千草方熏洗對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨的保護作用及相關(guān)機制

李宏軍， 施源， 何敏， 李堅， 王君君， 鄧新超， 魯密，張輝， 吳巖， 吳紅麗， 梁平

（武漢市第八醫(yī)院，湖北武漢430010）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis）屬老年性退行性關(guān)節(jié)疾病，其病理特征除表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨的損傷和損失外，還合并有關(guān)節(jié)下骨的重塑、骨贅形成、韌帶松弛、關(guān)節(jié)周圍肌肉減弱等病變，并在一些病例中存在滑膜炎癥[1]。本課題組前期研究表明，千草方熏洗聯(lián)合關(guān)節(jié)內(nèi)注射透明質(zhì)酸（hyaluronic acid）能夠有效緩解膝骨關(guān)節(jié)炎，降低膝骨關(guān)節(jié)炎的炎癥因子水平，延緩關(guān)節(jié)軟骨的破壞[2-3]，但有關(guān)千草方熏洗治療膝骨關(guān)節(jié)炎的具體機制尚不明確。因此，本研究構(gòu)建了膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型，觀察千草方熏洗對大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎的治療作用及其機制，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物10周齡SPF級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠32只，體質(zhì)量（300~350）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物質(zhì)量合格證號：11401300043471。動物實驗方案通過武漢市第八醫(yī)院動物倫理委員會批準。大鼠飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中，溫度為22~26℃，相對濕度為50%~60%，12 h明暗光源，自由飲水和進食。

1.2 藥物、試劑與儀器千草方組成：千年健30 g、鹿銜草30 g、透骨草20 g、伸筋草20 g、防風(fēng)20 g、木防己20 g、丹參20 g、牛膝20 g。中藥材由武漢市中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供。透明質(zhì)酸鈉購自山東正大福瑞達制藥有限公司（國藥準字H10960136）。米醋（江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司）；白細胞介素6（IL-6）、白細胞介素10（IL-10）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）檢測試劑盒，Masson染色試劑盒均購自Bio-Swamp（中國）；兔抗Ki67、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、磷酸化mTOR（p-mTOR）、磷酸化糖原合成酶激酶3β（p-GS3Kβ）、細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、β-actin等抗體及小鼠抗糖原合成酶激酶3β（GSK3β）抗體均為英國Abcam公司產(chǎn)品。DHG-9023A恒溫烘箱（上海恒一科學(xué)儀器有限公司）；MD1000光學(xué)顯微鏡（徠卡顯微系統(tǒng)有限公司）；Tanon-5200全自動化學(xué)發(fā)光分析儀（上海天能公司）；352型酶標儀（芬蘭Labsystems Multiskan MS公司）。

1.3 分組與造模適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照隨機數(shù)字表將32只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、千草方組和透明質(zhì)酸鈉組，每組8只。除正常組外，其他3組大鼠采用改良Hulth法[4]建立膝骨關(guān)節(jié)炎模型。造模方法：腹腔注射2 mL/kg戊巴比妥鈉（30 g/L）麻醉大鼠，于無菌條件下切除大鼠右膝內(nèi)側(cè)半月板及內(nèi)側(cè)副韌帶，術(shù)后向大鼠肌內(nèi)注射20 U青霉素以預(yù)防感染，每天1次，連續(xù)3 d。正常組大鼠，不做額外處理。

1.4 給藥千草方組于動物模型制備后，將千草方置于蒸發(fā)器內(nèi)，加水至2~2.5 kg，加米醋50 mL，制成濃度為10%的藥液，接通電源加熱，產(chǎn)生蒸汽，溫度為40~45℃。將患膝（熏洗部位以膝關(guān)節(jié)髕骨為中心，上下各約3 cm）置蒸汽上，每日1次，每次30 min，連續(xù)熏洗30次。透明質(zhì)酸鈉組于動物模型制備后的第1周開始關(guān)節(jié)內(nèi)注射0.4 mL/kg透明質(zhì)酸[2]，其后每周重復(fù)注射1次，共干預(yù)5次。模型組和正常組不給予任何治療處理。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）給藥結(jié)束后，于腹主動脈穿刺取血，收集血清。取40 μL待測樣品于酶標板孔中，分別加入IL-6、IL-10和TNF-α抗體10 μL，輕輕搖晃。每孔加入50 μL酶標試劑，室溫下孵育30 min，洗滌液洗滌5次后，加入顯色試劑混勻，避光顯色10 min，加入50 μL終止液終止反應(yīng)，應(yīng)用酶標儀測定各孔450 nm波長處的吸光度值。根據(jù)標準曲線計算IL-6、IL-10和TNF-α的濃度。

1.5.2 蘇木素-伊紅（HE）染色法將膝關(guān)節(jié)標本置于100 g/L多聚甲醛中固定48 h后，放入20%EDTA液中并于4℃冰箱內(nèi)脫鈣4周，每3 d換脫鈣液1次。然后，進行常規(guī)石蠟包埋和切片。切片脫蠟脫水后進行常規(guī)HE染色。蘇木素染核15 min，流水沖洗，0.5%伊紅染液3 min，流水沖洗。光學(xué)顯微鏡下觀察軟骨組織病理變化，使用Mankin’s法對關(guān)節(jié)軟骨組織損傷進行評分[5-6]。

1.5.3 Masson染色法按照Masson染色試劑盒說明書進行染色。方法：將膝關(guān)節(jié)石蠟切片置于蘇木素三氯化鐵混合液（1∶1）中染色10 min，流水沖洗后，置于麗春紅酸性復(fù)紅液中浸染5~10 min，2%冰醋酸水溶液浸洗，1%磷鉬酸水溶液分化5 min后，將切片放入苯胺藍水溶液染5 min，2%冰醋酸水溶液浸洗。梯級濃度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5.4 免疫組織化學(xué)法取膝關(guān)節(jié)組織石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水后，于65℃恒溫箱中烤片1 h，用0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液高壓修復(fù)15 min，然后加入3%H2O2以消除內(nèi)源性過氧化物酶，滴加一抗Ki67（1∶200）孵育過夜，滴加生物素標記的二抗，滴加二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液，蘇木素復(fù)染3 min，1%鹽酸酒精分化，并于顯微鏡下觀察控制染色程度。常規(guī)脫水，透明，干燥后，于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）法采用放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液提取膝骨關(guān)節(jié)軟骨總蛋白，12 000×g于4℃離心15 min后，取上清液進行蛋白質(zhì)濃度測定。然后用12%的分離膠、5%的濃縮膠進行蛋白質(zhì)電泳，90 V轉(zhuǎn)膜50 min，以50 g/L脫脂奶粉室溫下封閉2 h，洗滌，加入p-Akt（1∶500稀釋），4℃孵育過夜，洗滌，加入對應(yīng)的二抗，室溫孵育2 h后，將膜放置在暗室中，加入電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑顯影，最后將膜置于全自動化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測。Akt（1∶500）、p-mTOR（1∶1 000）、mTOR（1∶2 000）、p-GSK3β（1∶1 000）、GSK3β（1∶1 000）、CyclinD1（1∶10 000）、β-actin（1∶2 500）檢測方法同上。

1.6 統(tǒng)計方法采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清炎癥因子IL-6、IL-10、TNF-α的含量變化比較表1的結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組血清IL-6和TNF-α的含量顯著增加，模型組IL-10的含量顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，千草方組和透明質(zhì)酸組血清IL-6和TNF-α的含量顯著降低（P<0.05），IL-10的含量顯著增加（P<0.05）；但千草方組血清IL-6和TNF-α的含量高于透明質(zhì)酸組（P<0.05），IL-10的含量明顯低于透明質(zhì)酸組（P<0.05）。

表1 各組血清IL-6、IL-10、TNF-α的含量變化比較Table 1 Comparison of the serum contents of IL-6，IL-10，TNF-α in various groups （±s）

表1 各組血清IL-6、IL-10、TNF-α的含量變化比較Table 1 Comparison of the serum contents of IL-6，IL-10，TNF-α in various groups （±s）

①P<0.05，與正常組比較；②P<0.05，與模型組比較；③P<0.05，與透明質(zhì)酸組比較

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2.2 各組軟骨組織形態(tài)學(xué)比較圖1、2結(jié)果顯示：正常組軟骨表面光滑，軟骨基質(zhì)著色均勻，各層細胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，潮線完整。模型組軟骨表面粗糙破損，表層軟骨糜爛、剝落，軟骨基質(zhì)著色不均勻，各層細胞排列紊亂，四層結(jié)構(gòu)不清晰。與模型組比較，千草方組軟骨表面更加光滑，雖然存在著軟骨細胞的減少，結(jié)構(gòu)較清晰，軟骨基質(zhì)著色較均勻。透明質(zhì)酸組的軟骨組織，也存在著軟骨細胞的減少，與模型組比較，結(jié)構(gòu)較為完整和清晰。

圖1 各組軟骨組織HE染色結(jié)果比較（×200）Figure 1 Comparison of HE staining results of cartilage tissue in various groups（×200）

圖2 各組軟骨組織Masson染色結(jié)果比較（×200）Figure 2 Comparison of Masson staining results of cartilage tissue in various groups（×200）

2.3 各組關(guān)節(jié)軟骨組織損傷Mankin’s評分比較表2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組Mankin’s評分值顯著增加（P<0.05）。與模型組比較，千草方組和透明質(zhì)酸組Mankin’s評分值顯著降低（P<0.05）；但千草方組Mankin’s評分值明顯高于透明質(zhì)酸組（P<0.05）。

表2 各組關(guān)節(jié)軟骨組織損傷Mankin’s評分比較Table 2 Comparison of Mankin’s scores for cartilage tissue injury in various groups （±s）

表2 各組關(guān)節(jié)軟骨組織損傷Mankin’s評分比較Table 2 Comparison of Mankin’s scores for cartilage tissue injury in various groups （±s）

①P<0.05，與正常組比較；②P<0.05，與模型組比較；③P<0.05，與透明質(zhì)酸組比較

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2.4 各組軟骨組織Ki67表達比較圖3結(jié)果顯示，模型組軟骨組織Ki67表達量低于正常組（P<0.05），千草方組和透明質(zhì)酸組Ki67的表達量高于模型組（P<0.05），而2個治療組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

圖3 各組軟骨組織Ki67表達比較Figure 3 Comparison of the expression of Ki67 in cartilage tissue of various groups

2.5 各組軟骨組織Akt、mTOR、GSK3β磷酸化水平，CyclinD1蛋白相對表達量比較圖4結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組軟骨組織p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、p-GSK3β/GSK3β和CyclinD1的相對表達量顯著減少（P<0.05）。與模型組比較，千草方組和透明質(zhì)酸組軟骨組織p-Akt/Akt、pmTOR/mTOR、p-GSK3β/GSK3β和CyclinD1的相對表達量均顯著上升（P<0.05）；但千草方組軟骨組織p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、p-GSK3β/GSK3β和CyclinD1的相對表達量顯著低于透明質(zhì)酸組（P<0.05）。

圖4 各組軟骨組織Akt、mTOR、GSK3β磷酸化水平，CyclinD1蛋白相對表達量比較Figure 4 Comparison of the phosphorylated expression levels of Akt，mTOR，GSK3β and relative expression level of CyclinD1 in cartilage tissue of various groups

3 討論

膝骨關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)“痹證”范疇，主要因腎虛復(fù)感風(fēng)、寒、濕邪導(dǎo)致瘀血阻滯關(guān)節(jié)筋絡(luò)發(fā)為本病，其病機主要為腎虛血瘀、經(jīng)絡(luò)痹阻，為“本虛標實”之證。本課題組在治療該病上采用具有散寒祛濕、發(fā)汗解表、疏通膜理、調(diào)和氣血、舒經(jīng)活絡(luò)功效的千草方進行局部薰洗，可達到緩解膝部疼痛、修復(fù)膝關(guān)節(jié)活動功能，抑制退行性變進一步發(fā)展的目的。

膝骨關(guān)節(jié)炎的主要病理表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨變性、脫落和炎性因子沉積[7]。IL-6、IL-10、TNF-α是骨關(guān)節(jié)炎病理過程中介導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨破壞最重要的細胞因子[8]。本研究中HE染色、Markin’s評分和血清IL-6、IL-10和TNF-α的結(jié)果表明，成功構(gòu)建了膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型。經(jīng)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射透明質(zhì)酸或千草方熏洗治療后，軟骨組織結(jié)構(gòu)的破壞和炎性浸潤等病理改變能夠得到緩解。

Ki67是代表細胞增殖的關(guān)鍵基因之一，普遍認為Ki67的表達與細胞增殖呈正相關(guān)[9]。研究[10]發(fā)現(xiàn)，Ki67高表達可促進人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的增殖。還有研究[11]表明，促進Ki67的表達可減少TNF-α、IL-7和IL-23的分泌，從而降低骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟組織損傷和炎癥反應(yīng)。CyclinD1是細胞周期調(diào)控的關(guān)鍵基因，CyclinD1的表達抑制會導(dǎo)致細胞周期的阻滯[12]。本研究結(jié)果顯示，膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠軟骨中Ki67和CyclinD1表達量較正常組明顯下降，經(jīng)千草方熏洗后，軟骨Ki67和CyclinD1表達量較模型組顯著升高，提示千草方能夠降低膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的周期阻滯，促進軟骨組織細胞增殖。

Akt/mTOR信號通路是調(diào)控細胞生長和增殖的關(guān)鍵途徑，對細胞的生長、增殖、存活、凋亡以及血管的生成和自噬等起到十分重要的作用[13]。研究[14-16]表明，Akt/mTOR信號通路與骨關(guān)節(jié)炎關(guān)系密切，激活A(yù)kt/mTOR通路可以減輕關(guān)節(jié)軟骨的炎癥反應(yīng)。有研究[17]結(jié)果顯示，膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨組織Akt和mTOR的表達量顯著高于正常組。而下調(diào)GSK3β可保護軟骨細胞[18]。另外，蛋白質(zhì)磷酸化是生物界最普遍，也是最重要的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾，是一種動態(tài)的生物調(diào)節(jié)過程。蛋白磷酸化與多種生物學(xué)過程如DNA損傷修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號傳導(dǎo)、細胞凋亡的調(diào)節(jié)等密切相關(guān)，是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的機制[19-20]。本研究結(jié)果顯示：模型組軟骨組織Akt、mTOR、GSK3β的磷酸化水平較正常組顯著降低（P<0.05）；經(jīng)千草方熏洗治療后，Akt、mTOR、GSK3β的磷酸化水平較模型組顯著升高（P<0.05）。提示千草方熏洗可能是通過調(diào)節(jié)Akt、mTOR、GSK3β的磷酸化水平發(fā)揮抗膝骨關(guān)節(jié)炎的作用。

綜上所述，千草方熏洗在一定程度上能夠緩解膝骨關(guān)節(jié)炎，其分子機制可能與促進軟骨組織Akt/mTOR信號通路蛋白的活化，進而促進軟骨細胞增殖有關(guān)。