液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食品接觸橡膠密封墊圈中7種抗氧化劑

程 暢，盧立新，2*，潘 嘹，2，盧莉璟，2，陳 曦，2

（1．江南大學(xué) 機(jī)械工程學(xué)院 包裝工程系，江蘇 無(wú)錫 214122；2．江蘇省食品先進(jìn)制造裝備技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

食品接觸橡膠密封墊圈常用作食品加工機(jī)械中管道連接處的密封件，以保證食品加工機(jī)械系統(tǒng)的密封性?？寡趸瘎┳鳛橄鹉z材料中常用的一類添加劑用以減緩材料老化降解，延長(zhǎng)其使用壽命［1］。然而，在橡膠密封墊圈與食品接觸過(guò)程中，抗氧化劑有遷移到食品中的風(fēng)險(xiǎn)，不僅會(huì)對(duì)食品品質(zhì)產(chǎn)生影響，還可能危害人體健康［2］。GB 9685－2016《食品接觸材料及制品用添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》［3］附表A．3對(duì)食品接觸橡膠材料及制品中允許使用的抗氧化劑提出了限量要求。因此，建立食品接觸橡膠密封墊圈中抗氧化劑的檢測(cè)方法對(duì)于食品接觸橡膠材料及制品中抗氧化劑的監(jiān)管具有重要意義。

目前食品塑料包裝材料中抗氧化劑的檢測(cè)研究較為常見(jiàn)，檢測(cè)方法主要有液相色譜法［4－5］、氣相色譜法［6－7］、氣相色譜－質(zhì)譜法［8－9］、液相色譜－質(zhì)譜法［10－11］等，前處理方法主要有索氏提取法（SE）［12］、回流提取法［13］、快速溶劑萃取法（ASE）［14］、微波輔助提取法（MAE）［15－16］、超臨界流體萃取法（SFE）［17］以及超聲萃取法（UE）［18－19］等，而針對(duì)食品接觸橡膠材料及制品中抗氧化劑的檢測(cè)研究相對(duì)缺乏。胡光輝等［20］采用直接回流結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定了橡膠食品輸送管中的抗氧化劑2246，方法檢出限為2 mg/kg；李支薇等［21］以甲醇超聲提取，建立了氣相色譜－質(zhì)譜測(cè)定塑膠制品中抗氧劑TBM－6、AO425、AO2246的分析方法，儀器檢出限分別為0．005 8、0．006 5、0．002 4 mg/L。但現(xiàn)有研究存在可同時(shí)檢測(cè)的抗氧化劑種類少、檢測(cè)效率較低、檢出限偏高、精確度較低等問(wèn)題。

本研究對(duì)色譜柱、質(zhì)譜條件、樣品及萃取液前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，建立了液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定食品接觸橡膠密封墊圈中抗氧化劑ZKF、抗氧化劑259、抗氧化劑1035、抗氧化劑425、抗氧化劑2246、抗氧化劑1520、抗氧化劑565的方法，可滿足7種目標(biāo)物的檢測(cè)需求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

橡膠材料：橡膠陽(yáng)性樣品由無(wú)錫奇制橡膠設(shè)計(jì)工作室制作；市售樣品購(gòu)自沃爾頂密封技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

甲醇、丙酮（色譜級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；抗氧化劑ZKF（純度97%）、抗氧化劑1035（96%）、抗氧化劑425（98%）購(gòu)于薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司，抗氧化劑259（97%）購(gòu)于上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司，抗氧化劑2246（97%）、抗氧化劑565（95%）購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，抗氧化劑1520（97%）購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確稱取適量7種抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)品，以甲醇配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；用甲醇逐級(jí)稀釋得到7種抗氧化劑質(zhì)量濃度分別為0．01、0．02、0．05、0．1、0．2、0．5 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于4℃冰箱中冷藏，待測(cè)。

1.2 儀器

TSQ quantum Ultra EMR三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；優(yōu)柯浦AFX-1002-U超純水儀（渝欽實(shí)業(yè)（上海）有限公司）；HWS-12電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；BILON-W-1000微波萃取儀（上海比朗儀器制造有限公司）；KQ-300DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Cryomill全自動(dòng)冷凍研磨機(jī)（德國(guó)萊馳公司）。

1.3 檢測(cè)條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2．1 mm，1．7μm）；柱溫：45℃；流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為乙酸銨水溶液（5 mmol/L）；流速：0．3 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：276 nm；進(jìn)樣量：5μL。梯度洗脫程序：0～2 min，20%A；2～4 min，20%～90%A；4～4．5 min，90%～99%A；4．5～11．5 min，99%A；11．5～12 min，99%～20%A；12～15 min，20%A。

1.3.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源；離子模式：正、負(fù)離子模式；選擇反應(yīng)掃描模式（SRM）；毛細(xì)管溫度：350℃；輔助氣加熱溫度：50℃。7種抗氧化劑的母離子、子離子、碰撞能量以及保留時(shí)間見(jiàn)表1。

表1 7種抗氧化劑的母離子、子離子、碰撞能量、離子模式和保留時(shí)間Table 1 Parent ions，daughter ions，collision energies，polarity and retention times of 7 antioxidants

1.4 樣品前處理

將樣品剪成長(zhǎng)度不超過(guò)15 mm的小片。取適量樣品于50 mL冷凍研磨罐中，并放入研磨球，對(duì)樣品進(jìn)行冷凍粉碎，冷凍研磨程序中預(yù)冷時(shí)間為2．5 min，研磨時(shí)間為5 min。

準(zhǔn)確稱取橡膠粉末0．5 g（精確至0．001 g）于玻璃瓶中，加入10 mL甲醇，密封后在50℃下微波萃取15 min，收集萃取液于25 mL容量瓶中，用5 mL甲醇淋洗橡膠粉末2次，將淋洗液合并至容量瓶中，用甲醇定容。取適量萃取液于離心管中，以16 000 r/min離心5 min，重復(fù)離心1次后，取上清液待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

分別考察了Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2．1 mm，1．7μm）、Agilent C18Eclipse plus（100 mm×3．0 mm，3．5μm）和SunFire C8（250 mm×4．6 mm，5μm）3種色譜柱對(duì)7種抗氧化劑的分離效果。結(jié)果表明，使用SunFire C8色譜柱時(shí)，抗氧化劑259和抗氧化劑ZKF的保留時(shí)間較短且無(wú)法完全分離，這可能是由于C8柱的碳鏈短，對(duì)弱極性或非極性物質(zhì)的保留較差；另2種色譜柱的碳鏈更長(zhǎng)，對(duì)弱極性或非極性物質(zhì)的保留更好。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用Agilent C18Eclipse plus柱進(jìn)行分離時(shí)，部分抗氧化劑的色譜峰拖尾，而將色譜柱更換為Acquity UPLC BEH C18后，采用不同通道分離得到的7種抗氧化劑峰形對(duì)稱，原因可能是Acquity UPLC BEH C18柱的粒徑更小，柱效較高。因此選擇Acquity UPLC BEH C18色譜柱進(jìn)行分離。7種抗氧化劑的選擇離子流圖見(jiàn)圖1。

圖1 7種抗氧化劑的選擇離子流圖Fig．1 Selective ion current diagrams of 7 antioxidants

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別在正、負(fù)離子模式下對(duì)7種抗氧化劑的單標(biāo)溶液進(jìn)行全掃描，結(jié)果表明抗氧化劑ZKF、抗氧化劑259、抗氧化劑1035、抗氧化劑425、抗氧化劑2246和抗氧化劑1520在負(fù)離子模式下的響應(yīng)值較大、峰形較好，而抗氧化劑565則在正離子模式下的響應(yīng)值較大、峰形較好，故除抗氧化劑565采用正離子模式檢測(cè)外，其余6種抗氧化劑均采用負(fù)離子模式檢測(cè)。而后根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜對(duì)子離子對(duì)以及碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，7種抗氧化劑的最佳質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見(jiàn)表1。

2.3 前處理方法的優(yōu)化

2.3.1 樣品前處理方法的優(yōu)化 使用7種抗氧化劑添加量均為0．1%的橡膠陽(yáng)性樣品，比較超聲萃取、回流萃取和微波萃取3種萃取方法以及甲醇、丙酮2種萃取溶劑對(duì)7種抗氧化劑的萃取效果。其中，超聲萃取條件為50℃、300 W下處理40 min；回流萃取條件為65℃下處理1 h；微波萃取條件見(jiàn)“1．4”。每種萃取方法平行制樣3份。

結(jié)果顯示，以丙酮為萃取溶劑時(shí)，3種方法的萃取回收率相差不大?；亓鬏腿〉妮腿』厥章氏鄬?duì)偏低，超聲萃取和微波萃取的萃取回收率較為相近，但超聲萃取時(shí)間為40 min，而微波萃取僅需15 min，萃取效率較高。以甲醇為萃取溶劑時(shí)，微波萃取對(duì)7種抗氧化劑的萃取回收率均明顯高于其他兩種萃取方式。因此，綜合考慮萃取回收率和萃取效率，選擇微波萃取對(duì)樣品進(jìn)行前處理。

另外，以丙酮為萃取溶劑時(shí)，3種萃取方法下7種抗氧化劑的萃取回收率均低于50%。而以甲醇為萃取溶劑時(shí)，3種萃取方法下7種抗氧化劑的萃取回收率均明顯提高，尤其在微波萃取條件下，除抗氧化劑2246和425外，其余抗氧化劑的萃取回收率均達(dá)到70%以上，其中抗氧化劑565的萃取回收率由20．9%提高至82．0%。這可能是由于丙酮的溶解能力較強(qiáng)，當(dāng)萃取溶液溫度恢復(fù)至室溫后，溶解在丙酮中的橡膠低聚物包裹目標(biāo)抗氧化劑析出形成絮狀物所致，且檢測(cè)時(shí)存在的溶劑效應(yīng)會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。因此，選擇甲醇作為萃取溶劑。

2.3.2 萃取液前處理方法的優(yōu)化 研究表明微濾膜對(duì)部分有機(jī)物存在吸附效應(yīng)，在萃取液過(guò)濾過(guò)程中可能會(huì)降低分析物的濃度，從而影響檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性［22］。分別采用疏水性尼龍濾膜（0．22μm）、親水性PTFE濾膜（0．22μm）、疏水性PVDF濾膜（0．22μm）、高速離心4種方式處理0．02 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后上機(jī)檢測(cè)，以確定合適的萃取液前處理方法。由圖2可知，與高速離心法相比，經(jīng)3種濾膜過(guò)濾后，部分抗氧化劑的濃度下降明顯，表明3種濾膜均對(duì)目標(biāo)抗氧化劑存在較強(qiáng)的吸附作用。因此實(shí)驗(yàn)選擇高速離心法對(duì)萃取液進(jìn)行前處理。

圖2 不同萃取液前處理方法下7種抗氧化劑的檢測(cè)濃度Fig．2 The detected concentration of 7 antioxidants with different pretreatment methods of extraction solution

2.4 線性關(guān)系、檢出限與定量下限

按照“1．1”配制7種目標(biāo)抗氧化劑的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在優(yōu)化條件下上機(jī)檢測(cè)，以各目標(biāo)抗氧化劑的峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)（y），以相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，mg/L）作標(biāo)準(zhǔn)曲線。并以3倍信噪比和10倍信噪比分別確定7種抗氧化劑的儀器檢出限（LOD）和儀器定量下限（LOQ）；選取陰性橡膠樣品進(jìn)行加標(biāo)，采用“1．4”方法前處理后上機(jī)檢測(cè)，確定7種抗氧化劑的方法檢出限（MLOD）和方法定量下限（MLOQ）。表2結(jié)果表明，7種抗氧化劑在0．01～0．5 mg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0．999；LOD、LOQ、MLOD、MLOQ分別為0．003～0．083μg/L、0．01～0．25μg/L、0．005～0．125 mg/kg和0．02～0．40 mg/kg。

表2 7種抗氧化劑的線性關(guān)系、儀器檢出限、儀器定量下限、方法檢出限與方法定量下限Table 2 Linear relations，LOD，LOQ，MLOD and MLOQ of 7 antioxidants

2.5 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

選取不含目標(biāo)抗氧化劑的橡膠材料作為陰性樣品，進(jìn)行高（25 mg/kg）、中（5．0 mg/kg）、低（2．5 mg/kg）3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，各濃度下做6次平行實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)表3）。結(jié)果表明，7種抗氧化劑的平均回收率為73．1%～120%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0．70%～9．3%，方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

表3 7種抗氧化劑的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of the 7 antioxidants（n=6）

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用本方法檢測(cè)8種市售食品接觸橡膠密封墊圈樣品。結(jié)果顯示，市售樣品中檢出了抗氧化劑259、抗氧化劑425、抗氧化劑1520和抗氧化劑2246，其余抗氧化劑均未檢出。其中，有5種樣品檢出抗氧化劑1520，檢出量為1．000～631．0 mg/kg；8種樣品檢出抗氧化劑2246，檢出量為141．0～295．0 mg/kg；1種樣品檢出抗氧化劑259和抗氧化劑425，檢出量分別為0．700、1．550 mg/kg。各種樣品中抗氧化劑的殘留量均符合GB 9685－2016附表A．3中對(duì)目標(biāo)物的安全使用要求。

3 結(jié) 論

本文建立了微波萃取結(jié)合液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定食品接觸橡膠密封墊圈中抗氧劑ZKF、抗氧化劑259、抗氧化劑1035、抗氧化劑425、抗氧化劑2246、抗氧化劑1520、抗氧化劑565的方法。通過(guò)對(duì)色譜柱、質(zhì)譜條件、樣品以及萃取液前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳檢測(cè)條件。本方法操作簡(jiǎn)單、線性范圍好、靈敏度高、快速準(zhǔn)確，為食品接觸橡膠材料及制品中抗氧化劑的檢測(cè)和安全使用提供了依據(jù)。