青海省小麥種質(zhì)資源抗條銹鑒定和抗病基因篩選

張小娟，侯萬(wàn)偉

(1.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院, 省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 青海 西寧 810016；2.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院, 青海 西寧 810016)

【研究意義】小麥條銹病是由小麥條銹菌引起的世界性小麥病害之一，該病害喜低溫和冷涼環(huán)境下，且在小麥的整個(gè)生育期均可被感染。該病菌可通過(guò)氣流高空遠(yuǎn)距離傳播，隨降雨或結(jié)露侵染小麥引發(fā)病害，具有突發(fā)性強(qiáng)，發(fā)病范圍廣，流行頻率高，危害嚴(yán)重，損失慘重，傳染速度快等特點(diǎn)[1]?；瘜W(xué)農(nóng)藥的大面積使用可有效控制小麥條銹病的蔓延，但是耗時(shí)耗力，且對(duì)生態(tài)環(huán)境會(huì)造成一定的污染[2]。實(shí)踐證明，選育和利用抗病品種是防治小麥條銹病最有效、經(jīng)濟(jì)、安全的措施[3-5]。由于小麥條銹菌群體毒性結(jié)構(gòu)復(fù)雜且易變異，自然狀態(tài)下新的毒性小種不斷形成，同種抗病基因使用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易導(dǎo)致抗病基因“喪失”抗病性，使小麥群體抗病遺傳多樣性變低，最終使得小麥條銹病呈周期性流行。對(duì)于怎樣有效且高效解決抗病性“喪失”這一大世界難題，有關(guān)的專家學(xué)者利用慢銹性[6]，持久抗性[7]等，其主要目的是豐富抗病基因種類和對(duì)其合理實(shí)施布局?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前已經(jīng)命名的抗條銹病基因有80多個(gè)(Yr1～Yr80)和很多暫命名的基因[8-9]。這些已公布的小麥抗條銹病基因主要有為小種?；娜诳剐曰?，少部分是成株期抗性基因或高溫成株期抗性基因。前期為選育和利用抗病基因，董淑靜等[10]對(duì)河南的43個(gè)品種進(jìn)行了抗條銹病基因的分子檢測(cè)；周新力等[11]對(duì)國(guó)外春小麥的80份種質(zhì)資源的小麥抗條銹性病做了分子鑒定；萬(wàn)江華等[12]對(duì)108份小麥品種抗條銹病基因進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)；韓德俊等[13]對(duì)1980份小麥地方品種和國(guó)外種質(zhì)進(jìn)行了抗病性鑒定；袁飛敏等[14]對(duì)197份青海小麥品種(系)進(jìn)行了抗病性基因分子鑒定。青海省是我國(guó)小麥條銹菌的主要越夏流行區(qū)之一，每年擁有大量的小麥條銹病越夏菌源，主要以晚熟春小麥為主。由于青海省內(nèi)種植的春小麥主要以感病品種阿勃為主，這為我國(guó)小麥條銹病越夏菌源區(qū)的區(qū)域治理造成非常不利的局面。不斷發(fā)掘新的抗條銹病基因并合理利用是青海省抗病育種的重要基礎(chǔ)，是抑制我國(guó)小麥條銹病菌越夏的重要手段。因此本研究擬利用對(duì)當(dāng)前條銹菌流行小種CYR32、CYR33、CYR34對(duì)95份青海省小麥品種進(jìn)行苗期、成株期抗病性鑒定，綜合衡量其抗病性。同時(shí)利用已有的分子標(biāo)記(Yr5、Yr9、Yr10、Yrl5、Yr17、Yr18和Yr26)進(jìn)行分子檢測(cè)，并結(jié)合系譜分析推測(cè)可能的抗條銹病基因?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】青海省的小麥主栽品種將對(duì)不斷產(chǎn)生的變異的毒性小種沒(méi)有抗病性或喪失一定的抗病性最終導(dǎo)致小麥糧食產(chǎn)量下降，青海也面臨抗病基因抗性“喪失”的問(wèn)題?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)青海省當(dāng)?shù)匦←溒贩N抗病性鑒定及分子檢測(cè)，分析其可能的抗病基因，同時(shí)研究及分析青海省主要種植區(qū)的小麥品種抗條銹病基因的(或抗源)分布利用現(xiàn)狀，從而挖掘出新的抗病基因或?qū)崿F(xiàn)抗病基因的聚合。此研究為青海省抗條銹病基因的合理利用、小麥品種合理布局和品種推廣有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 小麥材料 參試95份小麥種質(zhì)材料，均由青海省農(nóng)林科學(xué)院種子庫(kù)提供。

1.1.2 條銹菌流行小種 供試的條銹菌生理小種CYR32、CYR33 和 CYR34，均為近些年我國(guó)的流行生理小種均由西北農(nóng)林科技大學(xué)小麥條銹病研究實(shí)驗(yàn)室提供，經(jīng)單胞分離并由鑒別寄主鑒別后，單胞菌系擴(kuò)繁獲得。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 抗條銹病鑒定苗期鑒定 在溫室條件下進(jìn)行，待小麥生長(zhǎng)至二葉完全展開(kāi)，采用抖粉法接種。約 15 d開(kāi)始調(diào)查其反應(yīng)型。反應(yīng)型的讀取參考Line 和 Qayoum[15]的9級(jí)判定標(biāo)準(zhǔn)。依據(jù)劃分標(biāo)準(zhǔn)，劃分抗病類型為0～6 級(jí)，感病類型為7～9。成株期抗條銹病鑒定與2019、2020年采用混合小種接種鑒定。其中，2019年接種混合小種1∶1(CYR32∶CYR33)，2020年接種混合小種 1∶1(CYR32∶CYR34)。反應(yīng)型按照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，分為9個(gè)等級(jí)：0～3 為抗病(R)、4～6為中抗(MR)、7為中感病(MS)、8～9為感病(S)，病情嚴(yán)重度，按照 0、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和 100%的13級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記載。

1.2.2 DNA提取 表型調(diào)查結(jié)束后，采取小麥葉片剪碎置于2 mL離心管中，一份置于-80 ℃保存?zhèn)溆?，另一份用于DNA的提取。DNA 的提取采用DS方法[16-17]，并略作調(diào)整。

1.2.3 抗病基因分子檢測(cè) 經(jīng)過(guò)抗病性的鑒定和篩選，參照文獻(xiàn)，選擇Yr5[18]、Yr9[19]、Yr10[20]、Yr17[21]、Yr15[22]、Yr18[23]、Yr26[24]等抗病基因穩(wěn)定的分子標(biāo)記(表1)，引物送上海生工合成。PCR擴(kuò)增體系為15 μL，其中2×EsTaqMasterMix(Dye)7.5 μL，正反向引物各1 μL，模板DNA 1.5 μL。PCR擴(kuò)增及電泳參照各個(gè)抗病基因的文獻(xiàn)。

表1 相關(guān)基因的分子標(biāo)記

2 結(jié)果與分析

2.1 抗病性鑒定

表2顯示，利用當(dāng)前條銹病流行小種 CYR32 和CYR33 及 CYR34對(duì)供試95 個(gè)青海省小麥品種(系)進(jìn)行苗期、成株期抗病性鑒定。苗期抗條銹性結(jié)果顯示：10份(11%)供試品種(系)對(duì)小種 CYR32 表現(xiàn)為免疫；其余85份(89%)表現(xiàn)為高抗；44 份(46%)參試品種(系)對(duì)小種 CYR33 表現(xiàn)為免疫，其余50份(53%)表現(xiàn)為高抗，1份(1%)表現(xiàn)為中抗；其中3份(3%)參試品種(系)對(duì)小種 CYR34 表現(xiàn)為免疫，11份(12%)參試品種(系)對(duì)小種 CYR34表現(xiàn)為抗病，81份(85%)表現(xiàn)為感病。在參試品種(系)中有 12 份(13%)材料對(duì) CYR32、CYR33 和 CYR34 同時(shí)表現(xiàn)抗病，分別為互助紅、高原602、寧春4號(hào)、吉農(nóng)469、民和853、青春37、寧春26、高原205、民和665、山旱901、互助13號(hào)、高原466。

表2 小麥抗條銹病性鑒定

成株期抗條銹性結(jié)果顯示：2020年相比于2019年，12份小麥品種(13%)抗病性增強(qiáng)；8份(8%)材料仍保持抗性，但抗性在逐漸減弱；74份材料(78%)抗病性在減弱，從抗病逐漸演變?yōu)楦胁　?/p>

2.2 分子檢測(cè)結(jié)果

2.2.1Yr5基因分子檢測(cè) 利用STS7/8標(biāo)記對(duì)所有供試小麥品種進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示含有Yr5基因小麥品種中PCR可擴(kuò)增出一條約 100 bp 的條帶，在不含該抗性基因的小麥品則沒(méi)有該條帶(圖1，表3)，所有供試的青海省小麥材料中共有74份小麥品種檢測(cè)到有Yr5基因占總參試材料的78%(圖8)。

1：高原776；2：高原115；3：吉農(nóng)469；4：墨引1號(hào)；5：阿勃；6：高原338；7：樂(lè)麥6號(hào)；8：張春811；9：曹選5號(hào)；10：40-8；11：新麥繁4；12：蘭考906；13：林農(nóng)20

2.2.2Yr9基因分子檢測(cè) 利用引物H20F/R檢測(cè)小麥品種Yr9基因，含有Yr9基因小麥品種中可擴(kuò)增出一條約 1600 bp 的條帶，不含該抗性基因的小麥品種中則沒(méi)有該條帶(圖2，表3)，有16份材料檢測(cè)到含有Yr9基因占總參試材料的17%(圖8)。

M：DL2000；1：高原158；2：高原506；3：鐵普麥；4：ME-45；5：普冰133；6：楊麥16號(hào)；7：藍(lán)天選系；8：青春41；9：13繁516-2；10：13796；11：13799；12：13繁530；13：青春533；14：青紫1號(hào)；15：蘭天15

2.2.3Yr10基因分子檢測(cè) 利用引物 Yr10F/R 對(duì)Yr10基因進(jìn)行檢測(cè)，含有Yr10基因小麥品種中可擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，不含該抗性基因的材料則沒(méi)有擴(kuò)增出該條帶(圖3，表3)，95份材料有 50份材料可能含有Yr10基因占總參試材料的53%(圖8)。

M：DL2000；1：青春415；2：高原466；3：柴春044；4：新哲9號(hào)；5：高原V028；6：互麥13號(hào)；7：煙福188；8：青春524；9：高原175；10：柴春901；11：青春570:；12：互麥15號(hào)；13：山早901；14：蘭天3號(hào)；15：高原448

2.2.4Yr15基因分子檢測(cè) 利用引物 Xbarc8檢測(cè)Yr15抗性基因，含有該基因品種能擴(kuò)增出約 180 bp 的條帶，不含有該基因品種沒(méi)有擴(kuò)增出條帶(圖4，表3)，含有Yr15材料有 72份占總參試材料的76%(圖8)。

M：DL2000；1：高原158；2：高原506；3：鐵普麥；4：ME-45；6：普冰133；7：楊麥16號(hào)；8：藍(lán)天選系；9：青春41；10：13繁516-2；11；13796；12:13799；13:13繁530；14：青春533；15：青紫1號(hào)；

2.2.5Yr17基因分子檢測(cè) 利用引物 VENTRIUP/LN2檢測(cè)Yr17，含有該基因的材料中可擴(kuò)增出條帶，不含該基因的小麥品種中未擴(kuò)增出條帶(圖5，表3)，本研究所用的小麥品種(系)中檢測(cè)到含有Yr17抗性基因的材料有74份占本研究材料的78%(圖8)。

M：DL2000；1：樂(lè)麥5號(hào)；2：高原776；3：高原115；4：吉農(nóng)469；5：墨引1號(hào)；6：阿勃；7：高原338；8：樂(lè)麥6號(hào)；9：張春811；10：曹選5號(hào)；11：40-8；12：新麥繁4；13：蘭考906；14：林農(nóng)20號(hào)

2.2.6Yr18基因分子檢測(cè) 利用引物對(duì) SLV34F/R檢測(cè)Yr18，含有該基因的材料中可擴(kuò)增出條帶一條248 bp條帶，不含該基因的小麥品種中未擴(kuò)增出條帶(圖6，表3)，本研究所用的小麥品種(系)中檢測(cè)到含有Yr18抗性基因的材料有69份占95份材料的73%(圖8)。

M：DL2000；1：青春415；2：高原466；3：柴春044；4：新哲9號(hào)；5：高原V028；6：互麥13號(hào)；7：煙福188；8：青春524；9：高原175；10：柴春901；11：青春570

M：DL2000；1:高原158；2：高原506；3：鐵普麥；4：ME-45；6：普冰133；7：楊麥16號(hào)；8：藍(lán)天選系；9：青春41；10：13繁516-2；11；13796；12：13799；13：13繁530；14：青春533；15：青紫1號(hào)

圖8 95份小麥品種抗病基因分布圖

2.2.7Yr26基因分子檢測(cè) 利用引物WE173檢測(cè)Yr26基因，檢測(cè)結(jié)果表明，攜帶Yr26基因的品種可以擴(kuò)增出一條約 480和750 bp大小的條帶，不含該抗性基因的品種中未擴(kuò)增出條帶(圖7，表3)，95份小麥品種77份材料檢測(cè)到含有Yr26基因占該實(shí)驗(yàn)材料的81%。

表3 青海省95個(gè)小麥品種Yr基因的分子檢測(cè)

3 討 論

本研究通過(guò)對(duì)來(lái)自青海省95份種質(zhì)資源經(jīng)過(guò)苗期抗條銹病鑒定和分子檢測(cè)方法篩選抗病基因，實(shí)現(xiàn)目前青海省小麥品種的抗條銹性評(píng)價(jià)及明確抗病基因分布情況，對(duì)于控制青海省小麥條銹病流行和抑制我國(guó)小麥條銹病菌越夏具有重要意義。

苗期抗病性檢測(cè)用當(dāng)前條銹病流行小種 CYR32、CYR33、CYR34對(duì)供試95 個(gè)青海省小麥品種(系)進(jìn)行苗期抗病性鑒定發(fā)現(xiàn)，多數(shù)小麥品種含有Yr26基因，對(duì)CYR32和CYR33兩個(gè)小種都有抗病性且抗性極強(qiáng)，而對(duì)CYR34基本沒(méi)有抗性，大多品種表現(xiàn)極易感染；含有Yr9基因的大多品種對(duì)3個(gè)毒性小種均有抗性且抗性強(qiáng)；前人研究發(fā)現(xiàn)Yr5、Yr9、Yr10、Yr17、Yr26具有全生育期抗性且Yr18苗期無(wú)抗性而在成株期具有抗性，進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)果。新的毒性小種CYR34的出現(xiàn)導(dǎo)致含Yr26基因的品種抗病性喪失，而當(dāng)品種中攜帶Yr9基因時(shí)，該品種對(duì)CYR34仍保持抗性。成株期抗條銹性鑒定表明，由于新的毒性小種CYR34的出現(xiàn)導(dǎo)致少部分小麥品種抗病性增強(qiáng)，極少部分材料仍保持抗性，但抗性在逐漸減弱，大部分小麥品種抗病性在減弱，從抗病逐漸演變?yōu)楦胁　?/p>

分子檢測(cè)結(jié)果表明青海省小麥品種對(duì)抗病基因Yr5、Yr10、Yr15、Yr17、Yr18、Yr26使用頻繁，尤其是抗病基因Yr26基因多次使用，在參試品種中所占比例較大，之前已有我國(guó)研究人員對(duì)抗條銹基因Yr26做了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)Yr26對(duì) CYR32、CYR33 兩個(gè)毒性小種均表現(xiàn)為高抗或免疫反應(yīng)[25]，從而使得含Yr26基因的小麥品種得到了大面積的推廣。但是因?yàn)閷?duì)Yr26基因的過(guò)度依賴，導(dǎo)致新的毒性小種 CYR34出現(xiàn)的情況下，大部分小麥品種均“喪失”抗性[26]。本研究中共16份材料含有抗病基因Yr9和其他未知抗病性基因，使用相對(duì)較少，可在后期推廣應(yīng)用，但是為了避免該基因長(zhǎng)期使用后喪失其抗病優(yōu)勢(shì)，可采用多基因組合等方式避免抗病性喪失[27]。

4 結(jié) 論

抗病性鑒定結(jié)果表明，10份供試品種(系)對(duì)小種 CYR32 表現(xiàn)為免疫；其余85份表現(xiàn)為高抗；44 份參試品種(系)對(duì)小種 CYR33 表現(xiàn)為免疫，其余51份表現(xiàn)為高抗或中抗；其中3份參試品種(系)對(duì)小種 CYR34 表現(xiàn)為免疫，11份參試品種(系)表現(xiàn)為抗病，81份表現(xiàn)為感病。在參試品種(系)中有 12 份材料對(duì) CYR32、CYR33 和 CYR34 同時(shí)表現(xiàn)抗病。成株期抗條銹性結(jié)果顯示：2020年相比于2019年，12份小麥品種(13%)抗病性增強(qiáng)；8份(8%)材料仍保持抗性。分子檢測(cè)結(jié)果顯示，Yr5、Yr10、Yr15、Yr17、Yr18、Yr26使用頻繁，需在后期加大基因的合理布局。