QuEChERS/超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法檢測果酒中14種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑

黃笑晨，李 昆，李 朔，郭愛靜，王 可，*，楊莉麗

（1．河北師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050024；2．石家莊市疾病預(yù)防控制中心 石家莊市化學(xué)毒物檢測及風(fēng)險預(yù)警技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050011）

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑是一類以天然抗生素Strobilurin A為先導(dǎo)化合物開發(fā)的新型殺菌劑，其通過抑制細(xì)胞色素b和細(xì)胞色素C1之間的電子傳遞，阻礙菌類的線粒體呼吸，抑制三磷酸腺苷（ATP）生成，從而達(dá)到殺菌作用［1－2］。該類殺菌劑能有效防治子囊菌、擔(dān)子菌、半知菌和卵菌等真菌引起的病害，因具有低毒、廣譜、高效等特點，被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中［3］。自1996年上市以來，甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑已開發(fā)了十幾個品種，并于2014年以37．43億美元的銷售額成為全球第一大殺菌劑［4］。然而研究表明，嘧菌酯、啶氧菌酯和氟嘧菌酯在施藥后易進(jìn)入土壤中沉積，不易降解，對土壤生態(tài)環(huán)境造成潛在威脅［5－7］。該類殺菌劑還可通過地表徑流、滲透作用等對水體環(huán)境造成污染，導(dǎo)致水生生物繁殖力下降并有致畸性［8－11］。因此，該類殺菌劑對人體健康的潛在危害不容忽視。

在果蔬的生產(chǎn)過程中，常施用大量殺菌劑保證產(chǎn)量和品質(zhì)，殺菌劑殘留不可避免地會對果蔬制品（如果酒）造成污染，進(jìn)而通過人們的攝入在體內(nèi)累積，對人類健康產(chǎn)生不良影響。目前，該類殺菌劑的研究對象多見于果蔬、水體和土壤等，關(guān)于果酒中多種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的殘留分析鮮有報道。因此建立果酒中多種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的快速、高效的檢測方法，對于保障食品質(zhì)量安全和人民身體健康具有重要意義。

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的檢測方法主要有氣相色譜法（GC）［12］、氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（GCMS/MS）［13］、高效液相色譜法（HPLC）［14］、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（LC－MS/MS）［15－17］。其中，LC－MS/MS法由于具有定性準(zhǔn)確、靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)等特點，提升了復(fù)雜基質(zhì)中農(nóng)藥多殘留分析的能力，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)獸藥的殘留檢測。王巖松等［18］利用LC－MS/MS法測定了葡萄酒中10種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，但該法采用固相萃取凈化，操作較繁瑣，耗時較長。本研究采用QuEChERS結(jié)合超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC－MS/MS）建立了同時測定果酒中14種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的檢測方法。該方法操作簡便、高效快速、靈敏度高，為果酒中該類殺菌劑的殘留檢測提供了技術(shù)手段。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Exion－TRIPLE QUAD 5500型超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX公司）；AE240電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli－Q超純水機(jī)（美國Millipore公司）；C3 I型臺式離心機(jī)（法國JOUAN公司）；T－460/H超聲清洗器（德國Elma公司）；EVAP－12型氮吹儀（美國Organomation公司）；MS2型渦旋振蕩器（德國IKA公司）。

吡唑醚菌酯、氟嘧菌酯、嘧菌酯、嘧菌胺、烯肟菌酯（100μg/mL，純度99．0%，北京曼哈格生物科技有限公司）；醚菌胺、肟醚菌胺、醚菌酯、啶氧菌酯、Z-苯氧菌胺、E-苯氧菌胺（100μg/mL，純度99．0%，天津阿爾塔科技有限公司）；肟菌酯、烯酰嗎啉、嘧霉胺（純度＞99．0%，Dr．Ehrenstorfer GmbH公司）。甲醇（美國Fisher公司）、乙腈（美國Sigma－Aldrich公司）均為色譜純；N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化碳黑（GCB）（美國Dikma公司）；C18（40～50μm，美國Welch公司）；無水硫酸鎂、氯化鈉（分析純，天津永大化學(xué)試劑有限公司）；實驗用水為Milli－Q超純水。果酒樣品（葡萄酒、柚子酒、石榴酒等）購自石家莊市內(nèi)超市。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取適量各標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈定容至10 mL棕色玻璃瓶中，得到1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，避光儲存于－20℃冰箱中。用乙腈逐級稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，配制0．1、0．2、0．5、1．0、2．0、5．0、10．0、20．0、50．0、100．0μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

稱取4 g果酒樣品（精確至0．01 g）于50 mL離心管中，加入8 mL乙腈，渦旋提取60 s，然后加入0．5 g NaCl，渦旋混勻，以4 000 r/min離心5 min，取6 mL上清液加入到含有200 mg C18和600 mg無水MgSO4的15 mL離心管中，渦旋混勻后以8 000 r/min離心5 min。吸取4 mL上清液，在45℃下氮吹濃縮近干，再用1 mL乙腈溶解殘渣，過0．2μm濾膜上機(jī)檢測。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Kinetex F5（3．0 mm×100 mm，2．6μm）；流動相：A為水，B為乙腈；流速：0．3 mL/min；進(jìn)樣量：3μL；柱溫：40℃。梯度洗脫程序：0～4 min，45%B；4～4．1 min，45%～55%B；4．1～5．0 min，55%B；5．0～5．1 min，55%～65%B；5．1～9．5 min，65%B；9．5～9．6 min，65%～45%B；9．6～13．0 min，45%B。

1.4.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI），正離子掃描模式；監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子源電壓：5 500 V；離子源溫度：500℃；氣簾氣（N2）壓力：275．8 kPa；霧化氣（N2）壓力：344．75 kPa；輔助加熱氣（N2）壓力：344．75 kPa。14種殺菌劑的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 14種殺菌劑的色譜保留時間與質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention times and mass spectrometric parameters of 14 fungicides

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

分別配制50 ng/mL的14種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用針泵恒流進(jìn)樣，在正離子模式下，首先利用全掃描模式（Q1 MS）尋找目標(biāo)物的母離子；然后對母離子進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描（Product ion，MS2），選擇2個響應(yīng)信號較強(qiáng)的碎片離子（其中響應(yīng)值高的作為定量離子，另1個選為定性離子）；再將母離子和這2個碎片離子組成檢測離子對，在MRM模式下對每個化合物的去簇電壓（DP）和碰撞能（CE）進(jìn)行優(yōu)化，14種化合物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

考察了乙腈－水和甲醇－水分別為流動相對14種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑分離效果的影響。結(jié)果顯示，乙腈－水作為流動相時的靈敏度高于甲醇－水，峰形較好，響應(yīng)值高，且分離效果好。以乙腈為有機(jī)相，進(jìn)一步考察了分別以純水、0．1%甲酸水溶液、含2 mmol/L乙酸銨的0．1%甲酸水溶液為水相時的分離效果，發(fā)現(xiàn)加入甲酸后14種殺菌劑的峰形雖有改善，但多數(shù)化合物的響應(yīng)受到抑制，此外加入乙酸銨對分離效果的影響較小。綜上，最終選擇乙腈－水為流動相，14種殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)溶液（50μg/L）的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 14種殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)溶液（50μg/L）的總離子流色譜圖Fig．1 Total ion current chromatogram of the 14 fun?gicide standard solution（50μg/L）1．Z-metominostrobin；2．E-metominostrobin；3．dimetho?morph；4．pyrimethanil；5．orysastrobin；6．a(chǎn)zoxystrobin；7．mepanipyrim；8．dimoxystrobin；9．fluoxastrobin；10．kresoxim-methyl；11．picoxystrobin；12．pyraclostrobin；13．trifloxystrobin；14．enestroburin

2.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.3.1 提取條件的優(yōu)化 根據(jù)14種殺菌劑的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，考察了乙腈、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、石油醚作為提取溶劑時的提取效果。結(jié)果表明，以乙腈為提取溶劑時14種殺菌劑的回收率為68%～95%；丙酮、乙酸乙酯和石油醚的提取效果較差，14種殺菌劑的回收率普遍在75%以下；二氯甲烷的密度較大，分層后有機(jī)相在下層，不易吸取，且14種殺菌劑的回收率（63%～93%）略低于乙腈，故選擇乙腈作為提取溶劑。向一定量的空白樣品（加標(biāo)水平為10μg/kg）中分別加入6、8、10、12、14 mL的乙腈，考察了乙腈用量對加標(biāo)回收率的影響。結(jié)果顯示：當(dāng)乙腈用量為8 mL時，14種殺菌劑的回收率較好，均在65%以上；雖然乙腈用量為14 mL的回收率略好于8 mL時，為節(jié)約試劑，最終選擇8 mL乙腈作為提取溶劑。通過比較樣品經(jīng)超聲提取和渦旋提取的效果，發(fā)現(xiàn)渦旋提取的效果優(yōu)于超聲提取。進(jìn)一步對渦旋時間（30、60、90 s）進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)渦旋提取60 s時14種殺菌劑的回收率最好，因此實驗選擇渦旋提取時間為60 s。

2.3.2 凈化條件的優(yōu)化 QuEChERS方法的凈化填料主要包括無水MgSO4、Na2SO4、C18、PSA和GCB等，其中無水MgSO4和Na2SO4為常見的吸水劑。PSA（去除基質(zhì)中的脂肪酸、有機(jī)酸、碳水化合物和少量色素等）、C18（去除非極性和脂肪性物質(zhì)）、GCB（去除色素、甾醇類和非極性干擾物）為常見的吸附劑［19］。分別比較了單獨使用PSA、C18、GCB、無水MgSO4以及PSA+無水MgSO4、C18+無水MgSO4、PSA+C18+無水MgSO4組合使用情況下的凈化效果。實驗發(fā)現(xiàn)，GCB對果酒中色素的去除效果較好，但對待測化合物的吸附較為嚴(yán)重。由圖2可知，PSA的凈化效果比C18差，而C18+無水MgSO4對14種殺菌劑的回收率較其他條件下更好，最終確定C18+無水MgSO4作為凈化劑。

圖2 不同凈化劑對14種殺菌劑回收率的影響Fig．2 Effect of different purificants on the recoveries of 14 fungicides

進(jìn)一步對凈化劑的用量進(jìn)行優(yōu)化，首先固定無水MgSO4的用量為300 mg，考察了C18用量（100、200、300、400 mg）對凈化效果的影響，結(jié)果表明C18用量為200 mg時的凈化效果最好，14種殺菌劑的回收率為71．0%～107%。固定C18用量為200 mg，考察了無水MgSO4用量（300、400、500、600、700 mg）對凈化效果的影響，發(fā)現(xiàn)隨著無水MgSO4用量的增加，14種殺菌劑的回收率不斷提高，但當(dāng)無水MgSO4的用量超過600 mg時，回收率開始下降，故選擇200 mg C18+600 mg無水MgSO4作為凈化劑。與文獻(xiàn)采用的固相萃取法［18］相比，本文優(yōu)化后的QuEChERS法不僅簡便，且各殺菌劑的回收率較好，均在75%以上。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effect，ME）是指基質(zhì)成分和目標(biāo)分析物以外的其他成分對待測物測定值的影響，使用ESI檢測時，基質(zhì)主要影響目標(biāo)化合物的離子化，使其響應(yīng)信號增強(qiáng)或減弱，從而形成基質(zhì)增強(qiáng)或抑制效應(yīng)。采用同一質(zhì)量濃度待測物在基質(zhì)溶液與溶劑中峰面積的比值評價基質(zhì)效應(yīng)［20－21］，ME越接近100%，表明基質(zhì)效應(yīng)越小。將空白樣品按“1．3”方法處理得到基質(zhì)提取溶液，比較了質(zhì)量濃度分別為10、20、50μg/L情況下14種殺菌劑在果酒基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)，14種殺菌劑的ME為80．6%～119%，表明基質(zhì)效應(yīng)較小可忽略，所以采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。與文獻(xiàn)方法［18］相比，本方法消除了氟嘧菌酯和醚菌胺的基質(zhì)效應(yīng)，對果酒基質(zhì)的凈化效果更好。

2.5 線性范圍、檢出限與定量下限

按“1．2”方法配制質(zhì)量濃度為0．1～100．0μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在優(yōu)化條件下進(jìn)行測定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（x，μg/L）為橫坐標(biāo)，目標(biāo)物的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，得到相應(yīng)的線性方程，再分別以3倍信噪比（S/N=3）確定檢出限（LOD），以S/N=10確定定量下限（LOQ）。結(jié)果顯示，14種殺菌劑在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0．999，LOD和LOQ分別為0．002～0．723μg/kg和0．006～2．409μg/kg（表2）。

表2 果酒中14種殺菌劑的線性關(guān)系、檢出限、定量下限、回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Linear relations，LODs，LOQs，recoveries and RSDs of 14 fungicides in fruit wines

2.6 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

取空白果酒樣品，分別在5、10、50μg/kg 3個濃度水平下進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，每個水平平行測定7次，按照本方法進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，14種殺菌劑的平均回收率為71．2%～99．1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0．30%～9．4%（見表2）。

2.7 實際樣品測定

采用本方法對市售的7份葡萄酒和8份水果酒樣品進(jìn)行檢測，其中有6份樣品檢出烯酰嗎啉，5份樣品檢出嘧霉胺，2份樣品檢出嘧菌酯（見表3）。目前，《GB 2763－2019》［22］尚未對果酒中該類殺菌劑的限量進(jìn)行要求，故參照其在對應(yīng)水果中的限量要求（烯酰嗎啉：葡萄為5 mg/kg；嘧霉胺：葡萄、桃為4 mg/kg，柚子為7 mg/kg；嘧菌酯：葡萄為5 mg/kg），所測樣品的檢出值均小于國家限量標(biāo)準(zhǔn)。表明本方法適用于果酒中14種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的殘留檢測。

表3 實際樣品的檢測結(jié)果Table 3 Test results of real samples

3 結(jié) 論

本研究建立了同時檢測果酒中14種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的UPLC－MS/MS方法。實驗對質(zhì)譜條件、色譜條件和樣品前處理條件進(jìn)行了優(yōu)化，并考察了基質(zhì)效應(yīng)的影響。結(jié)果表明，該方法操作簡便、靈敏度高、精密度好、線性關(guān)系良好，適用于果酒中14種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的殘留檢測。