的原料管理尚未有明確的標準。一方面,可參考藥用原輔料進行管理;另外一方面,培養(yǎng)基有其特殊性,原輔料的檢驗指標并不能指示原料是否對無血清培養(yǎng)基使用效果造成影響。

    物料保存時間一般以有效期或復驗期表示,一般認為有效期后不可再進行檢驗,而復驗期后可根據(jù)檢驗結(jié)果確定是否可繼續(xù)使用,有效期和復驗期的確定一般基于其穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。本研究對其復驗期進行檢查,以確定其作為無血清培養(yǎng)基組分使用時的復驗指標及復驗期,建立適合無血清培養(yǎng)基生產(chǎn)使用的標準。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    泊洛沙姆188購自巴斯夫中國有限公司,批號分別為GNC11021B(復驗期2021-04-19)、WPmL511D(復驗期2019-09-17,超過復驗期6個月)、WPAK527B(復驗期2018-03-08,超過復驗期24個月)、WPYJ536B(復驗期2017-02-08,超過復驗期36個月),保存條件均為常溫;無水葡萄糖(批號201812303)購自山東西王藥業(yè)有限公司,保存條件為常溫;#1-16無血清培養(yǎng)基(自制培養(yǎng)基,不含泊洛沙姆188);CHOM-S03無血清培養(yǎng)基(批號20180903)和CHOM-S04無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)基(批號20180904)由上海邁泰君奧生物技術(shù)有限公司提供,保存在2~8 ℃;葡萄糖測定試劑盒(批號90142002-2)購自上海卓茵醫(yī)療儀器有限公司,保存在2~8 ℃;鱟試劑購自廈門鱟試劑生物科技股份有限公司;其他化學試劑均為市售分析純。

    1379型生物安全柜和ST16R臺式離心機(美國Thermo公司);Multitron Pro振蕩培養(yǎng)箱(瑞士Infors公司);Vi-cell XR細胞活力分析儀(美國貝克曼-庫爾特公司,所用試劑包為上海邁泰君奧生物技術(shù)有限公司自研試劑包);Acquity液相色譜(美國Waters公司);FE28 pH計、ME802電子天平、ReactRaman 785拉曼光譜儀(瑞士梅特勒-托勒多公司);Absolute A Column(2.0 mm×30 mm,填料粒徑30 mm,加萊克公司);Steritop Quick Release-GP一次性杯式濾器(濾膜孔徑0.22 mm,美國Merck公司)。

    1.2 方法

    參考《中國藥典》有關(guān)規(guī)定對泊洛沙姆188進行pH和細菌內(nèi)毒素測定及拉曼光譜鑒別[3]。

    1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基 稱量#1-16無血清培養(yǎng)基干粉22.7 g四份至四個燒杯中,分別添加氫氧化鈉2.5 g和純化水800 mL后攪拌1 h,然后添加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至(7.2±0.1),攪拌1 h。添加碳酸氫鈉2 g,攪拌30 min,用純化水定容至1 L。將不同批號的泊洛沙姆188按1.0 g/L分別加入#1-16中。攪拌30 min后,使用一次性杯式濾器過濾除菌。

    2)中國倉鼠卵巢(CHO)細胞培養(yǎng) 使用RCB-12(表達一種重組單克隆抗體)作為種子細胞,于2~8℃、800×g 離心5 min,離心換液后,取細胞沉淀重懸至上述添加不同泊洛沙姆188的#1-16培養(yǎng)基中,在振蕩培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速為120 r/min,37 ℃,二氧化碳體積分數(shù)為5%)。培養(yǎng)基添加量為50 mL;初始接種密度0.8×106個細胞/mL。從培養(yǎng)第2天開始,每天添加1.5% CHOM-S03和0.15% CHOM-S04補料培養(yǎng)基。添加復驗期內(nèi)泊洛沙姆188的為對照組,添加其余3批過復驗期的泊洛沙姆188的為實驗組。本研究中各實驗條件各設(shè)置3個重復樣品。對照組和實驗組同時進行培養(yǎng)。培養(yǎng)期間,每天使用細胞活力分析儀進行細胞計數(shù)、按葡萄糖測定試劑盒說明書測定葡萄糖濃度,并補加葡萄糖至濃度為3.0 g/L。

    3)表達量測定 培養(yǎng)至第12天結(jié)束,各搖瓶取樣 1.0 mL,按文獻測定表達量[4]。取樣用800×g 離心10 min后,取上清液用加萊克Absolute A Column進行親和層析純化。收集濾過液,在波長280 nm處測定吸光度。

    2 結(jié)果

    2.1 泊洛沙姆188檢測結(jié)果

    結(jié)果顯示,復驗期內(nèi)及復驗期后6~36個月的泊洛沙姆188在拉曼光譜鑒別、pH和細菌內(nèi)毒素方面均符合質(zhì)量標準(表1)。

    2.2 細胞培養(yǎng)

    2.2.1 活細胞密度

    對比培養(yǎng)前期活細胞密度變化可知,加入復驗期后6、24個月的泊洛沙姆188活細胞密度與復驗期內(nèi)泊洛沙姆188無明顯差異;加入復驗期后36個月的泊洛沙姆188活細胞密度從第3天起低于其他實驗組,且第6天最高活細胞密度比對照降低了21.4%。在培養(yǎng)后期(第8天后),隨著補料培養(yǎng)基不斷加入,基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不同復驗期的泊洛沙姆188對細胞生長的影響基本消除(圖1)。總之,復驗期后6、24個月的泊洛沙姆188對細胞密度無顯著影響,但復驗期后36個月的泊洛沙姆188可顯著降低活細胞密度。

    2.2.2 細胞活率

    加入復驗期后不同時間的泊洛沙姆188與復驗期內(nèi)的相比,在細胞培養(yǎng)早期(0~5 d),活率無明顯下降,而第6天開始活率逐漸降低;但與對照相比,細胞活率變化趨勢一致,無明顯差異(圖2)。

    2.2.3 重組蛋白表達量

    與復驗期內(nèi)泊洛沙姆188相比,加入復驗期后6和24個月的泊洛沙姆188,其重組蛋白表達量無顯著差異,但加入復驗期后36個月的泊洛沙姆188,其重組蛋白表達量比對照降低了18.0%(圖3)。

    3 討論

    藥典中對泊洛沙姆188檢測進行了規(guī)定,包括性狀、鑒別和檢查三方面,側(cè)重于檢查方面的要求,包括酸堿度、溶液的澄清度與顏色、氧乙烯、不飽和度、平均分子量及雜質(zhì)等[3]。然而,泊洛沙姆188作為培養(yǎng)基成分添加到培養(yǎng)基中時,還需考慮對細胞生長等的影響,這是藥典標準中所缺失的。本研究填補了藥典在這方面的空缺。

    本研究結(jié)果顯示,泊洛沙姆188常溫放置36個月后,導致細胞培養(yǎng)時活細胞密度降低,這可能在長期放置過程中發(fā)生了在拉曼光譜鑒別中難以反映出的降解,進而導致作為培養(yǎng)基組分時的細胞培養(yǎng)效果下降,這些降解產(chǎn)物或許可通過一些分析手段進行確定[6]。在溶液中,泊洛沙姆188的降解情況取決于溫度、泊洛沙姆188濃度以及緩沖液的組成[7]。根據(jù)阿倫尼烏斯公式(Arrhenius equation,k=Ae(-Ea/RT))[8],溫度降低,反應速率也會降低。因此,泊洛沙姆188作為組分添加到培養(yǎng)基干粉后,其保存溫度由常溫降低至2~8 ℃,反應速率也會發(fā)生一定程度降低,而降低倍數(shù)需經(jīng)實驗確定。本公司對無血清培養(yǎng)基的穩(wěn)定性研究(數(shù)據(jù)未公開)顯示,無血清培養(yǎng)基干粉在2~8 ℃保存2年以上不影響產(chǎn)品質(zhì)量,即泊洛沙姆188作為組分添加到無血清培養(yǎng)基干粉中保存2年以上,其穩(wěn)定性不會有明顯變化。

    本研究中,添加復驗期后36個月泊洛沙姆188時活細胞密度降低,其原因有待進一步驗證。此外,泊洛沙姆188廠家推薦的保存條件為常溫保存,而添加到無血清培養(yǎng)基中之后,作為干粉是2~8 ℃保存。本研究僅對其常溫的穩(wěn)定性進行了研究,然而作為一種組分添加到無血清培養(yǎng)基干粉后是低溫保存的,后續(xù)研究需對低溫放置的影響進行研究。

    本研究是在搖瓶中進行,未直接考察泊洛沙姆188在生物反應器中的抗剪切作用。然而,使用搖瓶在搖床中培養(yǎng)時,搖床的震蕩也是一種剪切力。在本研究中使用搖床的震蕩代替生物反應器中的攪拌進行研究,可為后續(xù)在生物反應器中的進一步研究提供借鑒。

    參考文獻

    [1] 譚文松, 戴干策, 陳志宏, 等. 攪拌生物反應器中雜交瘤細胞生長與破損的初步研究[J]. 生物工程學報, 1996, 12(S1): 190-196.

    [2] 吳剛, 賴潤龍, 張?zhí)畈? 泊洛沙姆188的研究進展[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)生, 2008, 46(12): 48-49.

    [3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2020年版四部[M]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2020: 699-700.

    [4] Jing Y, Zhang C, Fu T, et al. Combination of dextran sulfate and recombinant trypsin on aggregation of Chinese hamster ovary cells[J]. Cytotechnology, 2016, 68(2): 241-248.

    [5] HG/T3935-2007哺乳類動物細胞培養(yǎng)基[EB/OL]. (2007-04-13)[2020-09-27]. http://file4.foodmate.net/foodvip/ biaozhun/2017/zengbu/HGT3935-2007.pdf.

    [6] 段夢茹, 何東升, 孫會敏, 等. 氣相色譜法檢測泊洛沙姆188中環(huán)氧化物雜質(zhì)[J]. 藥學研究, 2020, 39(6): 331-335;340.

    [7] Wang T, Markham A, Thomas SJ, et al. Solution stability of Poloxamer 188 under stress conditions[J]. J Pharm Sci, 2019, 108(3): 1264-1271.

    [8] Porterfield RI, Capone JJ. Application of kinetic models and Arrhenius methods to product stability evaluation[J]. Med Devices Diagn Ind, 1984, 6: 45-50.

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