貴州地區(qū)青貯飼料中天然乳酸菌分離鑒定及優(yōu)良菌株篩選

付 浩， 金 晶， 朱 欣， 李龍興*

（1.貴州省草地技術(shù)試驗推廣站，貴州貴陽550006；2.貴州大學生命科學院，貴州貴陽550025）

近年來，隨著生態(tài)畜牧業(yè)的快速發(fā)展，青貯飼料作為發(fā)展畜牧業(yè)的重要手段之一，越來越受到人們的重視（萬志濤，2020）。青貯飼料的品質(zhì)取決于青貯自然發(fā)酵過程，在厭氧條件下，同型乳酸菌可產(chǎn)生有機酸等代謝產(chǎn)物，有效抑制有害微生物的生長，同時賦予物料良好的風味和質(zhì)地（溫雅俐等，2010），經(jīng)發(fā)酵后的飼料變得松軟，具有芳香的酸味，適口性好，能增強牲畜的食欲，促進動物的消化吸收（汪文忠，2017）。

青貯飼料主要通過原料上附著的乳酸菌等微生物發(fā)酵得來，在發(fā)酵過程中，除了乳酸菌以外，還有其他多種微生物參與發(fā)酵過程，包括促進發(fā)酵的微生物以及引起青貯腐爛的微生物，且不同地區(qū)微生物種類、數(shù)量也相差甚大，形成一個極其復雜的微生物共生體系（張大偉等，2007）。在青貯發(fā)酵過程中，微生物菌落的結(jié)構(gòu)和豐度是動態(tài)變化的，其中乳酸菌等少數(shù)優(yōu)勢菌種對整個種群變化起關鍵作用（楊文琦等，2013）。

目前，對青貯飼料中天然乳酸菌的篩選和應用的研究報道較多（崔棹茗等，2015），通過分離得到的優(yōu)勢乳酸菌應用到青貯飼料中，不僅可以改善青貯飼料品質(zhì)，還可以顯著提高青貯有氧穩(wěn)定性。但有研究發(fā)現(xiàn)，受到區(qū)域性環(huán)境因素的影響，在西藏地區(qū)添加商品用乳酸菌制劑未能較好地改善青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)（王奇等，2015）。因此，掌握原料中乳酸菌群落結(jié)構(gòu)特征和篩選適宜本地區(qū)的優(yōu)勢乳酸菌是改善該地區(qū)青貯飼料發(fā)展品質(zhì)的關鍵。本研究擬對貴州地區(qū)青貯飼料中乳酸菌組成進行系統(tǒng)分析，篩選出優(yōu)勢乳酸菌，掌握其生物學特征，為本地區(qū)的乳酸菌資源在青貯飼料中的應用提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料 青貯原料主要為全株青貯玉米，均來自于貴州不同種植區(qū)域，在乳熟期收割后立即青貯發(fā)酵。樣品在原地切碎后裝入青貯真空袋密封，每個樣品2個重復，帶回實驗室發(fā)酵兩個月后取樣。

1.2 乳酸菌菌株的分離 稱取發(fā)酵后的青貯飼料10 g放入150 mL廣口錐形瓶中，并加入90 mL無菌生理鹽水，密封，放入轉(zhuǎn)速為120 r/min的搖床上，搖動2 h后，添加無菌生理鹽水進行適當稀釋，選取3個適宜梯度涂板GYP平板培養(yǎng)基，每個梯度設置2個平行，37℃下培養(yǎng)20～24 h，從中分離挑選出200株具有黃色透明環(huán)的菌株，接種到MRS平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)2～3 d，再挑選出單株菌落重復劃線培養(yǎng)2次，從而篩選得到純化的單菌株。

1.3 乳酸菌菌株的形態(tài)學鑒定 根據(jù)單株菌落的大小、顏色、光澤、形狀等，選取具有典型的菌株進行革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗。將初步判定為乳酸菌的菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中，在30℃培養(yǎng)24 h后，加入等體積的甘油（40%），-20℃保存。

1.4 菌株16S rRNA序列測定及系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建 按照PCR擴增細菌16S rRNA試劑盒說明進行操作（試劑盒購自TaKaRa公司），將初步判定的乳酸菌接種到MRS液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)12 h后，取培養(yǎng)液各1 mL，在13000 r/min條件下離心10 min，棄上清，沉淀用于DNA提取（Cai等，1998）。PCR選用細菌16S rRNA V3區(qū)通用 引 物，27f：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492r：5'-TACCTTGTTACGACT-3'。PCR反應體系：2×PCR Master Mix 25 μL，引物各2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 20 μL。反應產(chǎn)物的純化按照膠回收試劑盒說明進行操作。用NCBI提供的Blast將所測定菌株的16S rRNA序列與Gen-Bank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫中已知細菌的16S rRNA序列進行比對，查找與測定的基因序列同源性最高的菌種，分析相似性，通過鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（李志忠等，2017；任海偉，2015）。

1.5 乳酸菌篩選及生理生化特征測定 將175株乳酸菌分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)12 h和24 h時測定菌液的OD值和乳酸濃度，篩選出生長速度快、乳酸產(chǎn)量高的10株乳酸菌（DF-12、DF-20、QZ-35、DS-45、DS-69、DS-71、FG-77、FG-85、RH-135和HP-166），其中乳酸濃度利用SBA-40X三通道生物傳感分析儀進行測定（任海偉等，2016）。對10株篩選出的乳酸菌進行革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗和生理生化特征檢測（Higgins等，1994；Nei等，1987）。糖發(fā)酵試驗按照試劑盒說明進行操作（試劑盒購自青島海博生物技術(shù)有限公司）。

1.6 優(yōu)勢乳酸菌生長曲線和產(chǎn)酸速率的測定將進一步篩選出的10株乳酸菌分別接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)，每隔4 h測其OD值和培養(yǎng)液pH，分別繪制出乳酸菌生長曲線和產(chǎn)酸速率曲線（Cai等，1998）。

1.7 耐酸、耐溫乳酸菌的篩選 將優(yōu)勢乳酸菌分別接入不同pH（3.5、4.5、5.5、6.5、7.5）和不同溫度（20、30、40、45、50℃）的MRS液體培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)24 h后測定各組發(fā)酵液的OD值和乳酸濃度。

2 結(jié)果

2.1 青綠秸稈中乳酸菌群落結(jié)構(gòu)特征 在每組樣品的GYP培養(yǎng)基上隨機挑選出具有黃色透明環(huán)的20株菌株，共收集到菌株200株，其中呈現(xiàn)革蘭氏染色陽性和過氧化氫酶陰性的菌株有175株。對175株菌株序列測定結(jié)果經(jīng)NCBI Blast N進行序列比對，分別有88株植物乳桿菌（L.plantarum），占乳酸菌總數(shù)50.3%；35株短乳桿菌（L.brevis），占比20%；22株副干酪乳桿菌（L.paracasei），占比12.6%；10株鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus），占比5.7%；8株戊糖片球菌（P.pentosaceus），占比4.6%；7株布氏乳桿菌（L.buchneri），占比4%；5株羅斯乳桿菌（L.rossiae），占比2.9%。

2.2 乳酸菌的生理生化特征 通過初步篩選出生長速度快、乳酸產(chǎn)量高的10株乳酸菌的生理生化特征見表1。初步判定菌株DS-71和RH-135為片球菌屬（Pediococcus），其他菌株為乳桿菌屬（Lactobacillus）（李志忠等，2017）。10株菌株中，QZ-35、DS-69、FG-85和HP-166均能消耗葡萄糖產(chǎn)生乳酸和氣體，表明它們是異型發(fā)酵乳酸菌，其余6株菌株為同型乳酸菌。

表1 乳酸菌的生理生化特征

通過糖發(fā)酵試驗結(jié)果表明（表2），DF-12能較好的利用葡萄糖產(chǎn)生乳酸，且能發(fā)酵半乳糖、乳糖、甘露醇、七葉苷、纖維二糖、水楊苷、蔗糖、果糖、甘露糖、蜜二糖、山梨醇，可初步認定為副干酪乳桿菌（L.paracasei）（于佳弘等，2017）；DF-20、DS-45、FG-77能利用除木糖、山梨醇、菊糖、馬尿酸和鼠李糖外的其他糖進行發(fā)酵，初步認定為植物乳桿菌（L.plantarum）（Pang等，2017）；QZ-35能發(fā)酵利用半乳糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、棉子糖、果糖、阿拉伯糖和蜜二糖，且為桿菌，初步認定為類布氏乳桿菌（L.parabuchneri）（陶雅等，2017）；DS-69、FG-85能利用半乳糖、阿拉伯糖、果糖、蜜二糖進行發(fā)酵，不能利用其他糖發(fā)酵，初步認定為短乳桿菌（L.brevis）（李志忠等，2017）；DS-71、RH-135可以利用半乳糖、七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、水楊苷、阿拉伯糖、果糖、甘露糖進行發(fā)酵，且為球菌，初步認定為戊糖片球菌（P.pentosaceus）（陶雅等，2017）；HP-166不能利用乳糖、木糖、棉子糖、蜜二糖進行發(fā)酵，初步認定為鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）（關皓等，2017）。

表2 糖發(fā)酵試驗結(jié)果

2.3 乳酸菌的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 通過構(gòu)建10株乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），菌株DF-12與L.paracasei相似度達99%，可鑒定為副干酪乳桿菌；菌株DF-20、DS-45和FG-77與L.plantarum以97%的相似度聚在一支上，可鑒定為植物乳桿菌；菌株QZ-35與L.parabuchneri的親緣關系比其他菌株近，可鑒定為類布氏乳桿菌；DS-69、FG-85與L.brevis以98%的相似度聚在一支上，可鑒定為短乳桿菌；DS-71、RH-135與P.pentosaceus的親緣關系比其他菌株近，可鑒定為戊糖片球菌；HP-166與L.rhamnosus的相似性達99%，可鑒定為鼠李糖乳桿菌。

圖1 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 10株分離乳酸菌生長特性研究 菌株DF-20、DS-69、RH-135和HP-166生長趨勢基本一致（圖2），12～20 h為對數(shù)生長期，發(fā)酵24 h后菌株進入穩(wěn)定生長期。菌株QZ-35、DS-45和DS-71生長速率較慢，20～32 h才進入對數(shù)生長期，40 h后有衰退現(xiàn)象。

圖2 10株乳酸菌的生長曲線

10株乳酸菌在37℃下培養(yǎng)下，其pH變化如圖3所示，所有菌株的初始pH均從6.2開始總體呈下降的趨勢，在3.6～4.0達到穩(wěn)定狀態(tài)，在培養(yǎng)12 h后整體下降的速率最快，32 h后基本上進入穩(wěn)定時期，其中DF-20、DS-69、FG-85、RH-135和HP-166產(chǎn)酸速率最快，36 h左右pH達到3.6。結(jié)合菌株的生長趨勢，初步篩選菌株DF-20、DS-69、RH-135和HP-166作為優(yōu)勢菌株用于進一步的研究。

圖3 10株乳酸菌的產(chǎn)酸曲線

2.5 優(yōu)良乳酸菌耐溫性比較 進一步篩選后的4株優(yōu)良乳酸菌在不同溫度條件下培養(yǎng)的生長情況如圖4，整體上，菌株在30～45℃的培養(yǎng)條件下生長情況較好，乳酸產(chǎn)量較高（圖5），其中生長速率最快的是在30℃條件下培養(yǎng)的HP-166菌株，乳酸產(chǎn)量最高的是在45℃條件下培養(yǎng)的RH-135菌株，達到2314 mg/L；在50℃時4株菌株生長速率較低、乳酸產(chǎn)量也較低，可見高溫（50℃）不利于這4株菌株的生長和乳酸的生成；在20℃時生長速率較快，但乳酸產(chǎn)量較低，說明低溫（20℃）不利于乳酸的生成。4株菌株中，總體上菌株DS-69、RH-135和HP166生長速率較快，乳酸產(chǎn)量也較高，初步判斷菌株DS-69、RH-135和HP166具有一定的耐高溫生長特性。

圖4 乳酸菌在不同溫度時的OD值

圖5 乳酸菌在不同溫度時的乳酸濃度

2.6 優(yōu)良乳酸菌耐酸性比較4株篩選出來的優(yōu)良乳酸菌在不同初始pH條件下的生長和乳酸積累情況如圖6和圖7所示，在pH低于3.5培養(yǎng)條件下，菌株OD值和乳酸產(chǎn)量較低，說明不適合菌株生長繁殖；pH在4.5～7.5，菌株生長速率較快，乳酸產(chǎn)量高，其中pH為6.5時最適合菌株的生長繁殖。4株菌株中，菌株DS-69和RH-135生長速率較快，乳酸產(chǎn)量最高，其中乳酸含量最高的為菌株DS-69，達到1920 mg/L。結(jié)合4株乳酸菌的耐溫性，菌株DS-69和RH-135更具有一定的耐溫性和耐酸性，乳酸生成能力強。

圖6 乳酸菌在不同初始pH時的OD值

圖7 乳酸菌在不同初始pH時的乳酸濃度

3 討論

青貯發(fā)酵過程中有多種微生物參與，受青貯原料來源、環(huán)境溫度、發(fā)酵生化反應過程的影響，微生物群落組成結(jié)構(gòu)和數(shù)量存在著較大的差異（關皓等，2019；黃峰等，2019；陶雅等，2017；Si等，2012）。崔棹茗等（2015）從青藏高原地區(qū)種植的青稞秸稈發(fā)酵的青貯飼料中分離出乳酸片球菌、戊糖片球菌、植物乳桿菌等4種生長速率快、耐低溫、產(chǎn)酸能力強的乳酸菌。關皓等（2019）從西南高溫高濕地區(qū)青貯飼料中分離出8種乳酸菌，從中篩選出4株生長速率快、耐溫耐酸耐鹽性好、產(chǎn)酸能力強的菌株，其中包括唾液乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等異型發(fā)酵乳酸菌。李志忠等（2017）從玉米秸稈和白菜尾菜混貯料中分離出乳桿菌屬和片球菌屬的12株乳酸菌，從中篩選出2株產(chǎn)酸能力強、耐酸堿、耐高溫特性的菌株。Pang等（2011）從玉米秸稈發(fā)酵的青貯飼料中分離得到短乳桿菌、植物乳桿菌、戊糖乳桿菌等6種乳酸菌。本研究從全株玉米青貯飼料中分離出175株乳酸菌，通過菌株序列測定有7種乳酸菌，其中植物乳桿菌為主要菌種，與已報道的結(jié)果基本一致（關皓等，2019），分離出的鼠李糖乳桿菌和布氏乳桿菌也廣泛存在于貴州地區(qū)的玉米秸稈青貯中（關皓等，2019；董祥，2019）。盡管在蔬菜、面團等里面分離出過羅斯乳桿菌（L.rossiae）（Rio等，2018；De等，2014），但在發(fā)酵秸稈青貯飼料中尚未廣泛報道。

青貯在發(fā)酵過程中，青貯原料附帶的微生物特別是乳酸菌利用水溶性碳水化合物能快速的生長繁殖，不斷產(chǎn)生有機酸，從而導致飼料酸化，抑制有害微生物的生長（關皓等，2019）。因而，青貯飼料中乳酸菌的繁殖速率和產(chǎn)酸能力是青貯發(fā)酵成功的關鍵因素。具有高活性和產(chǎn)酸能力強的乳酸菌不僅能縮短青貯發(fā)酵周期，還能改善青貯營養(yǎng)品質(zhì)（李志忠等，2017）。在實踐中，常通過添加商用乳酸菌制劑等青貯添加劑來促進青貯發(fā)酵進程，提升青貯品質(zhì)（張慶等，2019），因此篩選本土適應性強、生長速率快、產(chǎn)酸能力強的乳酸菌很有必要。本研究中從青貯飼料中初篩得到10株生長速度較快、乳酸產(chǎn)量較高的乳酸菌，整體上在培養(yǎng)12～20 h處于對數(shù)生長期，24 h后進入穩(wěn)定生長期；有機酸含量在培養(yǎng)12 h時開始大量積累，發(fā)酵液最低pH達到3.6，這與于佳弘等（2015）從玉米青貯中分離出的乳酸菌試驗結(jié)果基本一致。

本試驗中，與其他菌株相比，菌株DF-20、DS-69、RH-135和HP-166表現(xiàn)出了生長速率更快、產(chǎn)酸能力更強的特性，通過耐溫性試驗，在45℃及以下的培養(yǎng)條件下，4株菌都有良好的生長繁殖速率和乳酸積累量，說明4株菌具有較好的溫度適應性。青貯飼料發(fā)酵過程中，內(nèi)部溫度可高達40℃，普通菌株生長受限（Bernardes等，2018；Gulfama等，2017；Chen等，2013）。因此，建議在溫度較高地區(qū)使用耐溫乳酸菌作為青貯發(fā)酵添加劑（張慶等，2019），以此提高青貯發(fā)酵品質(zhì)。在耐酸性試驗中，4株菌都能在初始pH為4.5的環(huán)境中較好的生長和乳酸積累，但不同菌株的生長速率和乳酸產(chǎn)量表現(xiàn)出差異性，這與李雪莉等（2017）對篩選獲得的乳酸菌進行耐酸試驗，發(fā)現(xiàn)菌株間的耐酸性差異結(jié)果相似。

根據(jù)本研究的耐溫性耐酸性試驗，DS-69和RH-135菌株具有較強的繁殖速率和產(chǎn)酸能力，與McDonald等（1991）研究提出的理想青貯用乳酸菌添加劑一致。因此，建議結(jié)合DS-69和RH-135菌株的特性，將其制成復合乳酸菌劑應用于高溫地區(qū)青貯飼料發(fā)酵使用。

4 結(jié)論

從玉米秸稈和酒用高粱秸稈混合青貯飼料中共分離出175株乳酸菌，通過16S rRNA測序測定有7種乳酸菌，其中植物乳桿菌為主要菌種，其余為短乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、戊糖片球菌、布氏乳桿菌，以及較少報道的羅斯乳桿菌（L.rossiae）。從中篩選出4株生長速率快、產(chǎn)酸能力強的乳酸菌，分別為植物乳桿菌（DF-20）、短乳桿菌（DS-69）、戊糖片球菌（RH-135）和鼠李糖乳桿菌（HP-166），耐溫耐酸試驗證明，DS-69和RH-135具有較強的高溫適應性和酸性環(huán)境適應性，且產(chǎn)酸能力強，可作為良好的青貯用乳酸菌添加劑應用于實踐生產(chǎn)中。