荔波瑤山雞血管活性腸肽及其受體基因變異與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性

伍革民，朱麗莉，韓 雪，唐繼高

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005)

【研究意義】荔波瑤山雞原產(chǎn)于貴州省荔波縣，具有耐粗飼、抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)、飼料報(bào)酬高、肉質(zhì)鮮美細(xì)嫩等特點(diǎn)，是貴州地方雞生長發(fā)育較快的雞種之一。荔波瑤山雞年產(chǎn)蛋量90枚左右，就巢性強(qiáng)，散養(yǎng)就巢性達(dá)95%。經(jīng)筆者所在項(xiàng)目組經(jīng)過多個(gè)世代的常規(guī)選育，荔波瑤山雞產(chǎn)蛋量提高到110枚左右，但后期常規(guī)選育進(jìn)展緩慢，而探索關(guān)鍵基因標(biāo)記輔助選擇，可能成為荔波瑤山雞產(chǎn)蛋性能進(jìn)一步快速提高的一種有效途徑?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】血管活性腸肽(Vasoactive intestinal peptide,VIP)屬于胃泌素/分泌素/胰高血糖素家族的分泌型多肽，由28個(gè)氨基酸組成,并與有不同結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的G蛋白偶聯(lián)受體VIP受體1(VIPR-1)及VIP受體2(VIPR-2)結(jié)合。VIP/VIPR系統(tǒng)的激活可介導(dǎo)血管擴(kuò)張、血漿外滲、肥大細(xì)胞脫顆粒、免疫調(diào)節(jié)等多方面的生理過程[1]。在家禽繁殖周期調(diào)節(jié)中，VIP作用于垂體，通過其受體介導(dǎo)，與垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽參與下丘腦-垂體-性腺軸的相關(guān)功能，刺激和調(diào)控催乳素的分泌和釋放，調(diào)控家禽就巢行為和產(chǎn)蛋性能[2-3]。有研究表明，VIP、VIPR-1和VIPR-2基因多態(tài)性豐富，個(gè)別位點(diǎn)與雞就巢性、蛋形指數(shù)呈顯著或極顯著相關(guān)[3-7]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】探明VIP及VIP受體基因與荔波瑤山雞產(chǎn)蛋性能、就巢性的關(guān)聯(lián)情況，從數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)中選擇基因變異位點(diǎn)進(jìn)行PCR測序檢測并開展位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】找出可作為荔波瑤山雞繁殖性狀選育的重要標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用荔波瑤山雞為120日齡母雞，60只，由貴陽市烏當(dāng)區(qū)百宜鄉(xiāng)洛壩村種雞場提供，均采用常規(guī)飼養(yǎng)管理方式，個(gè)體籠養(yǎng)，群體一致性較好，性能穩(wěn)定。翅下靜脈采血1.0～1.5 mL，加EDTA-Na2抗凝，-20 ℃保存。

1.2 性狀測定

120 日齡母雞轉(zhuǎn)入產(chǎn)蛋舍單個(gè)籠養(yǎng)至300日齡，測定開產(chǎn)日齡、產(chǎn)蛋性能、就巢性等繁殖性狀，測定方法按照NY/T 823-2004[8]進(jìn)行。

1.3 基因組DNA提取及引物設(shè)計(jì)

采用TIANamp Blood DNA Kit試劑盒提取血樣DNA。VIP根據(jù)GenBank該基因7個(gè)外顯子和部分內(nèi)含子設(shè)計(jì)引物，VIPR-1和VIPR-2根據(jù)GenBank和文獻(xiàn)中的變異位點(diǎn)，在GenBank中在線設(shè)計(jì)引物，引物由天根生化科技有限公司合成。PCR檢測變異位點(diǎn)在荔波瑤山雞中的基因型遺傳變異情況。檢測的位點(diǎn)、引物序列、擴(kuò)增長度以及檢測方法見表1。

1.4 PCR擴(kuò)增及測序

PCR反應(yīng)體系：DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×TaqPCR MasterMix 試劑10 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性6 min；95 ℃變性30 s，特定溫度(表1)退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物委托諾賽基因組研究中心有限公司測序，即利用30只個(gè)體組成的混合DNA池作DNA模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序，分析序列多態(tài)性；針對(duì)存在多態(tài)位點(diǎn)的引物，逐一對(duì)60個(gè)樣本進(jìn)行單獨(dú)測序。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用DNAstar對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行校正，進(jìn)入基因庫網(wǎng)站采用BLAST分析序列SNPs，采用DNAMAN軟件分析SNPs變異導(dǎo)致蛋白質(zhì)編碼變異的情況。以Excel統(tǒng)計(jì)基因分型，利用SPSS 18.0采用單因子方差分析法分析基因型與繁殖性狀的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)位點(diǎn)和遺傳多樣性

從表2看出，VIP基因P4引物檢測出1個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，VIPR-1基因P6、P7、P8引物共檢測出16個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，VIPR-2基因P10、P11引物檢共測出3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。VIPR-1基因16個(gè)多態(tài)位點(diǎn)包括1個(gè)編碼區(qū)突變、1個(gè)10 bp(AAAATGTCTT)插入/缺失突變和14個(gè)內(nèi)含子替換突變；編碼突變位于VIPR-1基因68 817位置(mRNA 327位置，第4外顯子區(qū)域，T→C)，導(dǎo)致該蛋白質(zhì)第109個(gè)氨基酸纈氨酸發(fā)生同義突變(V：GUU→GUC)；10 bp(AAAATGTCTT)插入/缺失突變位于基因39 114位置，其余14個(gè)內(nèi)含子替換突變分布于第2和10內(nèi)含子中。VIPR-2基因3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，包括1個(gè)編碼區(qū)突變和2個(gè)內(nèi)含子替換突變；編碼區(qū)突變位于基因位置49 246(mRNA位置1050，第11外顯子，T→C)，導(dǎo)致第350個(gè)氨基酸脯氨酸發(fā)生同義突變(P：CCU→CCC)；內(nèi)含子突變分別位于第2內(nèi)含子基因位置3784(G→A)和基因位置3739(A→G)。另外，GenBank數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)，荔波瑤山雞VIPR-2基因序列相對(duì)于數(shù)據(jù)庫序列具有5個(gè)獨(dú)特的突變，分別為基因位置49 246(mRNA位置1050，第11外顯子，T→C)，導(dǎo)致該蛋白第350個(gè)氨基酸-脯氨酸發(fā)生同義突變(P：CCU→CCC)，基因位置49 248(mRNA位置1052，第11外顯子,A→G)以及基因位置49 249(mRNA位置1053，第11外顯子，C→G),2個(gè)變異位置位于同一密碼子內(nèi)，導(dǎo)致該蛋白質(zhì)第351個(gè)氨基酸發(fā)生錯(cuò)義突變(天冬氨酸D→甘氨酸G)(GAC→GGG)，基因位置49 388(mRNA位置1103，第12外顯子，G→A)，導(dǎo)致第371個(gè)氨基酸-亮氨酸發(fā)生同義突變(L：UUG→UUA)，以及基因位置3664和3665之間插入17 bp(AGAATAAAATAAGTAAA)的序列變異。

表2 荔波瑤山雞VIP及其受體基因的多態(tài)位點(diǎn)

2.2 多態(tài)位點(diǎn)與繁殖性狀的相關(guān)性

從表3可知,①VIP基因檢測出1個(gè)多態(tài)位點(diǎn)5010，但該位點(diǎn)各基因型間300日齡產(chǎn)蛋量及各就巢性狀差異均不顯著。②VIPR-1基因檢測出的16個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中，與300日齡產(chǎn)蛋量或就巢性狀顯著關(guān)聯(lián)的多態(tài)位點(diǎn)有6個(gè)。其中，位點(diǎn)39 109各基因型間差異顯著的性狀有開產(chǎn)日齡、首次就巢至重新開產(chǎn)間隔及300日齡就巢次數(shù)，差異極顯著的性狀有300日齡產(chǎn)蛋量和首次就巢日齡；位點(diǎn)39 114插入純合基因型300日齡產(chǎn)蛋量比插入雜合基因型、缺失純合基因型顯著降低，其余性狀間差異不顯著；位點(diǎn)39 227各基因型間300日齡產(chǎn)蛋量差異極顯著，基因型GG首次就巢持續(xù)時(shí)間顯著高于其他兩種基因型，基因型TT300日齡就巢次數(shù)顯著低于其他兩種基因型；位點(diǎn)68 817各基因型間，差異顯著的性狀有開產(chǎn)日齡、首次就巢至重新開產(chǎn)間隔及首次就巢持續(xù)時(shí)間，差異極顯著的性狀有300日齡產(chǎn)蛋量、首次就巢日齡和300日齡就巢次數(shù)；位點(diǎn)69 061各基因型間差異顯著的性狀有300日齡產(chǎn)蛋量和首次就巢日齡，差異極顯著的性狀是300日齡就巢次數(shù)；位點(diǎn)97 123各基因型間差異顯著的性狀有首次就巢持續(xù)時(shí)間，差異極顯著的性狀有300日齡產(chǎn)蛋量、首次就巢日齡、首次就巢至重新開產(chǎn)間隔和300日齡就巢次數(shù)。③VIPR-2基因檢測出的3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)3739、3184、49 246各基因型間300日齡產(chǎn)蛋量呈顯著或極顯著相關(guān)，位點(diǎn)3739和位點(diǎn)49 246各基因型間首次就巢持續(xù)時(shí)間、首次就巢至重新開產(chǎn)間隔呈顯著或極顯著相關(guān)。

表3 VIP及其受體基因多態(tài)位點(diǎn)與繁殖性狀的相關(guān)性

3 討 論

雞VIP基因定位于3號(hào)染色體上，包括7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子。VIP的mRNA目前發(fā)現(xiàn)有2種轉(zhuǎn)錄本，轉(zhuǎn)錄本1轉(zhuǎn)錄了所有1個(gè)外顯子，編碼200個(gè)氨基酸，而轉(zhuǎn)錄本2比轉(zhuǎn)錄本1少外顯子4的拼接，編碼165個(gè)氨基酸[9]。周敏等[10]研究發(fā)現(xiàn)，江西寧都三黃雞VIP基因4個(gè)SNP突變位點(diǎn)與不同日齡的雞冠高度存在極顯著或一定程度的相關(guān)；黃孫平等[11]研究表明，四明香雞B系VIP基因A-3458G位點(diǎn)各基因型間65周體重差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，與產(chǎn)蛋量相關(guān)不顯著。杜穎軍[12]發(fā)現(xiàn)，5′-UTR的3個(gè)突變(A-1784G、-2648-2650缺失和C-3143T)和1個(gè)外顯子突變(G+780T)4個(gè)位點(diǎn)均與雞的繁殖性狀相關(guān)。ZHOU等[13]研究發(fā)現(xiàn)，寧都三黃雞-2648-2650缺失顯著影響90～300日齡產(chǎn)蛋量、C+338T對(duì)就巢持續(xù)時(shí)間影響顯著。楊恒[5]研究發(fā)現(xiàn)，欣華雞E系VIP基因5′-UTR存在1個(gè)顯著影響蛋形指數(shù)的位點(diǎn)A-3458G。本研究重點(diǎn)篩查荔波瑤山雞VIP基因7個(gè)外顯子區(qū)域的突變，引物圍繞7個(gè)外顯子設(shè)計(jì)，結(jié)果表明，在荔波瑤山雞檢測到的7個(gè)外顯子區(qū)域均未發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)，僅在第6內(nèi)含子(基因5010位置)發(fā)現(xiàn)1個(gè)多態(tài)位點(diǎn)C→A，但各基因型間產(chǎn)蛋量及就巢性狀均差異不顯著，這與以上研究結(jié)果不太一致，可能與雞品種有關(guān)。另外，試驗(yàn)中沒有檢測到的其他內(nèi)含子區(qū)域是否存在影響荔波瑤山雞繁殖性狀的多態(tài)位點(diǎn)還有待進(jìn)一步研究。

VIPR-1是一種與G蛋白偶聯(lián)的7次跨膜糖蛋白，屬于促胰泌素/VIP受體亞族[14]。雞VIPR-1基因定位于 2號(hào)染色體短臂(2p3.2)，全長104 263 bp，包括13個(gè)外顯子，12個(gè)內(nèi)含子[15]。ZHOU等[16]以寧都三黃雞第4代群體進(jìn)行標(biāo)記與就巢性的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，位點(diǎn)C+598T與C+53327T對(duì)寧都三黃雞的就巢行為有顯著影響(P<0.05)。周敏等[6]通過對(duì)VIPR-1基因5′(-496～-1 bp)調(diào)控區(qū)多態(tài)性與清遠(yuǎn)麻雞就巢性狀的相關(guān)性研究結(jié)果表明，VIPR-1基因G-359T、G-266T、A-134-、A-94G、C-72G突變與18～43周齡就巢持續(xù)天數(shù)顯著相關(guān)，且A-94G突變還與雞就巢率顯著相關(guān)，12個(gè)多態(tài)位點(diǎn)構(gòu)成的單倍型與就巢持續(xù)天數(shù)極顯著相關(guān)。周敏等[17]研究發(fā)現(xiàn)，位于內(nèi)含子6的位點(diǎn)C+42913T與寧都三黃雞300日齡總產(chǎn)蛋數(shù)和300日齡的總正常蛋數(shù)顯著相關(guān)(P<0.05)，與清遠(yuǎn)麻雞40周齡、43周齡以及54周齡的總產(chǎn)蛋數(shù)和總正常蛋數(shù)顯著相關(guān)(P<0.05)。內(nèi)含子8的位點(diǎn)C+53327T與寧都三黃雞開產(chǎn)日齡極顯著相關(guān)(P<0.01)、與300日齡就巢持續(xù)天數(shù)呈顯著相關(guān)(P<0.05)。以雞VIPR-1基因作為雞冠高度和體重的候選基因，周敏等[18]選取了12個(gè)多態(tài)位點(diǎn)對(duì)586只寧都三黃雞進(jìn)行基因型檢測并分析其與這2個(gè)性狀的相關(guān)性研究表明，位于內(nèi)含子2的位點(diǎn)C+598T與84日齡體重顯著相關(guān)(P<0.05)；位于內(nèi)含子8的位點(diǎn)C+53327T與77日齡體重和 91日齡體重呈極顯著相關(guān)(P<0.01)，但此12個(gè)位點(diǎn)與不同日齡的雞冠高度不相關(guān)。趙振華[19]研究表明，VIPR-1基因C73352T突變位點(diǎn)，TT基因型個(gè)體冠高、冠面積和肉垂面積顯著大于CC基因型個(gè)體(P<0.05)，T68818C位點(diǎn)各基因型個(gè)體間冠高、冠面積和肉垂面積差異顯著(P<0.05)。

VIPR-1基因DNA序列全長104 263 bp，該基因外顯子短，內(nèi)含子序列很長，對(duì)全基因測序耗費(fèi)高，從文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫中檢索SNP及缺失/插入突變，共檢索到該基因1210個(gè)變異位點(diǎn)，說明該基因序列多態(tài)性豐富，但大部分變異位點(diǎn)位于內(nèi)含子區(qū)域。本研究針對(duì)荔波瑤山雞該基因的調(diào)控區(qū)、外顯子及插入/缺失突變檢測出16個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，其中6個(gè)位點(diǎn)與300日齡產(chǎn)蛋量或就巢性狀顯著關(guān)聯(lián)，6個(gè)位點(diǎn)包括位于內(nèi)含子2區(qū)域的39 109、39 114、39 227位點(diǎn)，外顯子4區(qū)域的68 817位點(diǎn)以及內(nèi)含子4區(qū)域的69 061、97 123位點(diǎn)。外顯子4的68 817位點(diǎn)T→C變異，導(dǎo)致該蛋白質(zhì)第109個(gè)氨基酸-纈氨酸發(fā)生同義突變(V：GUU→GUC)；趙振華[19]研究表明，該同義突變位點(diǎn)與雞冠高、冠面積和肉垂面積顯著相關(guān)；本研究發(fā)現(xiàn)，該同義突變與荔波瑤山雞的300日齡產(chǎn)蛋量、開產(chǎn)日齡、就巢性狀呈顯著或極顯著相關(guān)，說明該基因位點(diǎn)可以作為雞的繁殖性狀選育標(biāo)記，用于雞的輔助選育。設(shè)計(jì)引物P4是為檢測出NCBI數(shù)據(jù)庫查詢到的39 114位點(diǎn)的10 bp(AAAATGTCTT)插入/缺失突變，在荔波瑤山雞中檢測到了該變異位點(diǎn)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)插入純合基因型300日齡產(chǎn)蛋量顯著降低；另外，利用該引物還檢測到了位于該插入/缺失位點(diǎn)兩側(cè)的新變異位點(diǎn)39 109和39 227與產(chǎn)蛋量或就巢性狀顯著相關(guān)。上述位點(diǎn)可用于荔波瑤山雞繁殖性狀的輔助選育。

VIPR-2基因位于雞2號(hào)染色體上，DNA序列全長50 748 bp，包括13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子，對(duì)該基因與雞繁殖性狀的關(guān)聯(lián)研究相對(duì)較少。趙振華[19]研究表明，VIPR-2基因A36127G位點(diǎn)GG基因型個(gè)體冠高、冠面積和肉垂面積顯著大于AA和AG基因型個(gè)體(P<0.05)。從數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)中共檢索到該基因變異位點(diǎn)655個(gè)，說明該基因變異多態(tài)性豐富。本研究表明，荔波瑤山雞VIPR-2基因檢測到3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，包括1個(gè)編碼區(qū)突變和2個(gè)內(nèi)含子替換突變。研究還發(fā)現(xiàn)，荔波瑤山雞品種相對(duì)于數(shù)據(jù)庫序列獨(dú)特的變異位點(diǎn)5個(gè)，包括4個(gè)編碼區(qū)變異和1個(gè)17 bp(AGAATAAAATAAGTAAA)插入突變。4個(gè)編碼區(qū)變異分別導(dǎo)致該基因編碼蛋白質(zhì)第350個(gè)氨基酸發(fā)生同義突變(脯氨酸P：CCU→CCC)、第351個(gè)氨基酸發(fā)生錯(cuò)義突變(天冬氨酸D→甘氨酸G，GAC→GGG)以及第371個(gè)氨基酸發(fā)生同義突變(亮氨酸 L：UUG→UUA)，這些變異可能是荔波瑤山雞的品種特征，其功能情況有待進(jìn)一步分析。關(guān)聯(lián)分析表明，檢測到的荔波瑤山雞VIPR-2基因的3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)3739、3184、49 246各基因型間300日齡產(chǎn)蛋量或就巢性狀呈顯著或極顯著相關(guān)，這些位點(diǎn)可作為荔波瑤山雞繁殖性狀選育的標(biāo)記開展進(jìn)一步研究分析。

4 結(jié) 論

荔波瑤山雞VIP及其受體VIPR-1和VIPR-2共檢測20個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。VIP基因檢測的范圍廣，包括所有外顯子區(qū)域及部分內(nèi)含子區(qū)域，但變異少，僅檢測到1個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，且該多態(tài)位點(diǎn)與產(chǎn)蛋和就巢性狀均無顯著關(guān)聯(lián)。VIP受體基因VIPR-1和VIPR-2僅對(duì)其部分區(qū)域進(jìn)行選擇性檢測，但檢測到的位點(diǎn)多態(tài)性豐富，VIPR-1檢測到16個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，VIPR-2檢測到3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，另外VIPR-2檢測到5處品種獨(dú)特突變。VIPR-1的6個(gè)多態(tài)位點(diǎn)以及VIPR-2的3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與產(chǎn)蛋量、就巢性狀呈顯著或極顯著關(guān)聯(lián)。說明，VIP受體基因VIPR-1和VIPR-2可作為荔波瑤山雞繁殖性狀選育的候選基因，該結(jié)果為利用分子標(biāo)記輔助選擇提高荔波瑤山雞的繁殖性能奠定一定的基礎(chǔ)。