固相萃取/超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定香辛調(diào)料中的曲托喹酚

張海超，王 敬，賈海濤，李 瑋，艾連峰*，康維鈞

（1．石家莊海關(guān)技術(shù)中心，河北 石家莊 050051；2．河北醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院，河北 石家莊 050017）

曲托喹酚是一種天然的芐基異喹啉類生物堿（如圖1），同時也是一種β2受體激動劑，具有罌粟堿的解痙作用，作用與沙丁胺醇相似，強度為異丙腎上腺素的5～10倍［1］，在臨床上常被用作平喘藥治療支氣管哮喘、哮喘樣支氣管炎。自2019年1月起，曲托喹酚被世界反興奮劑機構(gòu)列入了禁藥名單。由于曲托喹酚存在于一些天然產(chǎn)物中［2］，極有可能被運動員誤食而引發(fā)興奮劑檢測陽性事件。我國反興奮劑中心在2019年8月印發(fā)的《大型賽事食源性興奮劑防控工作指南（暫行）》的通知中也將曲托喹酚列入建議檢測化合物清單，明確檢測基質(zhì)為香辛調(diào)料。因此，為杜絕食源性興奮劑事件的發(fā)生，建立香辛調(diào)料中曲托喹酚的檢測技術(shù)，對維護體育運動中的食品安全具有重要意義。

圖1 曲托喹酚的分子結(jié)構(gòu)式Fig．1 Formula structure of tretoquinol

目前關(guān)于曲托喹酚的檢測研究報道極少，僅見Okano等［3］采用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定人體尿液中曲托喹酚的研究，關(guān)于植物源性食品中曲托喹酚的研究未見報道。液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法具有靈敏度高、選擇性好的優(yōu)點，在其他β2受體激動劑檢測技術(shù)上得到了廣泛應用［4－11］。目前關(guān)于β2受體激動劑的前處理方式主要有QuEChERS法［4，6］和固相萃取法［7－10］。由于香辛調(diào)料成分復雜，含有揮發(fā)性油、有機酸、生物堿等多種醇、醛、酮、萜類化合物，采用QuEChERS法會存在凈化不完全。并且有研究報道，PSA、GCB、C18、Florisil等QuEChERS法常用的固相吸附劑對與曲托喹酚性質(zhì)類似的化合物去甲烏藥堿有不同程度的吸附現(xiàn)象［5］。因此本研究結(jié)合曲托喹酚的理化性質(zhì)，在對比兩種固相萃取凈化技術(shù)后，采用MCX柱凈化，超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC－MS/MS）測定了花椒、大料、辣椒、白胡椒、香砂、陳皮、梔子、小茴香、桂皮、孜然、山楂、黑胡椒、香茅草、丁香、香菜籽、千里香、良姜和香葉共18種常見香辛調(diào)料基質(zhì)中的曲托喹酚。該方法簡單、靈敏、普適性強，可為我國體育賽事食品安全保障工作和相關(guān)檢測標準的制定提供技術(shù)支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UPLC 8050超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀（日本Shimadzu公司）；Sigma 3K－15型離心機（美國Sigma公司）；PT2100型均質(zhì)器（瑞士Kinematica公司）；N－EVAP112氮吹儀（美國Organomation公司）；渦旋混合器（美國Scientific Industries公司）；Milli-Q純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2．1 mm×100 mm，1．7μm）；Oasis MCX固相萃取柱、Oasis PRiME HLB固相萃取柱（60 mg，3 mL，美國Waters公司）。

乙腈、甲醇、乙醇（色譜純，德國Merck公司）；甲酸（色譜純，德國Fluka公司）；水為Milli-Q高純水；花椒、大料、辣椒、白胡椒、香砂、陳皮、梔子、小茴香、桂皮、孜然、山楂、黑胡椒、香茅草、丁香、香菜籽、千里香、良姜和香葉均從市場上隨機抽取。

100μg/mL曲托喹酚（First Standard品牌標準品）購于天津阿爾塔科技有限公司。

1.2 標準溶液的配制

準確移取曲托喹酚標準品1 mL，用甲醇稀釋，配置成質(zhì)量濃度為1．0μg/mL的標準溶液，于-18℃下避光保存。在實驗過程中根據(jù)需要精確吸取適量標準溶液用0．1%甲酸－乙腈（9∶1，體積比）稀釋至所需質(zhì)量濃度。

1.3 樣品預處理

準確稱取2 g樣品（精確到0．01 g）于50 mL塑料離心管中，加入20 mL 0．2%甲酸乙醇，于均質(zhì)器上以10 000 r/min均質(zhì)1 min。以10 000 r/min離心5 min，取適量上清液過濾膜待凈化。

將MCX固相萃取柱分別采用3 mL甲醇和3 mL水活化，取上述2 mL上清液于固相萃取柱上，待樣液流出，采用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，最后用4 mL 5%氨水甲醇洗脫，接收洗脫液于40℃下氮吹至干，用1 mL 0．1%甲酸－乙腈（9∶1）渦旋溶解殘渣，過0．22μm有機濾膜后供UPLC－MS/MS測試。

1.4 儀器分析條件

色譜條件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2．1 mm×100 mm，1．7μm）；流動相：含0．1%甲酸的水溶液（A）和乙腈（B）；流速：0．4 mL/min；柱溫：35℃；進樣量：5μL；梯度洗脫程序：0～0．5 min，10%B；0．5～4 min，10%～90%B；4～5 min，90%B；5～5．01 min，90%～10%B；5．01～7 min，10%B。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源ESI（+），采用多反應監(jiān)測（MRM）模式。離子源溫度為350℃，毛細管溫度為250℃，加熱模塊溫度為350℃，氮氣流速：3．0 L/min，干燥氣流速：10．0 L/min，加熱氣流速：10．0 L/min。MRM監(jiān)測離子對的質(zhì)荷比（m/z）分別為346．3、164．2和346．3、137．0，碰撞能量分別為19 eV和45 eV，Q1電壓分別為15 V和15 V，Q3電壓分別為15 V和25 V，其中m/z346．3、164．2為定量離子對。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶液的選擇

提取溶液的選擇以提取更多的目標化合物和更少的雜質(zhì)為目的。本研究以曲托喹酚的回收率和基質(zhì)標準溶液的響應值作為判斷標準，在空白樣品中添加50μg/kg曲托喹酚標準溶液作為模擬樣品進行考察。曲托喹酚屬于一種芐基異喹啉類生物堿，其油水分配系數(shù)（logP）為2．23，解離常數(shù)（pKa）為9．53，水溶性較強，故采用酸性極性溶劑更有利于曲托喹酚的提取。本實驗對比了0．2%甲酸乙醇、0．2%甲酸乙腈、0．2%甲酸水－甲醇（1∶9），0．2%甲酸水－甲醇（9∶1）4種提取溶劑的提取效果。結(jié)果顯示，0．2%甲酸水－甲醇（9∶1）的提取回收率約70%，0．2%甲酸乙腈的提取回收率為80%～90%，0．2%甲酸乙醇和0．2%甲酸水－甲醇（1∶9）的提取回收率均在95%以上，且以0．2%甲酸乙醇的提取液響應值更高。

考慮到水和提取溶劑間極性的差異，樣品中含水量的不同可能會影響曲托喹酚的提取效率，本實驗對樣品中含水量的影響進行了考察。以花椒基質(zhì)樣品為例，向樣品中加適量水浸泡，模擬不同含水量的實際樣品，并采用20 mL含0．2%甲酸的乙醇溶液進行提取，考察曲托喹酚的提取效率。結(jié)果表明，樣品中含水量的上升會導致雜質(zhì)提取較多，引起曲托喹酚提取率的降低，考慮到香辛調(diào)料一般為干樣，故在提取過程中，選擇不加水浸泡直接采用含0．2%甲酸的乙醇溶液提取。

2.2 固相萃取凈化的選擇

香辛調(diào)料基質(zhì)的成分復雜多樣，需采取固相萃取凈化方式以降低背景干擾，減少基質(zhì)效應。由于曲托喹酚在酸性條件下易形成陽離子。本研究對比了兩種固相萃取柱Oasis MCX和Oasis PRiME HLB對花椒、辣椒、桂皮、孜然和小茴香5種基質(zhì)的凈化效果。結(jié)果表明采用PRiME HLB時，曲托喹酚的回收率為54%～125%，而采用MCX柱的回收率為71%～115%。且PRiME HLB固相萃取柱表現(xiàn)出更強的基質(zhì)效應。分析原因可能是PRiME HLB含有特定比例的親水基和疏水基，對生物堿和基質(zhì)雜質(zhì)均有一定保留能力，專屬性差，不能有效去除基質(zhì)干擾；而MCX柱為將磺酸基鍵合在高度交聯(lián)的聚苯乙烯/二乙烯苯（PS/DVB）表面得到的混合型陽離子吸附劑，具有反相和強陽離子交換雙重保留性能，對堿性物質(zhì)有良好的選擇性和靈敏度。因此，MCX柱對香辛調(diào)料中的曲托喹酚表現(xiàn)出了更優(yōu)越的凈化性能。

2.3 檢測條件的優(yōu)化

采用不接分析柱的方式向質(zhì)譜系統(tǒng)注入1μL 1μg/mL標準溶液，在正離子模式下進行全掃描，確定分子離子峰，再以待測物分子離子峰為母離子，對其進行子離子掃描。選擇兩個特征離子164．2和137．2，然后優(yōu)化出最佳碰撞能量CE和Q1、Q3電壓，最終確定多反應監(jiān)測的離子對及碰撞能量（見“1．4”）。

選擇Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2．1 mm×100 mm，1．7μm）對曲托喹酚進行分離，比較了流動相以0．1%甲酸水溶液或水作為水相（A）、甲醇或乙腈作為有機相（B）時的分離效果。結(jié)果表明，乙腈和甲醇對目標物的靈敏度影響不大，但乙腈作為有機相時峰形更為尖銳。進一步考察流動相中添加不同含量甲酸對化合物的影響。結(jié)果顯示，未加甲酸時，曲托喹酚的響應值最高，但峰形展寬嚴重；加入0．1%甲酸后，峰形尖銳，但化合物的峰面積降低約20%；繼續(xù)加大甲酸濃度，實驗結(jié)果無變化。綜合考慮，本實驗選擇0．1%甲酸水-乙腈作為流動相。由于定溶液對化合物在色譜柱上峰形存在影響，高比例有機相溶劑易導致色譜峰出現(xiàn)溶劑效應，通過實驗比較，采用0．1%甲酸水-乙腈（9∶1）定容，可保證化合物峰形良好且保留時間穩(wěn)定。圖2為優(yōu)化條件下0．5 ng/mL曲托喹酚標準溶液的定量離子色譜圖。

圖2 0．5 ng/mL曲托喹酚標準溶液的定量離子色譜圖Fig．2 Chromatogram of quantitative daughter ion of 0．5 ng/mL tretoquinol standard solution

2.4 基質(zhì)效應

采用5 ng/mL基質(zhì)標準溶液與5 ng/mL溶劑標準溶液分別進樣3針，將峰面積平均響應值進行比較，利用以下公式評價基質(zhì)效應的影響［12］：基質(zhì)效應（ME）=（B/A），其中：B為樣品基質(zhì)中添加相同含量曲托喹酚的響應值；A為相同含量標準溶液的響應值；ME>1，說明存在基質(zhì)增強效應；ME<1，說明存在基質(zhì)減弱效應。實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)MCX柱凈化后基質(zhì)效應的影響明顯減弱，比如白胡椒凈化前基質(zhì)效應為0．08，凈化后基質(zhì)效應為0．86，相差近10倍。但經(jīng)凈化后各基質(zhì)表現(xiàn)的基質(zhì)效應不同（見圖3）。為保證定量結(jié)果的準確性，實驗采用空白基質(zhì)溶液對定量結(jié)果進行校正。

圖3 曲托喹酚的基質(zhì)效應Fig．3 Matrix effect of tretoquinol

2.5 線性關(guān)系、檢出限與定量下限

取標準溶液適量，用花椒、大料、辣椒、白胡椒、香砂、陳皮、梔子、小茴香、桂皮、孜然、山楂、黑胡椒、香茅草、丁香、香菜籽、千里香、良姜和香葉18種空白基質(zhì)溶液分別配制成0．1、0．2、0．5、1、5、20、50 ng/mL標準工作液，在“1．4”條件下依次測定。以各組分的峰面積為縱坐標（y），對應的質(zhì)量濃度為橫坐標（x，ng/mL）進行線性分析。結(jié)果顯示，各基質(zhì)中的曲托喹酚均在0．1～50 ng/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）為0．998 5～0．999 9。在空白樣品中添加低濃度的標準溶液，按“1．3”步驟進行樣品前處理后進樣測定，以信噪比S/N≥3和S/N≥10確定各基質(zhì)的檢出限（LOD）均為0．2μg/kg，定量下限（LOQ）均為0．5μg/kg。方法適用于曲托喹酚的定量分析。

2.6 準確度與精密度

在優(yōu)化條件下，用空白樣品進行加標回收和精密度實驗，在18種香辛調(diào)料中添加0．5、2、10、100μg/kg 4個不同質(zhì)量濃度的標準溶液后，按本方法進行加標回收率實驗，每個水平平行測定6次，測得曲托喹酚的回收率為74．5%～98．8%，相對標準偏差（RSD）為3．1%～9．1%（見表1）。方法具有較好的準確度和精密度。

表1 方法的加標回收率及相對標準偏差（n=6）Table 1 Spiked recovery and RSD of the method（n=6）

2.7 實際樣品的分析

采用本方法對隨機在市場上購買的十三香、五香粉、燒烤粉、孜然粉、蒜香粉、麻辣粉共20份樣品進行測定，均未發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果。

3 結(jié) 論

本研究采用酸性乙醇提取，MCX固相萃取柱凈化，以超高效液相色譜－串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法建立了香辛調(diào)料中曲托喹酚的檢測方法。結(jié)果表明，方法的檢出限（LOD）為0．2μg/kg，定量下限（LOQ）為0．5μg/kg，平均回收率為74．5%～98．8%，相對標準偏差（RSD）為3．1%～9．1%。此方法簡單、快速，普適性強、靈敏度高。該方法的建立可為體育賽事香辛調(diào)料中曲托喹酚的分析提供技術(shù)參考。