不同抗凍劑對(duì)西伯利亞鱘精子冷凍保存的影響

周 洲，李世凱，趙 飛，陳飛雄，孔 杰

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水產(chǎn)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550025)

【研究意義】精子超低溫冷凍保存技術(shù)對(duì)物種遺傳種質(zhì)資源保護(hù)及苗種生產(chǎn)都具有重要價(jià)值。【前人研究進(jìn)展】目前魚(yú)類(lèi)精子超低溫冷凍保存研究已在日本鱘(Charybdisjaponica)[1]、褐鱒魚(yú)(Caspianbrowntrout)[2]、花鱸(Lateolabraxmaculatus)[3]、虹鱒魚(yú)(Oncorhynchusmykiss)[4]、大西洋鮭(Salmosalar)[5]、大黃魚(yú)(Pseudosciaenacrocea)[6]、真鯛(Pagrosomusmajor)[7]等200多種海淡水魚(yú)類(lèi)中有報(bào)道。國(guó)內(nèi)外對(duì)鱘魚(yú)類(lèi)精子冷凍保存技術(shù)開(kāi)展較多研究的有中華鱘、西伯利亞鱘、史氏鱘、俄羅斯鱘等[8-11]。【本研究切入點(diǎn)】貴州自2012年實(shí)現(xiàn)鱘魚(yú)全人工繁育以來(lái)，受到雌雄魚(yú)性腺成熟不同步或地理分布不同產(chǎn)生的生殖隔離導(dǎo)致鱘魚(yú)繁殖成功率不高。因此，有必要開(kāi)展貴州鱘魚(yú)精子冷凍保存研究，以提高人工繁殖技術(shù)及保存優(yōu)質(zhì)良種資源?？箖鰟┦怯绊懢永鋬霰４娴闹匾蛩豙12-13]，但有關(guān)抗凍劑對(duì)貴州鱘魚(yú)精子冷凍保存效果研究未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究不同抗凍劑對(duì)西伯利亞鱘精子的冷凍保存效果，以期篩選出合適貴州鱘魚(yú)精子的超低溫冷凍保存抗凍劑。

1 材料與方法

1.1 精子采集及活力檢測(cè)

1.1.1 精子采集 2019年4-5月，在貴州省水產(chǎn)研究所惠水養(yǎng)殖基地選取性腺發(fā)育成熟的鱘雄魚(yú)[體長(zhǎng)(1.42±0.25)m、體重(15.8±3.5)kg]進(jìn)行人工催產(chǎn)。精子采集時(shí)用干凈的干毛巾擦去體表和生殖孔周?chē)乃旨拔畚铮蒙睇}水洗凈的塑料軟管輕輕插入生殖孔，用手輕輕擠壓腹部使精液自然流出經(jīng)導(dǎo)管流入干凈干燥的50 mL離心管中，放置于4 ℃的冰盒中備用。

1.1.2 精子活力檢測(cè) 用過(guò)濾井水稀釋激活后的精子，在200倍顯微鏡下觀(guān)察精子的運(yùn)動(dòng)情況，并通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)采集相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.2 配制精子抗凍劑

稀釋液參照Glogowski等[14]的方法配制，配方為KCl 0.25 mmol/L、Tris-HCl 10 mmol/L、蔗糖23.4 mmol/L，pH調(diào)到8.5，將相關(guān)試劑定溶于1000 mL蒸餾水中，經(jīng)過(guò)0.2 μm過(guò)濾除菌待用。然后用稀釋液配置10%、15%及20%的甲醇(MeOH)、二甲基亞砜(DMSO)分別作為抗凍劑，所有試劑均為分析純，試劑配好后放置在4 ℃的冰箱中備用。

1.3 不同抗凍劑處理鱘魚(yú)精子活力的測(cè)定

將1 mL活力好的鱘魚(yú)精液加入凍存管中，以1∶1的比例加入配制好的抗凍劑，使精子的濃度稀釋1倍，混勻后將凍存管放置于4 ℃冰箱平衡20 min后進(jìn)行液氮冷凍(首先將裝有凍存管的凍存盒置于液氮面以上6 cm處平衡10 min，之后在液氮面2 cm處平衡5 min，最后直接投入液氮中)。解凍時(shí)先將其從凍存盒中取出，迅速放入37 ℃水浴鍋中搖晃解凍，至凍存管中沒(méi)有小冰塊時(shí)停止解凍。用紙巾將凍存管表面的水分擦干，然后用牙簽蘸取少量精液于載玻片上，用吸管滴入1滴過(guò)濾井水涂勻，迅速在顯微鏡下(200×)觀(guān)察精子的活力，利用計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)(computer-aided sperm analysis, CASA)測(cè)定鱘魚(yú)鮮精液活力，篩選精子活力高的抗凍劑。精子活力根據(jù)直線(xiàn)運(yùn)動(dòng)速度分為4個(gè)級(jí)別：A級(jí)精子的直線(xiàn)運(yùn)動(dòng)速度大于25 μm/s，B級(jí)精子的直線(xiàn)運(yùn)動(dòng)速度大于15 μm/s，C級(jí)精子的直線(xiàn)運(yùn)動(dòng)速度大于5 μm/s，D級(jí)精子的直線(xiàn)運(yùn)動(dòng)速度為0～5 μm/s。

1.4 不同抗凍劑處理鱘魚(yú)精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)的測(cè)定

不同抗凍劑凍存的精子經(jīng)解凍后，用牙簽分別蘸取少量精液于載玻片上，用吸管滴入1滴過(guò)濾井水涂勻后，利用計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)分別檢測(cè)精子的運(yùn)動(dòng)參數(shù)，主要包括平均曲線(xiàn)運(yùn)動(dòng)速度(curvilinear velocity, VCL)、平均直線(xiàn)運(yùn)動(dòng)速度(straight line velocity, VSL)、平均路徑速度(average path velocity, VAP)、精子頭側(cè)擺幅度(amplitude of lateral head displacement, ALH)、運(yùn)動(dòng)的直線(xiàn)性(linearity, LIN)、運(yùn)動(dòng)的擺動(dòng)性(wobble, WOB)、運(yùn)動(dòng)的前向性(straightness, STR)、精子平均鞭打頻率(beat cross frequency, BCF)及平均移動(dòng)角度(motion average degree，MAD)。同時(shí)測(cè)定鱘魚(yú)鮮精液的運(yùn)動(dòng)參數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS19.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析檢驗(yàn)各試驗(yàn)組精子活力的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 鱘魚(yú)精子的活力

從表1看出，鱘魚(yú)鮮精A+B級(jí)活力精子占93.04%，其中A級(jí)精子占58.50%。濃度為10%、15%及20% MeOH保存的精子解凍后，A級(jí)活力精子占比均為0，B級(jí)低于5%，C級(jí)在9.34%～13.91%，而D級(jí)最高，在80.78%～88.39%；整體比較，以15% MeOH保存的精子活力較高。濃度為10% DMSO保存的精子解凍后，D級(jí)活力精子占比最高，為60.2%，其次是C級(jí)，為35.13%,B級(jí)僅占4.67%，而A級(jí)活力精子占比為0；濃度為15% DMSO保存的精子解凍后，D級(jí)活力精子占比最高，為30.26%，A級(jí)和C級(jí)相差不大，分別為25.37%和24.91%,B級(jí)最低，為19.46%；濃度為20% DMSO保存的精子解凍后，D級(jí)活力精子占比最高，為43.14%，其次是C級(jí)，為27.45%，A級(jí)居第3，B級(jí)最低，僅占9.8%；整體比較，以15% DMSO保存的精子活力較高。2種抗凍劑相比，不同濃度MeOH保存的A+B級(jí)活力精子僅占0～5.31%，平均3.62%；15%DMSO保存的A+B級(jí)活力精子占4.67%～44.83%，平均26.30%。表明，DMSO保存的精子活力遠(yuǎn)高于MeOH保存的精子。

表1 2種抗凍劑不同濃度處理精子不同活力等級(jí)占比

2.2 鱘魚(yú)精子的運(yùn)動(dòng)參數(shù)

從表2看出，不同抗凍劑處理中，鱘魚(yú)精子的運(yùn)動(dòng)參數(shù)DMSO顯著或極顯著高于MeOH。DMSO不同濃度處理中，10%DMSO處理鱘魚(yú)精子的運(yùn)動(dòng)參數(shù)各指標(biāo)均顯著低于15%DMSO處理和20%DMSO處理。運(yùn)動(dòng)參數(shù)各指標(biāo)中，VCL、VSL、VAP、BCF和MAD均以15%DMSO處理最高，分別為24.33 μm/s、13.48 μm/s、22.16 μm/s、12.03 Hz和22.92°，差異均不顯著；ALH、LIN、WOB和SRT均以20%DMSO處理最高，分別為4.09 μm、61.56%、92.31%和66.69%、高于處理，而則低于20%DMSO處理，但差異均不顯著。綜合比較2種抗凍劑處理精子的運(yùn)動(dòng)參數(shù)，以15%DMSO處理的效果較好。

表2 2種抗凍劑不同濃度處理精子的運(yùn)動(dòng)參數(shù)

3 討 論

精子的運(yùn)動(dòng)特性是判斷精液質(zhì)量的綜合指標(biāo)，與其受精能力密切相關(guān)，在魚(yú)類(lèi)的生產(chǎn)應(yīng)用及生殖研究方面具有重要的意義。而由于魚(yú)類(lèi)精子激活后運(yùn)動(dòng)速度較快，且持續(xù)時(shí)間不長(zhǎng)，使得常規(guī)檢測(cè)方法誤差較大，計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)(CASA)是建立在顯微攝像基礎(chǔ)上的計(jì)算機(jī)精子運(yùn)動(dòng)圖像處理的自動(dòng)分析系統(tǒng)[15-16]，此系統(tǒng)能夠快速準(zhǔn)確地測(cè)定精子的密度、活率、活力等運(yùn)動(dòng)參數(shù)，可避免傳統(tǒng)的顯微觀(guān)察分析方法因檢測(cè)者的個(gè)人主觀(guān)因素造成檢測(cè)結(jié)果的誤差，重復(fù)性好。如柳凌等[17]利用計(jì)算機(jī)輔助分析幾種鱘魚(yú)凍精激活液對(duì)精子活力參數(shù)的影響；劉清華等[18]運(yùn)用計(jì)算機(jī)輔助分析檢測(cè)超低溫保存的真鯛精子質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助分析對(duì)西伯利亞鱘魚(yú)鮮精及幾種不同抗凍劑保存后的精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)進(jìn)行測(cè)定。

鱘魚(yú)鮮精經(jīng)過(guò)濾井水激活后，精子的壽命僅有100s左右，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，鱘魚(yú)精子的運(yùn)動(dòng)速度逐漸變慢，這和胡家會(huì)等[19]研究文昌魚(yú)精子的運(yùn)動(dòng)特征相類(lèi)似。鱘魚(yú)鮮精的VCL為30.31 μm/s,VSL為13.08 μm/s，這與柳凌等[17]利用計(jì)算機(jī)輔助對(duì)西伯利亞鱘凍精激活(10 mmol/L Tris)后精子的VCL為112.96 μm/s,VSL為65.61 μm/s有較大差異[17]，這在一定程度上解釋了實(shí)驗(yàn)所在苗種基地鱘魚(yú)人工繁育試驗(yàn)受精率長(zhǎng)期維持在50%左右的原因，因?yàn)榫舆\(yùn)動(dòng)速度的快慢直接影響精子的受精率，速度小則減少了精子與卵子接觸的機(jī)會(huì)。

抗凍劑MeOH 和DMSO被廣泛應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)精子的超低溫冷凍保存中[1-7,20]。在已經(jīng)報(bào)道的鱘魚(yú)精子保存研究中，MeOH 和DMSO都可以作為抗凍劑，但是從精子解凍后的活力來(lái)看，MeOH要比DMSO好[8,11]。研究結(jié)果表明，3種濃度的MeOH抗凍劑精子激活后A級(jí)精子均為0，且A+B級(jí)精子最高占比僅5.31%。3種濃度的DMSO抗凍劑精子解凍激活后，15%DMSO組A+B級(jí)精子占比為44.83%，效果最好。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定精子的9項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)，根據(jù)研究報(bào)道在鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)[22]、文昌魚(yú)(Branchiostomabelcheritsingtauensis)[19]、湖鱘(Acipenserfulvescens)[22]及大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[23]等魚(yú)類(lèi)中最重要的精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)為VCL和VSL，15%DMSO組精子的VCL和VSL組均大于其他兩組。同時(shí)，15%DMSO組精子的VSL/VCL值為55.40%，大于20%DMSO組精子的VSL/VCL值46.48%，由于VSL/VCL是精子運(yùn)動(dòng)軌跡彎曲程度的最好體現(xiàn)，與精子受精率呈正相關(guān)[24]，這也說(shuō)明了幾種抗凍劑保存效果較好的為15%DMSO?？箖鰟〥MSO的效果優(yōu)于MeOH，一方面這可能與貴州自1999年引進(jìn)鱘魚(yú)親本已有20年的培育，長(zhǎng)期的地理隔離或者培育方式造成精子抗凍劑的不同；另一方面魚(yú)類(lèi)精子超低溫冷凍保存研究與精子的稀釋液、解凍后激活液的成分等因素有關(guān)，下一步將對(duì)西伯利亞鱘精子超低溫精子保存的條件進(jìn)一步優(yōu)化，并開(kāi)展超低溫保存精子解凍后的受精率的研究。

4 結(jié) 論

濃度為10%、15%、20%MeOH作為抗凍劑，精子解凍激活后A級(jí)精子活力占比均為0，B級(jí)在2.27%～5.31%，C級(jí)在9.34%～13.91%,D級(jí)在80.78%～88.39%；濃度為10%、15%、20% DMSO作為抗凍劑，精子解凍激活后A級(jí)精子占比在0%～25.37%，B級(jí)在4.67%～19.46%，C級(jí)在24.91%～35.13%，D級(jí)在30.26%～60.20%，其中15%DMSO處理組中A級(jí)精子占比最高，為25.37%。不同抗凍劑處理中，鱘魚(yú)精子的運(yùn)動(dòng)參數(shù)DMSO顯著高于MeOH，10%DMSO處理組鱘魚(yú)精子的運(yùn)動(dòng)參數(shù)各指標(biāo)均顯著低于15%DMSO處理和20%DMSO處理，15%DMSO處理和20%DMSO處理間差異不顯著。綜上，西伯利亞鱘的精子超低溫冷凍保存抗凍劑以15%DMSO的抗凍效果最好。